技术领域
本发明涉及微藻细胞检测分析技术领域，更具体地，涉及一种海洋微藻胞内代谢组的检测分析方法。
背景技术
有害藻类爆发(HAB)是一个全球性的海洋环境问题，导致了海洋生态环境的破坏和渔业损失，直接造成严重的经济损失和间接次生环境灾害，此外，大部分藻类产生的有害藻毒素会直接或间接对人类产生危害。因此，有害藻类的控制已经逐渐成为各个沿海国家环境治理的热点。
近年来，利用生物法对藻类进行治理已成为一个热点，其原理是利用海洋环境中存在的浮游生物之间的相互作用来直接或间接影响藻类的繁殖，从而减少赤潮爆发的风险。因此分析检测藻细胞的代谢组可以深入洞察藻类在浮游生物应激下所发生的代谢反应，从代谢组学的角度阐述藻类的响应机制，为分析海洋浮游生物的相互作用机制和分离、研发高效的杀藻海洋浮游生物提供重要的参考意义。但是微藻的种类繁多，目前运用在微藻的代谢组分析方法比较少，大多集中在铜绿微囊藻、小球藻和莱茵衣藻等模式藻种上。中国专利申请，公开号为：CN102495152B公开了一种分析微藻代谢组的方法，该公开的技术方案存在着检测时间长、检测效率不高的问题。
发明内容
本发明为克服上述现有技术中微藻的代谢分析检测技术中检测时间长、检测效率不高的问题，提供一种海洋微藻胞内代谢组的检测分析方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种海洋微藻胞内代谢组的检测分析方法，包括以下步骤：
(1)微藻的收集和破碎；
取出已培养好的微藻液3-5份，每份40-60mL，放置于离心管中，然后放入液氮中淬灭3-5min，冻融后在5000-6000rpm，3-4℃条件下离心分离3-5min，去除上清培养基，收集微藻细胞；然后将微藻细胞重悬于去离子水中进行破碎，在冰浴中使用破碎仪进行超声破碎；
(2)提取胞内代谢物；
破碎后的微藻细胞立即放入冰浴中进行保存，采用溶剂萃取法对胞内代谢物进行提取：在收集微藻细胞碎片的离心管中加入甲醇，再加入氯仿,使得离心管中的甲醇、水、氯仿的比例为2.5:(1-1.5):(0.5-1)，随后放入涡旋机中涡旋8-10秒钟，后置于冷冻离心机中在1000-1200rpm，3-4℃条件下离心分离8-10min，收集上清液，并加入水杨酸作为内标，在真空冷冻机中干燥2-4h；
(3)胞内代谢物的衍生化；
向干燥后的样品中加入甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液，在50-60℃水浴中反应80-90min，随后加入N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)、三氟乙酰胺(MSTFA)，在50-60℃水浴中继续反应25-30min，随后加入正己烷定容，在10000-12000rpm，3-4℃条件下离心1-2min，收集上清液于气质进样瓶中，置于-24℃至-20℃冰箱中保存；
(4)上机前将气质进样瓶中的样品置于室温下1.5-2h，采用气相色谱-质谱法对上述样品进行代谢物定量定性分析。
优选地，在所述步骤(1)中，在对微藻细胞进行破碎之前，将微藻细胞重悬于去离子水中一至两次。
优选地，所用检测条件如下：
色谱柱型号规格：TG-5Ms，30.00m*0.25mm，0.25μm；
进样方式：不分流进样；
GC模块：
1)柱箱温度：70℃；
2)进样口温度：230℃；
3)进样方式：不分流；
4)进样时间：1min；
5)载气：He；
6)压力：72.8kPa；
7)总流量30.0mL/min；
8)柱流量：1mL/min；
9)进样体积：1微升；
10)柱箱升温程序：70℃保持3min，以1℃/min上升到76℃保持1分钟，以10℃/min上升到320℃保持5min；
MS模块：
1)离子源温度：220℃；
2)溶剂延迟时间4min；
3)接口温度：230℃；
4)扫描范围50-500m/z；
5)扫描速度：0.2scan/s。
优选地，在所述步骤(1)中，在冰浴中使用细胞破碎仪进行超声破碎，每破碎6秒钟，停止6秒钟，持续破碎30min。
优选地，在所述步骤(1)中，取出已培养好的微藻液中的微藻处于对数增长末期。
优选地，在所述步骤(1)中，冻融后进行离心的条件为6000rpm，4℃，离心时间为5min。
优选地，在所述步骤(1)中，在液氮中淬灭时间为5min。
优选地，在所述步骤(2)中，装有微藻细胞碎片的离心管在涡旋机中涡旋的时间为10秒钟。
优选地，在步骤(3)中，两次水浴的温度均为60℃，第一次水浴的反应时间为90min，第二水浴的反应时间为30min。
优选地，在步骤(4)中，上机前将气质进样瓶中的样品置于室温下2h。
与现有技术相比，有益效果是：本发明涉及到代谢物的提取、衍生化和分析检测，具备完整的代谢实验方案和便捷化的实验操作。各代谢物组分含量由对应的峰面积和内标物的峰面积的比值求得，代谢物的定性由GC-MS内置谱库NIST匹配测得。本发明的检测分析方法在3-5小时内就能完成样品的制取，且过程无需冻干细胞，极大缩短了样品制取的时间，提高检测效率。此外，检测过程中采用的试剂均为常规有机溶剂和衍生试剂，成本较低，适合进行多样品的定量和定性。
附图说明
图1为代谢物气相色谱分离图。
具体实施方式
附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制；为了更好说明本实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。附图中描述位置关系仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制。
本发明实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”“长”“短”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体描述：
实施例1
一种海洋微藻胞内代谢组的检测分析方法，包括如下步骤：
(1)赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)细胞的收集和破碎：
取240毫升基于对数增长末期的赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)，分成6份于50mL的离心管中，放入液氮中淬灭5分钟，防止藻类在前处理过程中产生代谢反应，冻融后在6000rpm，4℃下离心分离5分钟，去除上清培养基，收集藻细胞(鲜重25-75mg)，为了防止微藻胞外分泌代谢物和培养基对胞内代谢物的干扰，将微藻细胞重悬于去离子水中，重复上述方法一至两次。收集完全后的藻细胞重悬于2mL去离子水中进行破碎，在冰浴中使用细胞破碎仪进行超声破碎，每破碎6秒钟，停止6秒钟，持续三十分钟，以确保藻细胞完全破碎。
(2)提取胞内代谢物
破碎后的藻细胞立即放入冰浴中进行保存，对于胞内代谢物的提取，采用溶剂萃取法进行：在收集藻细胞碎片的离心管中加入甲醇5mL,再加入氯仿1mL,使得离心管中的甲醇、水、氯仿的比例为2.5:1:0.5，随后放入涡旋机中涡旋10秒钟，后置于冷冻离心机中以12000rpm，4℃下离心分离10分钟，收集上清液，并加入10μL水杨酸作为内标，在真空冷冻机中干燥3小时；
(3)胞内代谢物衍生化
向干燥后的样品中加入100μL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液(10g/L)，在60℃水浴中反应90min，随后加入120μL N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)、三氟乙酰胺(MSTFA)，在60℃水浴中继续反应30min，随后加入1mL正己烷定容，在12000rpm，4℃下离心1min，收集上清液于气质进样瓶中，置于-20℃冰箱中保存；
(4)GC-MS检测分析
上机前将样品置于室温下2h。采用气相色谱-质谱法对上述样品进行代谢物定量定性分析，所用检测条件如下：
色谱柱型号规格：TG-5Ms，30.00m*0.25mm，0.25μm；
进样方式：不分流进样；
GC模块：
1)柱箱温度：70℃；2)进样口温度：230℃；3)进样方式：不分流；4)进样时间：1min；5)载气：He；6)压力：72.8kPa；7)总流量30.0mL/min；8)柱流量：1mL/min；9)进样体积：1微升；10)柱箱升温程序：70℃保持3min，以1℃/min上升到76℃保持1分钟，以10℃/min上升到320℃保持5min。
MS模块：
1)离子源温度：220℃；2)溶剂延迟时间4min；3)接口温度：230℃；4)扫描范围50-500m/z；5)扫描速度：0.2scan/s。
(5)实验结果
表一为代谢物鉴定表
图1为代谢物气相色谱分离图，由图可以看出由本发明而检测出GC谱图基线平稳、代谢物分离均匀。如表一和图一所示，通过本发明所鉴定出来的代谢物共有105种，涉及到氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、脂质代谢、核苷酸代谢聚糖合成代谢等；其中氨基酸类15种、糖类12种、有机酸类8种、脂质9种、醇类5种及其他。
实施例2
与实施例1不同之处在于步骤(1)、(2)与步骤(3)中具体的参数设置，具体地，
在步骤(1)中，取240毫升基于对数增长末期的赤潮异弯藻(Heterosigmaakashiwo)，分成6份于50mL的离心管中，放入液氮中淬灭5分钟，防止藻类在前处理过程中产生代谢反应，冻融后在5000rpm，3℃下离心分离3分钟。
在步骤(2)中，离心管中的甲醇、水、氯仿的比例为2.5:1.5:1，随后放入涡旋机中涡旋10秒钟，后置于冷冻离心机中以10000rpm，3℃下离心分离8分钟，收集上清液，并加入10μL水杨酸作为内标，在真空冷冻机中干燥3小时。
在步骤(3)中，向干燥后的样品中加入100μL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液(10g/L)，在50℃水浴中反应80min，随后加入120μL N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)、三氟乙酰胺(MSTFA)，在50℃水浴中继续反应25min，随后加入1mL正己烷定容，在10000rpm，3℃下离心2min，收集上清液于气质进样瓶中，置于-24℃冰箱中保存。
实施例3
与实施例1不同之处在于步骤(1)、(2)与步骤(3)中具体的参数设置，具体地，
在步骤(1)中，取240毫升基于对数增长末期的赤潮异弯藻(Heterosigmaakashiwo)，分成6份于50mL的离心管中，放入液氮中淬灭4分钟，防止藻类在前处理过程中产生代谢反应，冻融后在6000rpm，3℃下离心分离4分钟。
在步骤(2)中，离心管中的甲醇、水、氯仿的比例为2.5:1.2:0.8，随后放入涡旋机中涡旋9秒钟，后置于冷冻离心机中以1100rpm，3℃下离心分离8分钟，收集上清液，并加入10μL水杨酸作为内标，在真空冷冻机中干燥3小时。
在步骤(3)中，向干燥后的样品中加入100μL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液(10g/L)，在55℃水浴中反应80min，随后加入120μL N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)、三氟乙酰胺(MSTFA)，在50℃水浴中继续反应30min，随后加入1mL正己烷定容，在12000rpm，4℃下离心2min，收集上清液于气质进样瓶中，置于-22℃冰箱中保存。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
机译： 核酸，DNA片段和分子，活重组载体，宿主细胞，胞内劳顿菌蛋白，用于抵抗胞内劳顿菌感染的疫苗，疫苗的制备方法以及针对胞内劳顿菌和胞内劳顿菌抗原性材料的抗体检测的诊断测试
机译： 用于检测丁香假单胞菌PV的引物组。丘疹，苹果水疱斑点的病因和检测假单胞菌丁香假单胞菌的方法。丘疹使用引物组
机译： 用于检测丁香假单胞菌的引物组pv。 persicae核果中细菌死皮的病原体和检测丁香假单胞菌光伏的方法。 persicae使用引物组
