BMPs-BMPRs axis抑制剂在EGFR突变肺癌治疗中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗领域，具体地说是BMPs-BMPRs axis抑制剂在EGFR突变肺癌治疗中的应用。

背景技术

目前，EGFR突变肺癌患者的治疗手段主要还是传统的手术、放疗、化疗、以及靶向治疗。中国专利CN201310593730.2提供了在哺乳动物中治疗酪氨酸激酶抑制剂抗性EGFR介导的疾病的方法，提供了用于在具有次级EGFR突变，特别地酪氨酸激酶结构域突变的抗标准疗法的个体中治疗癌症和减少肿瘤生长的方法，提供了使用抗EGFR抗体治疗抗酪氨酸激酶抑制剂的癌症的方法，描述了使用抗体抗EGFR mAb806治疗抗酪氨酸激酶抑制剂的复发性肺癌包括非小细胞肺癌的方法。

EGFR络氨酸激酶抑制剂能够明显的改善EGFR突变的肺癌患者的生存质量，该肺癌患者在亚洲占非小细胞肺癌的50％。但是，EGFR络氨酸激酶抑制剂同其它的靶向治疗方案一样会出现耐药性，而且，EGFR络氨酸激酶抑制剂并没有明显提高患者的总生存率。更为惋惜的是，相较于全部肺癌患者对免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1具有的23％的响应率，EGFR突变的肺癌患者的响应率只有3.6％。

目前，虽然基础科研对于大部分的信号通路的研究已经相对清晰。但是，这些信号通路在不同器官，不同组织，甚至在不同细胞中都存在功能上的差异性，形成了复杂的信号网络。在这些信号网络中，发现肿瘤环境中那些信号通路可能会影响肿瘤的发生发展十分困难。

因此，寻找对EGFR突变的肺癌患者新的药物，改善EGFR突变肺癌患者或者EGFR 靶向药物治疗后出现耐药的肺癌患者的生存质量和延长生存时间，是本领域仍待解决的重要课题。

发明内容

有鉴于此，本申请的提供了一种全新的肿瘤的治疗方案，通过BMPs-BMPRs axis抑制剂在EGFR突变肺癌治疗中的应用。本申请的BMPs-BMPRs axis抑制剂通过阻断BMP信号使肿瘤从‘冷’肿瘤逆转为‘热’肿瘤，抑制肿瘤的生长，为EGFR突变的肺癌患者提供了新的治疗方案，改善EGFR突变肺癌患者或者EGFR靶向药物治疗后出现耐药的肺癌患者的生存质量和延长生存时间。

为了达到上述目的，本申请提供如下技术方案。

BMPs-BMPRs axis抑制剂在EGFR突变肺癌治疗中的应用，其特征在于，所述 BMPs-BMPRs axis抑制剂用于调控肿瘤微环境的细胞变化，所述肿瘤微环境包括非免疫细胞和免疫细胞，所述非免疫细胞包括肿瘤细胞，所述免疫细胞包括巨噬细胞和T细胞，所述巨噬细胞包括M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞；所述BMPs-BMPRs axis抑制剂包括 LDN-193189、K02288、LDN-214117、ML347、LDN-212854、DMH1中的任一种或任意结合。

优选地，分析肿瘤微环境内各类细胞的组成采用单细胞技术和seurat方法。

优选地，所述巨噬细胞通过LPS的刺激向所述M1型巨噬细胞极化。

优选地，所述M1型巨噬细胞表达趋化因子促进T细胞的浸润，所述趋化因子包括Cxcl9和Cxcl10，所述M1型巨噬细胞抑制肿瘤生长。

优选地，所述M1型巨噬细胞通过BMP2和BMP4向所述M2型巨噬细胞极化。

优选地，所述M2型巨噬细胞表达能够招募Treg细胞的趋化因子，所述趋化因子包括 Ccl17和Ccl22。

优选地，所述Treg细胞是一种免疫抑制型细胞，能够明显的抑制肿瘤中的免疫反应，影响肿瘤免疫治疗的效果。

优选地，所述BMPs-BMPRs axis抑制剂抑制BMP2和BMP4信号通路，阻止肿瘤微环境中所述巨噬细胞向所述M2型巨噬细胞极化。

优选地，所述BMPs-BMPRs axis抑制剂在体内抑制EGFR突变肺癌生长的机制是通过提高体内免疫系统功能达到抗肿瘤的效果。

优选地，所述BMPs-BMPRs axis抑制剂通过抑制人EGFR突变肺癌细胞系的生长或抑制EGFR靶向药耐药后的人EGFR突变肺癌细胞系的生长发生作用。

本发明所获得的有益技术效果：

1)本发明利用单细胞技术探索EGFR突变诱导肺癌发生过程中肿瘤微环境内各类细胞的组成以及这些细胞的变化，并通过细胞间的相互作用关系，发现肿瘤发生过程中重要的调控机制，并验证该信号通路抑制肿瘤生长的可行性；

2)本发明可以通过阻止巨噬细胞向M2型巨噬细胞转变，而使巨噬细胞保持M1型，M1型巨噬细胞具有抑制肿瘤生长；

3)本发明还可以通过调节免疫系统来改变肿瘤微环境，使肿瘤微环境由‘冷’变‘热’。进而，可以促进免疫系统主动杀伤、抑制肿瘤生长，可以促进PD1的治疗效果，对于之前的治疗是一种很好的补充。

上述说明仅是本申请技术方案的概述，为了能够更清楚了解本申请的技术手段，从而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本申请的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下以本申请的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

根据下文结合附图对本申请具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本申请的上述及其他目的、优点和特征。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1信号通路抑制肿瘤生长可行性验证实验设计示意图；

图2肿瘤微环境中细胞的种类示意图；

图3肿瘤微环境中各类细胞的相互作用，巨噬细胞M1、M2型的转换示意图；

图4巨噬细胞通过趋化因子与其他免疫细胞的相互作用示意图。

图5BMP2，BMP4和他们的受体ACVR1，ACVR2A，ACVR2B的表达分别在表皮细胞和巨噬细胞中逐渐增加示意图；

图6肿瘤细胞分泌的BMP2和BMP4通过巨噬细胞上的受体ACVR1调控巨噬细胞向 M2型转化示意图；

图7BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189和DMH1可以抑制巨噬细胞向M2型转化示意图；

图8在体内BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189和DMH1可以抑制巨噬细胞向M2 型转化示意图；

图9BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189抑制肿瘤的生长示意图；

图10BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189和DMH1抑制人人EGFR突变肺癌细胞系的生长示意图；

图11BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189和DMH1抑制EGFR靶向药耐药后的人EGFR突变肺癌细胞系的生长示意图。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。在下面的描述中，提供诸如具体的配置和组件的特定细节仅仅是为了帮助全面理解本申请的实施例。因此，本领域技术人员应该清楚，可以对这里描述的实施例进行各种改变和修改而不脱离本申请的范围和精神。另外，为了清楚和简洁，实施例中省略了对已知功能和构造的描述。

应该理解，说明书通篇中提到的“一个实施例”或“本实施例”意味着与实施例有关的特定特征、结构或特性包括在本申请的至少一个实施例中。因此，在整个说明书各处出现的“一个实施例”或“本实施例”未必一定指相同的实施例。此外，这些特定的特征、结构或特性可以任意适合的方式结合在一个或多个实施例中。

此外，本申请可以在不同例子中重复参考数字和/或字母。这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身并不指示所讨论各种实施例和/或设置之间的关系。

本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B，同时存在A和B三种情况，本文中术语“/和”是描述另一种关联对象关系，表示可以存在两种关系，例如，A/和B，可以表示：单独存在A，单独存在A和B两种情况，另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”关系。

本文中术语“至少一种”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和B的至少一种，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。

还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含。

实施例1

BMPs-BMPRs axis抑制剂在EGFR突变肺癌中的临床应用，包括肿瘤和肿瘤微环境，所述肿瘤微环境包括4种非免疫细胞和7种免疫细胞，所述非免疫细胞包括肿瘤细胞，所述免疫细胞包括巨噬细胞和T细胞，所述巨噬细胞包括M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞；所述BMPs-BMPRs axis抑制剂包括LDN-193189、K02288、LDN-214117、ML347、 LDN-212854、DMH1中的任一种或任意结合。

进一步的，分析肿瘤微环境内各类细胞的组成采用单细胞技术和seurat方法。

进一步的，所述巨噬细胞通过LPS的刺激向所述M1型巨噬细胞极化。

进一步的，所述M1型巨噬细胞表达趋化因子促进T细胞的浸润，所述趋化因子包括Cxcl9和Cxcl10，所述M1型巨噬细胞抑制肿瘤生长。

进一步的，所述M1型巨噬细胞通过BMP2和BMP4向所述M2型巨噬细胞极化。

进一步的，所述M2型巨噬细胞表达能够招募Treg细胞的趋化因子，所述趋化因子包括Ccl17和Ccl22。

进一步的，所述Treg细胞是一种免疫抑制型细胞，能够明显的抑制肿瘤中的免疫反应，影响肿瘤免疫治疗的效果。

进一步的，所述BMPs-BMPRs axis抑制剂抑制BMP2和BMP4信号通路，阻止肿瘤微环境中所述巨噬细胞向所述M2型巨噬细胞极化。

在一个实施例中，所述BMPs-BMPRs axis抑制剂在体内抑制EGFR突变肺癌生长的机制是通过提高患有肿瘤小鼠的免疫系统功能达到抗肿瘤的效果。

进一步的，所述抑制机制的具体方法为：肿瘤小鼠腹腔注射抑制剂后，所述巨噬细胞保持具有杀伤肿瘤效果的M1型巨噬细胞；肺肿瘤内的CD8

实施例2

本实施例是在上述实施例1的基础上进行，与上述实施例1相同之处不予赘述。

本实施例介绍验证该信号通路抑制肿瘤生长可行性的实验。

如附图1所示，本实施例的具体步骤如下：

S201、单细胞测序；

S202、seurat方法分析肿瘤微环境中存在的细胞类型；

S203、对肿瘤微环境中各类细胞的相互作用关系进行分析；

S204、实验验证BMP2和BMP4是否能够调节巨噬细胞的极化。

进一步的，步骤S202中所述seurat方法分析发现肿瘤微环境中存在11种细胞类型，4 种非免疫细胞，7种免疫细胞。

如附图2所示，在非免疫细胞中，随着肿瘤的生长肿瘤细胞逐渐增多。在免疫细胞中，巨噬细胞比例明显增加，而T细胞比例明显减少；这类肿瘤微环境是明显的‘冷’肿瘤微环境，对免疫治疗不敏感。

进一步的，步骤S203对肿瘤微环境中各类细胞的相互作用关系进行分析，获得的结果如下：

如附图3所示，所述巨噬细胞在肿瘤微环境中是协调各细胞类型相互作用的中枢；随着肿瘤的发展，肿瘤中的巨噬细胞先转换为M1型巨噬细胞，随后又转变成M2型巨噬细胞；

如附图4所示，在肿瘤发生早期，所述巨噬细胞表现为M1型巨噬细胞，此时，巨噬细胞主要表达如Cxcl9,Cxcl10等趋化因子促进T细胞的浸润等；肿瘤发展的后期，能够招募Treg细胞的趋化因子Ccl17，Ccl22的表达逐渐升高；证明了EGFR突变肺癌是一种免疫抑制明显的‘冷’肿瘤；因此，该肿瘤对免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1的响应率低；

如附图5所示，在肿瘤发生后，新出现的相互作用中，BMP2，BMP4与ACVR1，ACVR2 的相互作用同步增加，且BMP2，BMP4在肿瘤中的表达量显著升高。

进一步的，步骤S204中所述实验具体步骤包括：

1)通过肺泡灌洗液分选出肺中比较纯净的巨噬细胞，并在体外进行培养；

2)在脂多糖LPS的刺激下，巨噬细胞向M1进行分化；

3)加入BMP2或BMP4蛋白。

如附图6所示，当在培养的巨噬细胞中分别加入BMP2或者BMP4蛋白后，巨噬细胞由M1向M2分化；说明BMP2和BMP4可以直接调控肺泡巨噬细胞的极化。

本实施例所获得的结果如下：

BMP2和BMP4促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化是引起抑制型肿瘤免疫微环境，抑制免疫反应，促进肿瘤肿瘤生长的重要原因；所以，抑制BMP2和BMP4信号通路可以阻止肿瘤微环境中巨噬细胞向M2型极化。进而，使肿瘤免疫微环境维持免疫活性，抑制肿瘤生长。

因此，BMPs-BMPRs axis抑制剂单独或者联合PD-1/PD-L1可用于作为治疗EGFR突变肺癌。

实施例3

本实施例是在上述实施例1的基础上进行的，与实施例2相同之处不予赘述。

本实施例介绍BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189抑制体外培养的肺泡巨噬细胞由M1型向M2型转化。

本实施例的具体实施方法如下：

S301、从野生型小鼠肺泡中分离肺泡巨噬细胞并进行培养；

S302、在贴壁培养24小时后，进行换液并加入刺激物LPS；

S303、用BMP2或BMP4处理巨噬细胞；

S304、加入ACVR1的抑制剂LDN-193189处理24小时；

S305、用Trizol提取RNA后用反转录试剂盒得到cDNA；

S306、使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒进行扩增；

S307、检测巨噬细胞M1型和M2型的marker基因。

进一步的，所述有机分子包括双三氟甲烷磺酰亚胺。

如附图7所示，ACVR1的抑制剂LDN-193189能够明显的抑制肺泡巨噬细胞中M2型marker基因的表达，促进M1型marker基因的表达。

实施例4

本实施例是在上述实施例3的基础上进行的，与实施例3相同之处不予赘述。

本实施例介绍BMPs-BMPRs axis抑制剂DMH1抑制体外培养的肺泡巨噬细胞由M1型向M2型转化。

本实施例的具体步骤包括：

S401、从野生型小鼠肺泡中分离肺泡巨噬细胞并进行培养；

S402、在贴壁培养24小时后，进行换液并加入刺激物LPS；

S403、用BMP2或BMP4处理巨噬细胞；

S404、加入ACVR1的抑制剂DMH1处理24小时；

S405、用Trizol提取RNA后用反转录试剂盒得到cDNA；

S406、使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒进行扩增；

S407、检测巨噬细胞M1型和M2型的marker基因。

如附图7所示，ACVR1的抑制剂DMH1能够明显的抑制肺泡巨噬细胞中M2型marker基因的表达，促进M1型marker基因的表达。

实施例5

本实施例是在上述实施例1的基础上进行的，与实施例1相同之处不予赘述。

本实施例介绍BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189抑制小鼠肺肿瘤中肺泡巨噬细胞由M1型向M2型转化。

本实施例具体步骤如下：

S501、选取15只出生后4-5周的tetO-EGFR

S502、通过在三组小鼠的饮用水中加入终浓度为2mg/ml的强力霉素，开始在肺上皮细胞中特异诱导EGFR

S503、在连续饮用含有强力霉素的水14天后，其中一组小鼠除继续饮用强力霉素外，还通过腹腔注射的方式向小鼠中注射5mg/kg的BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189，连续注射14天；

S504、末次给药后2天，处死小鼠，并取出小鼠肺组织，剪碎后利用胶原酶二进行消化肺肿瘤组织，得到单细胞悬液，通过10x Genomics单细胞技术构建基因转录组测序文库，进行二代测序后分析肿瘤中巨噬细胞的性质。

如附图8所示，在正常小鼠肺中巨噬细胞表现为M1型巨噬细胞，在肺肿瘤中巨噬细胞表现为M2型，但在注射抑制剂LDN-193189的肺中，巨噬细胞则表现为M1型巨噬细胞。因此，我们得出在肺肿瘤发生发展过程中，注射抑制剂LDN-193189可以抑制BMP2 和BMP4调控巨噬细胞向M2型转化。

实施例6

本实施例是在上述实施例5的基础上进行的，与实施例5相同之处不予赘述。

本实施例介绍BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189和DMH1抑制小鼠肺肿瘤的生长。

本实施例具体步骤如下：

S601、选取20只出生后4-5周的tetO-EGFR

S602、通过在三组小鼠的饮用水中加入终浓度为2mg/ml的强力霉素，开始在肺上皮细胞中特异诱导EGFR

S603、在连续饮用含有强力霉素的水14天后，其中一组小鼠除继续饮用强力霉素外，还通过腹腔注射的方式向小鼠中注射5mg/kg的BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189，连续注射14天；

S604、其中一组小鼠除继续饮用强力霉素外，还通过腹腔注射的方式向小鼠中注射 5mg/kg的BMPs-BMPRs axis抑制剂DMH1，连续注射14天；

S605、末次给药后2天，处死小鼠，并取出小鼠肺组织，在4％的多聚甲醛固定过夜后，进行石蜡包埋，然后通过苏木精-伊红染色法对小鼠肺肿瘤进行染色。

如附图9所示，在注射BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189或者DMH1后，小鼠肺肿瘤的生长被明显抑制。

实施例7

本实施例是在上述实施例1的基础上进行的，与实施例1相同之处不予赘述。

本实施例介绍BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189和DMH1抑制人EGFR突变肺癌细胞系的生长。

本实施例具体步骤如下：

S701、将PC9细胞系以每孔1000个细胞铺到96孔板中，将细胞分为3组，吉非替尼处理组，LDN-193189组和DMH1组；

S702、细胞过夜培养后换液；

S703、在各组中加入对应浓度的抑制剂；

S704、在加入抑制剂后72小时，进行CCK8增殖实验；

S705、在各细胞孔中加入10ul CCK8溶液，放入培养箱培养2小时后，通过酶标仪检测吸光度。

进一步的，步骤S703中，吉非替尼组抑制剂的浓度分别是0uM，0.25uM，0.5uM和1uM；LDN-193189组抑制剂的浓度分别是0uM，0.5uM，1uM和2.5uM；DMH1组抑制剂的浓度分别是0uM，0.5uM，1.25uM和2.5uM。

如附图10所示，BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189和DMH1可以直接抑制人 EGFR突变肺癌细胞系的生长，这表明BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189和DMH1 不仅可以调控肿瘤微环境的变化，来抑制肿瘤的生长，同时也可以直接调控肿瘤细胞的生长。

实施例8

本实施例是在上述实施例7的基础上进行的，与实施例7相同之处不予赘述。

本实施例介绍BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189和DMH1抑制EGFR靶向药耐药后的人EGFR突变肺癌细胞系的生长。

本实施例具体步骤如下：

S801、将H1975细胞系以每孔1000个细胞铺到96孔板中，将细胞分为3组，吉非替尼处理组，LDN-193189组和DMH1组；

S802、细胞过夜培养后换液；

S803、在各组中加入对应浓度的抑制剂；

S804、在加入抑制剂后72小时，进行CCK8增殖实验；

S805、在各细胞孔中加入10ul CCK8溶液，放入培养箱培养2小时后，通过酶标仪检测吸光度。

进一步的，所述步骤S803中，吉非替尼组抑制剂的浓度分别是0uM，0.01uM，0.025uM， 0.1uM，0.5uM和2uM；LDN-193189组抑制剂的浓度分别是0uM，0.025uM，0.1uM，0.5uM， 2uM和8uM；DMH1抑制剂的组浓度分别是0uM，0.025uM，0.1uM，0.5uM，2uM和 8uM。

如附图11所示，BMPs-BMPRs axis抑制剂LDN-193189和DMH1可以直接抑制EGFR 靶向药耐药后的人EGFR突变肺癌细胞系的生长，这表明BMPs-BMPRs axis抑制剂 LDN-193189和DMH1可以用于EGFR靶向药耐药后的人EGFR突变肺癌患者治疗。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，其并非因此限制本发明的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，通过常规的替代或者能够实现相同的功能在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行变化、修改、替换、整合和参数变更均落入本发明的保护范围内。