桑枝木段栽培桑黄的方法

技术领域

本发明属于食用菌栽培技术领域，尤其涉及一种桑枝木段栽培桑黄的方法。

背景技术

蚕桑产业是我国的传统产业，也是一个可持续发展的产业，目前正实现从传统“一粒茧”、“一根丝”的单一产业向“一片桑园”、“一系列资源”的多元化发展模式跨越。利用丰富的桑枝资源栽培食用菌，不但结合了现代科学技术和循环低碳经济理念的发展方向，同时也促进蚕桑产业的可持续发展，延长了产业链。

桑黄(Phellinus baumii Pilat.)属真菌界(Kingdom Fungi)担子菌门(Basidiomy-cota)的一种传统药用蕈菌，作为中药用于治疗已具有2 000多年的历史，《神农本草经》，明代《本草纲目》中就记载有桑黄“利五脏，宣肠胃气，排毒气”等药用功效；还可用于治疗血淋、血崩、脱肛泻血、带下、经闭、脾虚泄泻等症状。现代医学也证实了桑黄富含多糖、黄酮类、萜类等活性物质，具有于调节机体免疫、延缓衰老、抗肿瘤、保肝护肝、降血糖、抗炎症等功效。桑黄菌在自然界中，多寄生于桑、杨、柳等阔叶树的枯立木和立木树干上，因其寄生的树种不同，桑黄子实体的形状、颜色以及含有的成份而有不同，其中以寄生在桑树上的桑黄含有总酚、总黄酮、多糖含量最高，以及抗氧化能力、抑制肿瘤细胞生长能力最佳，药用价值最高。

我国野生的桑黄资源非常稀少，生长周期长，在外界环境中受影响较大，也难以满足市场的大量需求，因此，通过人工栽培实现桑黄的规模化种植是目前生产企业发展的方向。然而，市场上主要是以袋料生产桑黄为主，生产周期短，成分含量低，药用价值不高。虽然也有关于木段栽培桑黄具体报道，但主要是以柞木栽培为主，其药用成分还是和在桑枝上栽培的桑黄有所差别，而真正寄生在桑树上的桑黄，其多糖、黄酮、三帖等成份含量高，对于增强人体免疫力，抗肿瘤等具有明显的效果。

中国专利“一种桑黄原生态仿野生栽培方法”(专利号201310558787.9公开日2014年02月26日)公开了在活桑树上接种获得了桑黄的方法，但是方法复杂，不易批量操作，受环境污染影响大，难予规模化生产。

中国专利“一种野生桑黄仿生境扩繁方法”(专利号201810217706.1公开日2018年08月28日)采用15年以上的桑树树墩为培养基再进行注射接种，每15天注射一次，一直注射到采收。该法原料采集难度大，15年以上的桑树树墩较少，同时操作方法比较复杂难予规模化生产。

中国专利“桑黄培养基质优化及短段木栽培方法”(专利号201410056197.0公开日2014年05月21日)通过改善母种和原种的培养基，并利用柞木段加木屑等辅料作为栽培种的培养基接种桑黄菌培养出桑黄。该法虽然实现了桑黄的批量生产，但仍以柞木为基质，其药用成分和药效预期难与真正寄生在桑树上的桑黄相比。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种桑枝木段栽培桑黄的方法，该法实现了桑枝的资源化利用，同时提高了野生桑黄扩繁速度，保证了桑黄的药用价值。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

桑黄培养基，含有桑枝多糖。

上述桑黄培养基，为母种培养基或活化培养基；

母种培养基配方按重量份为：马铃薯淀粉200-300份，葡萄糖15-20份，磷酸二氢钾0.5-1份，硫酸镁0.5-0.75份，琼脂粉3-5份，玉米粉3-5份，桑枝多糖提取液2-3份，水1000份；

活化培养基配方按重量份为：新鲜马铃薯200-300份，葡萄糖12-15份，磷酸二氢钾0.5-1份，硫酸镁0.5-0.75份，琼脂粉3-5份，桑枝多糖提取液3-5份，水1000份。

桑枝多糖提取液按以下操作进行制备：采用800-1000份干桑枝，切片粉碎成60-80目的桑枝粉，采用超声波结合水提法提取桑枝粗多糖，制得桑枝多糖提取液。

超声波结合水提法中，超声提取时间为25-30min，温度30℃，料液比1:50，循环提取2次，在4℃下以4000rmp/min冷冻离心，即得。

桑枝木段栽培桑黄的方法，在母种培养基与活化培养基中添加桑枝多糖，利用桑枝木段做为桑黄栽培种的培养基质，出黄前进行冷藏的温差刺激以及控制调节培养子实体膨大期的温湿度条件。

上述桑枝木段栽培桑黄的方法，包括以下步骤：

<1>母种培养；<2>母种活化；<3>原种扩繁；

<4>桑枝木段培养(栽培种培养)；<5>子实体培养。

步骤<1>按以下进行操作：从野生桑黄菌株中获得母种进行分离纯化后培养于斜面试管中，培养基采用权利要求2的母种培养基；培养条件为：在培养温度为25-28℃，培养湿度为50-60％的条件下进行暗培养，培养时间为10-15d，待菌丝长满斜面即可置于4-5℃冰箱内冷藏保存；

步骤<2>按以下进行操作：取斜面试管的桑黄菌种按接种面积为0.5-1cm

步骤<3>按以下进行操作：将已活化的桑黄母种接种到原种袋料培养基中进行原种扩繁，培养配方按重量百分数为：桑枝木屑20-30％，杂木屑30-40％，麦麸30-40％，黄豆粉5-8％，石灰1％，石膏1％；培养条件为：在培养温度为26-28℃，培养湿度为50-60％的条件下进行暗培养，培养时间为15-20d，待菌丝长满菌袋即可接种于桑枝木段培养基上。

步骤<4>按以下进行操作：

桑枝木段培养基制备：取直径为10-15cm四年树龄以上的桑枝树段，截成每段长20-25cm，从树段的一头劈成四份，保证树皮不脱落；把劈好的木块浸泡于70％的甲基托布津液800倍液中10-15min，取出后再浸泡入10％白糖水中20-30min，最后取出沥干拼成4-6块装入规格为17×33cm或20×33cm的食用菌袋中；

接种：将扩繁好的原种接入已灭菌并冷却到常温的桑枝木段培养基中，木段周围和底部都接有原种，主要集中接种于木段的一头，以高出并覆盖完木头2cm的接种量为宜；

菌丝培养：接种好的桑枝木段置于培养温度为26-28℃，湿度为50-60％的条件下进行暗培养，培养时间为40-50d，此时菌丝长满菌袋，颜色由浅黄色变为深黄色。

步骤<5>按以下进行操作：

温差刺激：把长满菌丝的桑枝木段置于温度4℃冰箱中4-5d，取出后置于温度为26-29℃，湿度60％条件下暗培养2d；

出黄培养初期：取经过温差刺激的桑枝木段，在其中上部两侧分别错开用刀砍出两道口，刀口长约8-10cm，深1-2cm，用黑袋子罩住，培养条件为26-29℃，湿度为70-80％，培养为5-7d，期间注意通风透气，待刀口长出原基时掀开黑袋子；

子实体生长期：长出原基的桑黄进入生长膨大期，此时培养温度为25-29℃，湿度为85-95％，散射光，保持通风透气。

针对目前桑黄栽培存在的问题，发明人巧妙地利用废弃桑枝研制了一种桑黄培养基，其中含有桑枝多糖。研究表明，通过在母种培养基与活化培养基中添加桑枝多糖液，可成功提高桑黄菌种中多糖的含量，为提高桑黄的药用价值奠定了技术基础。据此，发明人还建立了一种桑枝木段栽培桑黄的方法，在母种培养基与活化培养基中添加桑枝多糖，利用桑枝木段做为桑黄栽培种的培养基质，出黄前进行冷藏的温差刺激以及控制调节培养子实体膨大期的温湿度条件。该法能快速促进桑黄原基的形成，有效缩短桑枝桑黄子实体的培养周期。总之，本发明解决了桑黄从母种培养到原种培养以及栽培种培养的一系列技术问题，一方面，利用桑枝作为桑黄栽培种的培养基质，可为桑黄菌种提供充足的营养成分和活性成分，缩短菌丝生长的周期，提高了野生桑黄扩繁速度，延长采收周期，保证桑黄的营养成分，提高桑黄的药用价值；另一方面，充分地利用了秋冬季节砍伐的丰富桑枝资源，开拓了蚕桑产业的资源多元化利用，解决了桑枝污染环境问题，促进了蚕桑可持续发展。此外，本发明拓宽了桑黄的栽培途径，且操作简便、经济高效，适应规模工厂化生产，为人工栽培生产真正的桑黄提供了技术支撑，极具市场开发前景。

附图说明

图1是本发明中母种培养基培养的桑黄菌丝。

图2是本发明中活化培养基对桑黄菌丝生长影响的结果图。

图3是本发明中原种培养基培养桑黄原种的照片。

图4是本发明中桑枝木段培养桑黄一个星期的生长情况。

图5是本发明中桑枝木段培养45天后的生长情况。

图6是本发明中桑枝木段桑黄开口期出黄和原基突起期的情况，图中：a是切口5天出黄的照片，b是出黄15天原基突起的照片。

图7是本发明中桑枝木段桑黄生长膨大期，图中：a是出黄20天的照片，b是出黄30天的照片。

具体实施方式

实验例1

(1)桑枝多糖提取液的制备：采用1000份干桑枝，切片粉碎成60目的桑枝粉，采用超声波结合水提法提取桑枝粗多糖，超声提取时间为30min，温度30℃，料液比1:50，循环提取2次，在4℃下以4000rmp/min冷冻离心制得桑枝多糖提取液。

(2)母种培养：从野生桑黄菌株中获得母种进行分离纯化后培养于斜面试管中，培养基配方按重量份为：马铃薯淀粉200份，葡萄糖15份，磷酸二氢钾0.5份，硫酸镁0.5份，琼脂粉3份，玉米粉3份，桑枝多糖提取液2份，水1000份。在培养温度为26℃，培养湿度为55％的条件下进行暗培养，培养时间为10d，待菌丝长满斜面即可置于4℃冰箱内冷藏保存。

(3)母种活化：取斜面试管的桑黄菌种按接种面积为1cm

(4)原种扩繁：将已活化的桑黄母种接种到原种袋料培养基中进行原种扩繁，培养配方按重量百分数为：桑枝木屑25％，杂木屑35％，麦麸30％，黄豆粉8％，石灰1％，石膏1％。在培养温度为27℃，培养湿度为60％的条件下进行暗培养，培养时间为20d，待菌丝长满菌袋即可接种于桑枝木段培养基上。

(5)桑枝木段培养(栽培种培养)

桑枝木段培养基制备：取直径为12cm四年树龄以上的桑枝树段，截成每段长20cm，从树段的一头劈成四份，保证树皮不脱落。把劈好的木块浸泡于70％的甲基托布津液800倍液中10min，取出后再浸泡入10％白糖水中20min，最后取出沥干拼成4块装入规格为17×33cm的食用菌袋中。

高压灭菌：装好袋的桑枝木段培养基置于高压灭菌锅内，灭菌温度为121℃，压力为0.11Pa，灭菌时间为6h。

接种：将扩繁好的原种接入已灭菌并冷却到常温的桑枝木段培养基中，木段周围和底部都接有原种，主要集中接种于木段的一头，以高出并覆盖完木头2cm的接种量为宜。

菌丝培养：接种好的桑枝木段置于培养温度为28℃，湿度为55％的条件下进行暗培养，培养时间为45d，此时菌丝长满菌袋，颜色由浅黄色变为深黄色。

(6)子实体培养

温差刺激：把长满菌丝的桑枝木段置于温度4℃冰箱中4d，取出后置于温度为29℃，湿度60％条件下暗培养2d。

出黄培养初期：取经过温差刺激的桑枝木段，在其中上部两侧分别错开用刀砍出两道口，刀口长约8cm，深1cm。用黑袋子罩住，初期培养温度为29℃，湿度为80％，培养5d后，期间每天通风透气4次，待刀口长出黄色原基时掀开黑袋子。

子实体生长期：长出原基的桑黄进入生长膨大期，此时培养温度为28℃，湿度为90％，散射光，每天保持通风透气4次。

(7)采收期

桑枝木段培养的桑黄子实体的生长期比较缓慢，因此每一年的子实体还不宜采收，到2-3年生左右子实体由黄转深黄色成熟时可进行采收，第2年采收的子实体干重达50g，第2年采收后的桑枝木段仍可继续长出子实体。第3年采收的子实体干重可达100g。

实验例2

母种培养和母种活化同实验例1，不同之处在于：1.斜面试管培养基配方不同：马铃薯淀粉200份，葡萄糖20份，磷酸二氢钾1份，硫酸镁0.5份，琼脂粉5份，玉米粉4份，桑枝多糖提取液3份，水1000份。2.母种活化的培养基配方不同：新鲜马铃薯250份，葡萄糖12份，磷酸二氢钾1份，硫酸镁0.5份，琼脂粉3份，桑枝多糖提取液3份，水1000份。3.原种扩繁的配方不同：桑枝木屑20％，杂木屑40％，麦麸30％，黄豆粉8％，石灰1％，石膏1％。4.桑枝木段培养中接种的桑枝直径不同，为14cm，高压灭菌时间为7h。5.子实体培养期间，刀口长约10cm，深1.5cm。

实验例3

母种培养和母种活化同实验例1，不同之处在于：1.斜面试管培养基配方不同：马铃薯淀粉300份，葡萄糖15份，磷酸二氢钾0.5份，硫酸镁0.5份，琼脂粉3份，玉米粉5份，桑枝多糖提取液2份，水1000份。2.母种活化的培养基配方不同：新鲜马铃薯300份，葡萄糖15份，磷酸二氢钾0.5份，硫酸镁0.5份，琼脂粉5份，桑枝多糖提取液5份，水1000份。3.原种扩繁的配方不同：桑枝木屑30％，杂木屑30％，麦麸35％，黄豆粉3％，石灰1％，石膏1％。4.桑枝木段培养中接种的桑枝直径不同，为15cm，高压灭菌时间为8h。5.子实体培养期间，刀口长约8cm，深1.5cm。

斜面试管桑黄菌丝生长情况

如图1所示，使用改良过的马铃薯淀粉培养基按不同的配比培养桑黄母种，其菌丝长势旺盛，浓密，色泽呈黄色。

桑黄母种活化培养菌丝生长情况

将斜面试管培养的菌种按直径为1cm分别接种于6种不同的碳源培养基中，确定桑黄菌丝最佳的活化培养基配方：改良的新鲜马铃薯培养基(本发明中添加了5份桑枝多糖提取液<实施例3中配方>)、玉米淀粉培养基、2％蔗糖培养基、可溶性淀粉培养基、糊精培养基、以PDA综合培养基为对照进行试验，接种后置于28℃培养箱里避光培养。实验重复3次。每24h观察并测量菌丝生长情况。菌丝生长的速度＝[菌落的直径(mm)－菌种块直径(mm)]/菌落生长的时间(d)，结果取平均值，结果如下表1：

表1不同母种活化培养基对桑黄菌丝生长的影响

结果表明，以改良的新鲜马铃薯培养基作为最佳的活化培养基配方，其长势快，培养出来的桑黄菌丝呈鹅黄色、绒毛状，菌丝浓密、健壮、生命力旺盛，原基突起明显，多糖含量也远远高于其他培养基。菌丝生长情况如图2所示。

原种扩繁桑黄菌丝生长情况

选规格为13cm×19cm×0.05cm的聚丙烯菌种袋，装袋后进行高压灭菌后接种已活化的桑黄菌种，每个处理接种15袋，于28℃的恒温箱中进行培养，观察记录桑黄菌丝的生长情况，试验重复3次。结果如下表：

表2不同原种培养基对桑黄菌丝的影响

桑黄原种采用的最佳培养基为：桑枝屑20％+麸皮30％+杂木屑40％+黄豆粉8％+石灰1％+石膏1％，培养20天后菌丝健壮、生命力强，色泽呈鹅黄色。

桑枝木段桑黄菌丝生长情况

将培养好的桑黄原种接种到桑枝木段培养基上，在28℃的恒温箱中培养30天左右菌袋周围基本已长满菌丝，生长力非常旺盛，但是一般到长满底部至菌丝完全成熟还需要一段时间，此时桑黄菌丝呈淡黄色。

温差刺激对桑黄原基的影响

温差刺激对原基的形成时间有一定的影响，试验通过两种处理方式对已长满菌丝的木段进行培养，一种方式是在25-28℃温度下直接切口后暗培养，另一种方式是在4-5℃环境下处理5天后取出切口暗培养，湿度均为70-80％。试验结果如下表，经温差达到20℃以上刺激处理的桑黄菌棒在子实体培养过程中出黄时间短，有效的缩短了原基的形成时间，同时长势旺盛。而未经过温差处理的桑黄菌棒开口后出黄时间较为漫长，长势慢，原基突出后生长势较弱。

表3温差刺激对桑黄出黄的影响

桑黄子实体培养阶段的生长情况

桑枝木段桑黄的菌丝长满菌袋，色泽呈黄色，菌袋紧实时，转移到4℃冰箱培养4-5d进行温差刺激，取出后置于温度为29℃，湿度60％条件下暗培养2d，然后进行开口，刀口长8-10cm，深1-2cm，在温度为26-29℃，湿度为70-80％，下进行暗培为5-7d，期间注意通风透气，待刀口出黄时散射光培养，湿度调整为85-95％，待子实体长出原基进入生长膨大期后，每天保持四次通风透气，直至采收期结束。

不同栽培基质培养出的桑黄子实体其活性成份检测情况

通过对用袋料培养和柞木培养、桑枝木段培养的桑黄进行活性成份检测，结果如下表：

表4不同栽培基质对桑黄子实体成份的影响

桑枝木段作为培养基质在与桑枝木屑袋料培养质以及柞木培养基质上长出的桑黄子实体进行活性成分分析中发现，桑枝木段所培养出来的桑黄子实体其总生物碱、粗多糖、总酚、总黄酮、总三萜等含量相对高于柞木和桑枝屑袋料培养基培养出来的桑黄，说明了桑枝木段培养出的桑黄营养和活性成分较高，保证了桑黄的品质，提高了桑黄的药用价值，对增强人体免疫力、防癌抗氧化等方面具有广阔的开发前景。