中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法

技术领域

本发明属于蜜蜂气味受体研究技术领域，尤其涉及中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法。

背景技术

昆虫嗅觉受体(ORs)是七次跨膜离子受体。它们主要表达在嗅觉和味觉器官的神经元(ORN)的树突膜上，并参与检测挥发性气味并将这些化学信号转化为电信号。昆虫嗅觉神经元表达两类气味受体：一是传统的气味受体(ORs)，二是气味共受体(Orco)。OR/Orco复合物形成一个功能性阳离子通道，使K

蜜蜂育种工作主要是通过选育优质高产的蜂王，而雄蜂的质量与处女王相比，具有同等重要的地位。雄蜂的优劣主要是通过其精子质量来判断。精子活率、精子密度、精子活力是衡量雄蜂精液品质的一项重要指标。雄蜂精子品质的优劣决定了蜜蜂人工受精选育的成败。到目前为止，还未见由于基因调控影响蜜蜂精液品质研究报道。

发明内容

本发明提供中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，旨在探讨中华蜜蜂AcerOr2和其下游信号分子在细胞水平调节精子质量中的可能生物学作用及其对中华蜜蜂精液品质的影响，为气味受体在生殖过程中的功能研究提供理论基础。

本发明是这样实现的，中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，包括以下步骤：

S1、荧光定量检测目的基因的表达：将采集到的中华蜜蜂精子和睾丸提取细胞总RNA，反转录成cDNA；以β-actin作为内参基因，根据NCBI中AcerOr2序列，使用PrimerPrimer6.0设计引物；进行实时荧光定量PCR；

S2、Western blot检测目的基因表达：将采集到的中华蜜蜂精子和睾丸进行裂解并提取总蛋白；用BCA法测蛋白浓度后，进行SDS-PAGE电泳并转膜，经过封闭、一抗孵育、HRP标记的二抗孵育，于化学发光成像仪进行分析；对相关条带灰度值进行定量分析；

S3、CASA计算机辅助分析仪评估精子常规指标：采用计算机辅助分析仪分析W7和VUAA1对中华蜜蜂精子常规指标的影响；

S4、通过流式细胞仪检测精子DNA完整性。

2.如权利要求1所述的中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，其特征在于：步骤S1中，所述引物的序列为：

AcerOr2：

F：5′-GTGTTGTTCTGCTCCTGGCT-3′；

R：5′-GGAAGGTGGTCGTGAAGTCG-3′；

β-actin：

F：5′-GTGACGACGAAGTAGCAGC-3′

R：5′-TGACCCATACCGACCAT-3′。

优选的，步骤S1中，使用TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，进行实时荧光定量PCR。

优选的，步骤S2中，使用Quantity one软件对相关条带灰度值进行定量分析，并以β-actin作为内参。

优选的，所述采用计算机辅助分析仪分析W7和VUAA1对中华蜜蜂精子常规指标的影响，具体包括：

新鲜精液经活率测定后，加入1-2倍体积稀释液，1500rpm室温离心5min，弃上清，加入稀释液将精子稀释至1×10

优选的，所述通过流式细胞仪检测精子DNA完整性，包括：

采集到的精子样本用预冷PBS(4℃)洗涤2次，加300μL 1×结合缓冲液悬浮，2000g离心10min；将结合缓冲液从细胞颗粒中去除，再悬浮于1mL1×结合缓冲液中；细胞浓度调节为1×10

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，首先通过进行荧光定量检测目的基因的表达，然后进行Westernblot检测目的基因蛋白的表达，接着使用CASA计算机辅助分析仪评估精子常规指标，最后通过流式细胞仪检测精子DNA完整性，从而获得气味受体AcerOr2的表达和其对精液品质的影响的相关数据，有助于探讨中华蜜蜂AcerOr2和其下游信号分子在细胞水平调节精液品质中的可能生物学作用及其对中华蜜蜂精液品质的影响，为气味受体在生殖过程中的功能研究提供理论基础。

附图说明

图1为AcerOr2 mRNA和AcerOr2蛋白在中华蜜蜂雄蜂精子和睾丸中的表达示意图。

图2为Ca

图3为流式细胞分析VUAA1和W7对精子DNA完整性的影响的示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

请参阅图1，本发明提供一种技术方案：中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，包括以下步骤：

S1、首先准备如下试剂和仪器：

试剂包括：兔抗CaM，兔抗CaMKII，兔抗p-CaMKII购自Bioworld Technology；VUAA1、W7购自Sigma；Annexin V PE/7-AAD细胞凋亡试剂盒购自康为世纪；TRIzolTM购自Invitrogen公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、PrimeScriptTM RT Master Mix购自TaKaRa公司；RNA-free Water以及三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇等常规试剂购自全式金公司。

仪器包括：XT5107XT5107人工智能气候箱(上海恒一)；ChemiDocTM XRS+凝胶成像系统(Bio-Rad)；Guava EasyCyte流式细胞仪器(Merck Millipore)；CASA计算机辅助精液分析系统(Proiser)；Westernblot电泳仪(Bio-Rad)；7500实时荧光定量PCR仪(Stratagene)。

将采集到的中华蜜蜂精子和睾丸提取细胞总RNA，反转录成cDNA；以β-actin作为内参基因，根据NCBI中AcerOr2序列，使用PrimerPrimer6.0设计引物：

AcerOr2：

F：5′-GTGTTGTTCTGCTCCTGGCT-3′；

R：5′-GGAAGGTGGTCGTGAAGTCG-3′；

β-actin：

F：5′-GTGACGACGAAGTAGCAGC-3′

R：5′-TGACCCATACCGACCAT-3′。

进行实时荧光定量PCR。

S2、Westernblot检测目的基因表达：将采集到的中华蜜蜂精子和睾丸进行裂解并提取总蛋白；用BCA法测蛋白浓度后，进行SDS-PAGE电泳并转膜，经过封闭、一抗孵育、HRP标记的二抗孵育，于化学发光成像仪进行分析；使用Quantity one软件对相关条带灰度值进行定量分析，以β-actin作为内参。

S3、CASA计算机辅助分析仪评估精子常规指标：新鲜精液经活率测定后，加入1-2倍体积稀释液，1500rpm室温离心5min，弃上清，加入稀释液将精子稀释至1×10

S4、流式细胞仪检测精子DNA完整性：采集到的精子样本用预冷PBS洗涤2次，预冷PBS的温度为4℃，加300μL 1×结合缓冲液再悬浮，2000g离心10min；将结合缓冲液从细胞颗粒中去除，再悬浮于1mL1×结合缓冲液中；细胞浓度调节为1×10

S5、应用SPSS22.0软件进行统计分析，统计数据采用单因素方差分析并符合近似正态分布，DNA完整性和精液常规参之间的相关性采用Pearson相关性分析，用r表示相关系数，P＜0.05。

结果与分析：

气味受体在生殖组织中的表达：

为了验证检测气味受体在中华蜜蜂精子和睾丸中的表达，应用qRT-PCR和Westernblot进行检测，结果显示AcerOr2 mRNA在精子中显著高于在睾丸中的表达量，如图1A所示。Western lot结果显示AcerOr2蛋白(56kDa)在精子和睾丸中均有与预测蛋白分子量大小一致的条带，且AcerOr2蛋白在精子中的表达量显著高于睾丸，表明AcerOr2可能在精子功能中发挥着重要作用，如图1B所示。每组三次生物重复，误差线用Mean±SEM表示，**：0.05

中华蜜蜂生殖组织中Ca

在AcerOr2的保守区域中发现了CaM-binding序列，而CaM作为一个Ca

VUAA1和W7对精液常规参数的影响分析：

对中华蜜蜂精液的精子密度参数进行测定，结果如表1所示：其中VUAA1处理组精子活力和向前运动精子密度显著高于对照组和W7处理组，而W7处理组精子活力和向前运动精子密度显著低于对照组和VUAA1处理组。对照组、VUAA1处理组和W7处理组精子活率分别为(60.66±4.19b)％、(72.90±3.58a)％、(34.72±8.90c)％，向前运动精子密度分别为(38.14±3.63b)％、(59.36±4.85a)％、(26.53±6.95c)％。

对照组、VUAA1处理组精子曲线速度或轨迹速度、平均路径速度、平均摆跨速度无差异，W7处理组精子曲线速度或轨迹速度、平均路径速度、平均摆跨速度显著低于对照组和VUAA1处理组织。对照组、VUAA1处理组、W7处理组：曲线速度或轨迹速度分别为(76.75±5.05a)(μm/sec)、(72.90±3.58a)(μm/sec)、(54.5±6.50b)(μm/sec)，平均路径速度分别为(33.4±0.6a)(μm/sec)、(33.8±1.08a)(μm/sec)、(26.4±2.40b)(μm/sec)，平均摆跨速度(33.4±0.6a)(μm/sec)、(33.8±1.08a)(μm/sec)、(26.4±2.40b)(μm/sec)。

VUAA1处理组精子侧摆幅度显著高于对照组和W7处理组，而W7处理组直线性显著高于于对照组和VUAA1处理组。对照组、VUAA1处理组、W7处理组：精子侧摆幅度分别为(3.2±0.8ab)、(4.25±0.25a)、(2.3±0.81b)，精子直线性分别为(17±0.04c)、(20±0.08b)、(23±0.014a)。

表1 AcerOr2激动剂VUAA1和CaM抑制剂W7对精液参数的影响

VUAA1和W7对精子DNA完整性的影响：

为了检测AcerOr2激动剂VUAA1和CaM抑制剂W7对精子DNA完整性的影响，使用流式细胞仪进行检测，结果如图3所示：未经处理的精子通常会显示少量的坏死细胞和凋亡细胞，用VUAA1处理的精液与对照组相比精子细胞凋亡显著增加；而使用CaM抑制剂W7处理的精液，大部分的精子细胞坏死，凋亡细胞数量减少如图3A、B所示。用100μM VUAA1和W7处理后的48h，分别有(68.63±3.81)％和(7.37±3.93)％的细胞发生凋亡，而且能观察到明显的细胞碎片，如图3所示。图3中，左下象限：活细胞(AnnexinV-/7-AAD-)，左上象限：死细胞(Annexin V-/7-AAD+)，右上象限：晚期凋亡细胞(Annexin V-/7-AAD+)，右下象限：早期凋亡细胞(Annexin V-/7-AAD-)。A为VUAA1诱导精子细胞凋亡。B为W7处理可破坏精子细胞的DNA完整性(P<0.01)，72h后凋亡细胞明显增加(P<0.01)。NT：阴性对照试验，NC：阴性对照。**P<0.01。

DNA完整性与精液常规指标相关性分析：

用相关性(r)和(P)值来评估精子完整性和精液参数之间的相关性。精子DNA完整性与精子密度参数相关性分析见表2。从表中可以看出精子与DNA分裂的百分比与精子的正向运动性(r＝0.9464，P<0.001)、总运动性(r＝0.9157，P<0.001)、曲线速度(VCL)(r＝0.6686、P<0.05)之间存在极显著正相关。与平均路径速度(VAP)(m/s)(r＝0.7796，P<0.05)、精子浓度(百万/ml)(r＝0.816，P<0.01)、侧向头部位移(ALH)(c)(r＝0.8937，P<0.01)显著正相关。

表2精子DNA完整性与精液常规参数相关性分析

结果表明AcerOr2、CaM、CaMKII和p-CaMKII在中华蜜蜂的精子和睾丸中均有表达。AcerOr2激动剂VUAA1和CaM抑制剂W7对精子DNA完整性和精液质量有影响，说明AcerOr2可能通过Ca

本发明的中华蜜蜂气味受体AcerOr2对精液品质的影响分析的实验方法，首先通过进行荧光定量检测目的基因的表达，然后进行Western blot检测目的基因蛋白的表达，接着使用CASA计算机辅助分析仪评估精子常规指标，最后通过流式细胞仪检测精子DNA完整性，从而获得气味受体AcerOr2的表达和其对中华蜜蜂精液品质的影响的相关数据，并进行相应的结果分析，有助于探讨中华蜜蜂AcerOr2和其下游信号分子在细胞水平调节精液品质中的可能生物学作用及其对中华蜜蜂精液品质的影响，为气味受体在生殖过程中的功能研究提供理论基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。