一种十字花科作物种子的真菌分生孢子丸粒化包衣剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种十字花科作物种子的真菌分生孢子丸粒化包衣剂及其应用，属于生物农药技术领域。

背景技术

十字花科作物具有很高的经济价值，在全世界范围普遍大面积种植，但在生产中，该类作物受黄曲条跳甲、根肿病、软腐病、根结线虫等土传有害生物的为害。因大量施用化学农药防治该类有害生物，造成十字花科作物产量降低和品质下降的同时，引起了环境污染和病虫害再猖獗，而发展生物防治技术是十字作物可持续生产的客观需求。绿僵菌、白僵菌、棒束孢菌等昆虫病原真菌在防治黄曲条跳甲方面具有很大潜力，而木霉菌、淡紫紫孢菌等植物病原拮抗菌在防治根肿病、软腐病和根结线虫可发挥更大作用。

种子包衣技术是一项可信赖的作物幼苗期保护技术，具有效果好、用药量少及环境友好等优点，因而得到了广泛应用。然而，包衣技术也有其局限性，一是包衣剂对农药的选用比较严格，要求持效期较长的内吸剂；二是，包被较薄且药量较少，对于微小型种子难以达到理想的病虫害防治效果。因此，种子包衣技术往往难以适用于十字花科作物种子的真菌农药应用。

种子丸粒化技术克服了包衣技术的某些不足，其包被更厚，适用的药剂更多，适用作物种子更广，特别是适用于微小型种子。因此，种子丸粒化技术近年来进步很快，应用规模也逐年扩大，然而真菌生物农药的丸粒化技术研究报告却相当少见，目前只有2项专利：专利申请号CN201910124557.9公开了一种微生物种子丸粒化包衣组合物，声称适用于枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、假单胞杆菌、固氮菌、绿僵菌、白僵菌、玫烟色拟青霉菌、苏云金芽孢杆菌中的一种或多种微生物，但其提供的试验数据是非常初步的；专利申请号CN201811571839.5公开了一种种子丸粒化用粉剂、水剂及种子丸粒化工艺方法，但未涉及微生物技术。

另外，有少数专利涉及到微生物种衣剂技术，专利申请号CN201510326292.2公开了一种球孢白僵菌种衣剂及其制备方法，申请号CN201611258370.0公开了一种木霉真菌种衣剂及其制备方法，申请号CN201610794628.2公开了一种木霉菌种衣剂及其制备方法和应用，申请号CN201410498112.4公开了苜蓿种子根瘤菌种衣剂及其应用，申请号CN201110306008.7也公开了一种木霉真菌种衣剂及其制备方法。然而，种衣剂与种子丸粒化是两回事，其技术要求大不相同，所要求的药剂与辅助剂各不相同，适用的种子也不一致，包衣剂难以适用于十字花科等作物微小型种子的真菌分生孢子丸粒化技术。

本发明提供一种十字花科作物种子的真菌分生孢子丸粒化配方，将其加工成丸粒化种子应用于防治土传性病虫害。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种十字花科作物种子的真菌分生孢子丸粒化包衣剂。

本发明的另一目的是提供所述十字花科作物种子的真菌分生孢子丸粒化包衣剂在防治土传性病虫害方面的应用，尤其是用于防治黄曲条跳甲、根肿病和根结线虫等重要病虫害。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种十字花科作物种子的真菌分生孢子丸粒化包衣剂，其包括真菌分生孢子、填料和十字花科作物种子，所述真菌分生孢子、所述填料和所述十字花科作物种子的质量比为2-30:400-900:100-300。优选地，所述真菌分生孢子、所述填料和所述十字花科作物种子的质量比为5-20:600-800:200。

本发明所述真菌分生孢子包括绿僵菌Metarhizium、白僵菌Beauveria、棒束孢菌Isaria、紫孢菌Purpureocillium及木霉菌Trichoderma的分生孢子纯粉中的至少一种。

本发明所述填料包括滑石粉、黏土、凹凸棒土、硅藻土中的至少一种。优选地，所述填料包括滑石粉和黏土，所述滑石粉与所述黏土混合的质量比为1-2:1-2；或者所述填料包括滑石粉和凹凸棒土，所述滑石粉与所述凹凸棒土混合的质量比为1:1；或者所述填料包括滑石粉和硅藻土，所述滑石粉与硅藻土混合的质量比为1:1-2。

本发明所述十字花科作物种子包括菜心、白菜、油菜、甘蓝或萝卜类作物的种子。

另一方面，本发明提供所述十字花科作物种子的真菌分生孢子丸粒化包衣剂在防治土传性病虫害方面的应用。所述十字花科作物种子的真菌分生孢子丸粒化包衣剂应用于加工生产十字花科作物的丸粒化种子，保护十字花科作物的芽期和幼苗期，免受黄曲条跳甲、根肿病及根结线虫等土传病虫害的为害。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的十字花科作物种子的真菌分生孢子丸粒化包衣剂，其组分均为天然材料，不污染环境，病虫兼治，对土传性病虫害如黄曲条跳甲、根肿病及根结线虫高效；还解决了现有技术中的包衣剂难以适用于微小型种子(如十字花科作物的种子)的问题。

附图说明

图1为本发明提供的真菌分生孢子丸粒化油绿702菜心种子；其中，图1A为无孢子丸粒化CK；图1B、图1C、图1D、图1E、图1F分别为金龟子绿僵菌MaGX19S02菌株、爪哇棒束孢菌IjH6102菌株、淡紫紫孢菌PlSC59A3菌株、球孢白僵菌BbGDPs01菌株和哈茨木霉菌ThSCAU01菌株分生孢子2.5g丸粒化种子(200g种子与800g填料)。

图2为本发明提供的真菌分生孢子丸粒化油绿702菜心种子的发芽势检测结果；其中，图2A为裸种CK；图2B为无孢子丸粒化CK；图2C、图2D、图2E、图2F、图2G分别为MaGX19S02、IjH6102、PlSC59A3、BbGDPs01、ThSCAU01菌株分生孢子2.5g丸粒化种子(200g种子与800g填料)。

图3为本发明提供的真菌分生孢子丸粒化油绿702菜心种子的发芽率检测结果；其中图3A为裸种CK；图3B为无孢子丸粒化CK；图3C、图3D、图3E分别为IjH6102菌株分生孢子2.5g、5.0g和10g丸粒化种子；图3F、图3G、图3H、图3I分别为MaGX19S02、PlSC59A3、BbGDPs01、ThSCAU01菌株分生孢子2.5g丸粒化种子(200g种子与800g填料)。

图4为本发明提供的丸粒化菜心种子对黄曲条跳甲的室内防效试验结果；图4中前左1为裸种CK；前左2-4为IjH6102菌株分生孢子2.5g/5.0g/10g丸粒化种子(200g种子与800g填料)；前左4-5为MaGX19S02菌株分生孢子5.0g/10.0g丸粒化种子(200g种子与800g填料)；前右1为无孢子丸粒化CK。

图5为本发明提供的丸粒化菜心种子对黄曲条跳甲的田间防效试验(播种后7天)；其中图5A为试验地全貌；图5B为MaGX19S02菌株分生孢子10.0g丸粒化种子(200g种子与800g填料)；图5C为IjH6102菌株分生孢子10.0g丸粒化种子(200g种子与800g填料)；图5D为无孢子丸粒化CK；图5E为裸种CK。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：本发明所述的真菌分生孢子丸粒化包衣剂中填料的筛选

1.1.不同填料对真菌分生孢子萌发率的影响

实验方法：(1)将供试的金龟子绿僵菌M.anisopliae菌株MaGX19S02、爪哇棒束孢I.javanica菌株IjH6102、淡紫紫孢菌P.linacinum菌株PlSC59A3、球孢白僵菌B.bassiana菌株BbGDPs01和哈茨木霉T.harzianum菌株ThSCAU01斜面菌种的分生孢子接种于PDA平板上，26℃下培养2周，收获分生孢子，用0.05％的无菌吐温80溶液悬浮，将孢子悬浮液接种于PD培养液中，26℃下揺瓶培养1-2天得种子液，再接种于大米培养基上，塑料袋中固体发酵1-2周，用孢子分离器分离收集得分生孢子，冷冻干燥并检测质量，得分生孢子纯粉备用。

(2)将分生孢子纯粉10毫克与市售400目硅藻土、凹凸棒土、滑石粉、黏土及蛭石粉各2克均匀混合，室温下放置1周，取10毫克孢子填料混合物用10毫升无菌吐温80溶液均匀悬浮，取0.1毫升接种于水琼脂平板上，培养24小时，检测孢子萌发率。重复3次，以分生孢子纯粉为对照。

实验结果：如表1，硅藻土、凹凸棒土、滑石粉和黏土对五种真菌的分生孢子萌发率没有影响，而蛭石粉造成分生孢子萌发率降低。

表1填料对真菌分生孢子萌发率的影响

1.2.不同填料丸粒化对菜心种子活力的影响

将前述1.1中填料按一定比例混合，对菜心(油绿702)种子进行丸粒化包被，丸粒化过程如下：

(1)使用德国Niklas公司W.N.5-01种子包衣机，开启丸化机低速档进行包衣丸化；

(2)将适量水滴入载锅润湿种子，盖上机盖，将转速调至600转/分；

(3)将填料与真菌分生孢子纯粉由进料口均匀地加进旋转锅中，盖上进料口盖；

(4)从进水口加入适量水(水粉比为1:5)，经由进水口滴入高速转台雾化后均匀喷于载锅内种子上；

(5)保持载锅旋转2分钟，使种子与材料以及水分充分均匀接触；

(6)重复第3步，第4步，第5步，直至种子在不停地转动中愈滚愈大至填料加完；

(7)丸粒化后的种子经出料口放出，放入振动筛中，筛出过大过小的种子；

(8)经过筛后的种子放入烘干机中，在30～35℃条件下烘干。然后检测丸粒化种子的品质，封装保存备用。

种子活力测定：依照国标和行业标准《粮油检验发芽试验(GB/T 5520-2011)》和《农药对作物安全性评价准则.第1部分：杀菌剂和杀虫剂对作物安全性评价室内试验方法(NY/T1965.1－2010)》进行。根据下式计算发芽势与发芽率：

实验结果如表2所示，滑石粉与黏土以1-2:1-2的质量比、滑石粉与凹凸棒土以1:1的、滑石粉与硅藻土以1:1-2的质量比混配，其对菜心种子的影响较小；当滑石粉与黏土混合填料以1:2-3的种料比、滑石粉与凹凸棒土混合填料以1:2的种料比、滑石粉与硅藻土混合填料以1:2-4的种料比，其对菜心种子的影响较小。

表2填料丸粒化对菜心(油绿702)种子活力的影响

注：发芽势为处理后2天结果；发芽率为处理后7天结果；CK为空白对照。

1.3.不同填料丸粒化对其他十字花科作物种子活力的影响

取上述1.2实验中表现最好的7个填料组合，继续对其他十字花科作物种子进行丸粒化处理，实验方法同1.2。

实验结果如表3所示：结果表明，供试7种填料的丸粒化处理对真甜236增城迟菜心、超级春雪萝卜、福祥黄心白菜、翠美芥兰和陕油803油菜的种子活力没有不良影响。

表3填料丸粒化对十字花科作物种子活力的影响

实施例2：本发明所述的真菌分生孢子丸粒化包衣剂中真菌分生孢子纯粉用量的筛选

实验方法：以滑石粉和硅藻土(质量比为1:2)为填料，取填料800克分别与一定量的金龟子绿僵菌M.anisopliae菌株MaGX19S02、爪哇棒束孢I.javanica菌株IjH6102、淡紫紫孢菌P.linacinum菌株PlSC59A3、球孢白僵菌B.bassiana菌株BbGDPs01和哈茨木霉T.harzianum菌株ThSCAU01的分生孢子纯粉均匀混合，按照1.2所述过程丸粒化200g油绿702菜心种子。参照国标GB 20287-2006《农用微生物菌剂》检测纯孢粉质量(表4)，参照国标《烟草包衣丸化种子(GB/T 25240-2010)》检测丸粒化种子质量。

实验结果：结果表明(表5，图1，图2，图3)，真菌分生孢子丸粒化的菜心种子质量达到标准，用5-20克纯孢粉加滑石粉:硅藻土(1:2)填料800克，丸粒化200克菜心种子，对真菌孢子与菜心种子活力都没有影响。

表4真菌纯孢粉质量检测结果

表5真菌分生孢子丸粒化油绿702菜心种子质量检测结果*

*滑石粉:硅藻土(1:2)填料800克，种子200克

实施例3：本发明所述的真菌分生孢子丸粒化菜心种子的药效试验

3.1.室内条件下对黄曲条跳甲的防效试验

实验方法：在直径为9㎝的培养皿里铺上已经灭菌的营养土，每皿播种50粒实施例2所述的真菌分生孢子丸粒化菜心种子，待种子刚发芽时罩上网罩，每笼分别接入黄曲条跳甲成虫4、8或12头，于接虫后第3天、第5天每个处理随机选取10株幼苗调查被害情况，记录并计算叶片受害指数。实验重复3次，以无菌丸粒化种子和裸种为对照。

实验结果：结果表明，金龟子绿僵菌MaGX19S02菌株和爪哇棒束孢IjH6102菌株分生孢子丸粒化菜心种子，对黄曲条跳甲具有较好的防治效果，MaGX19S02分生孢子5.0g和10.0g处理，在接虫后3天的受害指数显著低于对照；IjH6102分生孢子5.0g和10.0g处理，在接虫后3天和5天时的受害指数显著低于对照(表6，图4)。

0级：无被害状；

1级：叶片上有零星被害状；

3级：叶片上有三分之一以下面积被害；

5级：叶片上有三分之一或至二分之一面积被害；

7级：叶片上有二分之一至三分之二面积被害；

9级：叶片上有三分之二以上面积被害。

受害指数(％)＝∑(各级苗数×相对受害级别值)/调查总苗数×9×100

表6丸粒化菜心种子对黄曲条跳甲的防效

3.2.防治黄曲条跳甲的田间药效试验

实验方法：为了进一步考察本发明所述的真菌分生孢子丸粒化菜心种子对黄曲条跳甲的防治效果，于2020年10月，在华南农业大学实验农场进行了田间试验，采用随机区组试验设计，设5个处理，以无孢子丸粒化和裸种为对照，小区面积5m

实验结果：结果表明，金龟子绿僵菌MaGX19S02菌株分生孢子用量5.0和10.0g和爪哇棒束孢IjH6102菌株分生孢子用量5.0和10.0g丸粒化的菜心种子，在播种后7天和14天的受害指数显著低于对照，说明其对黄曲条跳甲具有显著的田间防治效果(表7，图5)。

表7丸粒化菜心种子对黄曲条跳甲的田间防效

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。