一种具有抗氧化作用的不同年份白鲜皮的红外及其双指标辅助分析的鉴别方法

技术领域

本发明涉及植物药材鉴别领域，具体涉及一种具有抗氧化作用的不同年份白鲜皮的红外及其双指标辅助分析的鉴别方法。

背景技术

白鲜系芸香科白鲜属植物白鲜（

中药的成分和含量是区分中药质量等级的依据。现有的天然产物鉴定方法有特征鉴定、显微鉴定、薄层色谱和高效液相色谱等。但由于样品前处理的需要，这些方法存在着冗长、分析周期长、检测效率低、样品用量大等缺陷，限制了其推广和应用。因此，该行业缺乏针对不同增长年份的无损识别和快速评价方法。

近年来，傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)被广泛应用于中草药的快速鉴定。FT-IR可以保留样品成分，充分反映样品内部分子结构信息，具有样品用量低、使用方便等优点。双指标分析是一种新的指纹图谱算法，可以揭示中药不同样品之间的关系，并能准确地揭示样品与其他样品之间的距离。由于对检测样品没有严格的要求，双指标分析迅速得到了中药研究者的应用和关注。

由于氧化应激在各种生活方式介导的疾病的病因学中起着重要的作用，寻找合适的天然抗氧化剂已成为一个重要的研究领域。白鲜皮在不同生长年份抗氧化能力的差异与主要活性物质的变化有关，反映了药材质量的差异。

本研究采用傅里叶红外光谱（FT-IR）、二阶导数红外光谱(SD-IR)和双指标序列分析方法分析了白鲜皮在不同生长年份的光谱差异，并制备了白鲜皮的甲醇提取物来测定其抗氧化活性。本研究为农民种植白鲜皮提供了理论指导，对其他药材的种植和质量评价具有一定的指导意义。

发明内容

本专利采用傅里叶变换红外光谱、二阶导数红外光谱、双指标序列分析和抗氧化活性评价等分析方法，分析了白鲜皮在不同生长年份的差异。

一种如权利要求1所述，采用傅里叶变换红外光谱、二阶导数红外光谱，抗氧化活性等方法分析白鲜皮在不同生长年份的差异，其特征在于按如下步骤进行：

1. 红外及其二阶导数

分别取二、三、四、七年生白鲜皮粉碎、研细、过60目筛、60℃烘干至恒重。精密称定样品粉末1mg，KBr粉末100mg，在玛瑙研钵中研磨，制备样品。

（1）每个样品光谱为4000-400 cm

1319 cm

（2）白鲜皮不同年份的光谱相似，利用OMNIC 8.0的Savitsky-Golay导数得到谱的二阶导数，通过红外二阶导数光谱可以观察到形状和强度上的一些差异，进行光谱解析。根据白鲜皮吸收峰之间的比较,显示的高峰在1619、1370、1080、763、641和575 cm

在1300-1000 cm

双指标序列分析

通过不同年份白鲜皮的红外指纹图谱的波数和共峰比较，白鲜皮样品的共同峰率在55.56% ~ 87.50%之间，总体相似度较高。共峰率最高为3年生:4年生为87.50%，变异峰比较低(7.14%)。将2年生:7年生, 3年生:7年生, 4年生:7年生与其他组进行综合分析，发现共峰率较低，变异峰率较高，说明7年生的组成与其他样本相比发生了显著变化。7年生中黄柏酮的含量略有下降，白鲜碱的含量有所提高。

抗氧化

（1）取不同浓度的白鲜皮甲醇提取液以及VC水溶液进行清除DPPH自由基的抗氧化实验，结果显示随着甲醇提取物浓度的增加，DPPH∙清除活性增强，活性呈剂量依赖性，范围为1.6 ~ 14.4 ug /mL。VC、2年生、3年生、4年生、7年生的半抑制浓度（IC

（2）取不同浓度的白鲜皮甲醇提取液以及VC水溶液进行清除ABTS自由基的抗氧化实验，结果显示随着浓度的增加，白鲜皮甲醇提取液的清除活性明显增强，在0.16-5.6 mol/mL范围内以浓度依赖的方式增加。VC、2年生、3年生、4年生、7年生的IC

结果证明：白鲜皮甲醇提取液具有抗氧化活性，且清除活性随着年份增长而增强。

图1是白鲜碱；图2是黄柏酮；图3是梣酮；图4是不同年份白鲜皮红外光谱（A：7年生；B：4年生；C：3年生；D：2年生）；图5是不同年份的红外二阶导数图谱（A：7年生；B：4年生；C：3年生；D：2年生）；图6 不同年限白鲜皮对DPPH自由基的清除作用(TWDT：7年生；THDT：4年生；FODT：3年生；SEDT：2年生)；图7 不同年限白鲜皮对ABTS自由基的清除作用(TWDT：7年生；THDT：4年生；FODT：3年生；SEDT：2年生)。

具体实施方式

以下结合图表和具体实施操作对本发明作具体的介绍。

实施方案一 红外及其二阶导数光谱的研究

1. 不同年份白鲜皮的红外光谱

分别取二、三、四、七年生白鲜皮粉碎，研细，过60目筛，60℃烘干至恒重。精密称定样品粉末1mg，KBr粉末100mg，在玛瑙研钵中研磨，混匀，经压片机压制成厚度合适均匀的薄片。

红外光谱分辨率4cm

用FT-IR测定2年生、3年生、4年生和7年生的白鲜皮（图4）。红外光谱比较表明，不同生长年份的白鲜皮具有明显的指纹特征。结合上图1-3，对白鲜皮的红外光谱进行分析。3340 cm

虽然2年生、3年生、4年生和7年生的光谱非常相似，但在形状和强度上可以观察到一些差异。在1620 cm

在928 cm

不同年份白鲜皮的红外二阶导数光谱

一般情况下，红外二阶导数光谱可以增强表面分辨率，放大红外光谱的微小差异。在白鲜皮的红外光谱中，不同年份的叠加峰在其导数光谱中分裂为两个或两个以上的峰。峰的位置在二阶导数光谱更准确的进一步比较。在1800-500 cm

根据白鲜皮吸收峰之间的比较, 显示的高峰在1619、1370、1080、763、641和575cm

如前所述，在1800-500 cm

在1600-1300 cm

在1300-1000 cm

在1000-800 cm

此外，我们可以清楚地观察到，在893cm

利用红外光谱和二阶导数光谱分析了多糖、白鲜碱、黄柏酮和梣酮的含量随生长期的增加而变化。在早期，随着生长年限的延长，黄柏酮的含量逐渐增加，但7年生中黄柏酮的含量略有下降。白鲜碱的含量随着年份的增加含量有所提高。所以，随着时间的延长，出现了白鲜碱组分含量的变化。

红外指纹光谱数据处理

共峰定义为一组吸收峰，组内峰间的最大波数差明显小于组与其相邻基团峰的平均值之差。在表1中，多基团峰明显符合此测定方法，可以清楚地识别为共峰。例如，对于1414.4 cm

表1不同年份白鲜皮的红外指纹图谱的波数和共峰

4.常用指标和差异指标

为了找到关系最密切的两个样本，可以以其中一个样本为参考，计算其他样本的共同峰率和变异峰率，并将其排列成大小有序的双指标序列。该方法可用于样品的进一步比较分析。结果如表2所示。

表2 四个不同生长年份白鲜皮的共同峰和变异峰双指数序列

计算结果如下:

(1)共峰比:P= (Ng/ Nd)×100%;

(2) Ng:两种红外指纹光谱中出现的吸收峰数;

(3) Na:红外图像a中共峰相对非共峰的峰数;

(4) Nb:红外图像b中共峰相对非共峰的峰数;

(5)独立峰数:Nd= Ng+Na+Nb;

(6)指纹光谱变化峰值率a: Pva=(Na/Ng)×100%;

(7)指纹光谱变化峰值率b: Pvb=(Nb/Ng)×100%。

如表2所示，各序列的共同峰率在不同样本之间存在差异。其中2年生: 3年生(76.47;15.38;15.38)表示基于2年生计算其他样本的共同峰率和变异峰率。序列片段显示，2年生的共峰率为76.47%，相对于共峰率的峰值变化率分别为15.38%和15.38%。从以上序列可以看出，白鲜皮样品的共同峰率在55.56% ~ 87.50%之间，总体相似度较高。共峰率最高为3年生:4年生，为87.50%。较近年份的2年生与3年生、4年生比较相似，共同峰比较高(87.50%)，变异峰比较低(7.14%)。将2年生:7年生, 3年生:7年生, 4年生:7年生与其他组进行综合分析，发现共峰率较低，变异峰率较高，说明7年生的组成与其他样本相比发生了显著变化。

实施方案二 不同年份白鲜皮的抗氧化作用

1.供试品的制备

取二、三、四、七年生白鲜皮药材，粉碎，过60目筛，分别取2.00g粉末，加入50mL甲醇，于同样条件下水浴回流1h，离心，浓缩，将浓缩液用甲醇定容至25mL，得到白鲜皮甲醇提取液。

2.DPPH 清除率的测定

因不同年限白鲜皮的抗氧化能力相差较大，分别取不同年限不同浓度白鲜皮甲醇提取液2mL，加入等体积的浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液，混匀后在室温下避光反应30min，在517nm下测定吸光度A

清除率(%)=[1-(A

因不同年限白鲜皮的抗氧化能力差别较大，按下列方法配置样液：分别取两年生白鲜皮甲醇提取液1.000、1.400、1.600、1.700、1.800 mL定容至10mL，三年生白鲜皮甲醇提取液0.800、1.000、1.100、1.200、1.400mL定容至10mL，四年生白鲜皮甲醇提取液1.000、1.200、1.600、1.800、2.000mL定容至10mL，七年生白鲜皮甲醇提取液0.200、0.250、0.500、0.600、0.800mL定容至10mL。

DPPH是一种非常稳定的氮中心自由基。如果能够消除DPPH，则表明所检测物质能够降低过氧化物自由基，阻断脂质过氧化链反应。通过比较加入样本前后吸光度值的变化，计算DPPH的清除率。如图6所示，DPPH自由基清除活性呈剂量依赖性，范围为1.6 ~ 14.4 ug/mL。随着甲醇提取物浓度的增加，DPPH∙清除活性增强。VC、2年生、3年生、4年生、7年生的50%抑制浓度IC

3. ABTS清除率的测定：

因不同年限白鲜皮的抗氧化能力相差较大，分别取不同年限不同浓度的白鲜皮甲醇提取液2mL，加入等体积ABTS工作液，混匀后在室温下静置6min，在734nm下测定吸光度A

清除率(%)={[A

因不同年限白鲜皮的抗氧化能力差别较大，按下列方法配置样液：分别取两年生白鲜皮甲醇提取液0.1、0.2、0.3、0.48、0.7mL定容至10mL，三年生白鲜皮甲醇提取液0.020、0.025、0.030、0.040、0.050mL定容至10mL，四年生白鲜皮甲醇提取液0.020、0.040、0.050、0.070、0.200mL定容至10mL，七年生白鲜皮甲醇提取液0.010、0.015、0.030、0.060、0.100mL定容至10mL。

ABTS+法可用于评价各种化合物的总抗氧化能力。本实验中白鲜皮的ABTS+清除能力如图7所示。所有样品的活性在0.16-5.6 mol /mL范围内以浓度依赖的方式增加。随着浓度的增加，白鲜皮的清除活性明显增强。VC、2年生、3年生、4年生、7年生的IC50值分别为0.417、1.029、0.791、0.775、0.300μg/mL，7年生>VC>4年生>3年生>2年生，表明清除能力随年份的增大而增大。3年生和4年生的清除能力相似，但7年生的清除能力要高得多。

DPPH和ABTS抗氧化实验结果表明，随着年份的延长，抗氧化能力增强。多糖、白鲜碱、黄柏酮和梣酮均具有抗氧化活性。从红外和二阶导数图谱可以推断，抗氧化能力的增强与物质的积累有关。不同生长年份的白鲜皮成分和含量存在一定差异，影响了白鲜皮的生物活性。要获得优质、高产、高效的白鲜皮, 它的生育期应设置在3年以上。

利用红外及二阶导数研究不同生长年份白鲜皮的组成，并将红外指纹图谱与双指数序列分析相结合。在此基础上，测试了不同年份四组白鲜皮的抗氧化活性。随着生长年限的增加，其代谢产物和抗氧化活性明显提高，但生长时间过长，黄柏酮含量下降。利用红外指纹图谱研究了白鲜皮抗氧化活性的变化，发现了其光谱特征与化学成分的相似性和差异性，为进一步建立白鲜皮的质量控制技术奠定了基础。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明的构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。