利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法。

背景技术

多倍体育种是园艺植物种质创新的重要手段之一。对于梨品种而言，多倍体品种的果实普遍比二倍体大、且果实品质优良、抗逆性强。果树的自发芽变是现有多倍体品种的重要来源，但芽变育种仍存在很多缺点。如自发芽变时突变细胞与野生细胞的伴生发育，容易形成嵌合体且嵌合类型难以控制，因此导致突变性状不稳定和突变性状容易丢失。这种不稳定性不仅制约了芽变选种的发展，其导致的优秀突变性状和特殊种质资源流失也是育种工作的一大损失。

发明内容

本发明为解决背景技术中存在的技术问题，而提供一种利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法，可以简单、短时、高效的从梨嵌合多倍体中分离、纯化出多倍体植株。

本发明的技术解决方案是：本发明为一种利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法，其特殊之处在于：该方法包括以下步骤：

1)外植体的建立；

1.1)外植体的获得：以梨花器官作为外植体来源；

1.2)外植体的消毒；

1.3)外植体的预培养：将梨子房接种在PIM培养基上预培养；

2)体细胞胚诱导成苗：将预培养的子房在无菌条件下转移至IM培养基上培养，诱导体细胞胚分化成苗；

3)幼苗的倍性鉴定：选择健康叶片，利用解离液解离细胞后，用细胞流式仪鉴定倍性；

4)幼苗的扩繁。

优选的，步骤1.1)中选择嵌合多倍体梨9712为材料；选择梨盛花期前7天(具体日期视当年物候条件而定以未开花的花蕾和子房为建立外植体的材料。

优选的，步骤1.2)的具体步骤如下：将采摘的梨子房在25℃，清水冲洗6小时；用70％酒精摇晃消毒30秒；无菌水涮洗30秒，重复4次；用15％次氯酸钠消毒20分钟，期间摇晃4次；最后用无菌水涮洗30秒，重复4次。

优选的，步骤1.3)中PIM培养基的具体配方为：基本元素：1/2QL培养基(现有的商业化培养基)的大量和微量元素，补充24mg/LEDTA螯合铁、250mg/L硝酸钾，97mg/L七水合硫酸镁，407mg/L硝酸铵；激素：0.2mg/LIBA；碳源：30g/L蔗糖。

优选的，步骤1.3)中预培养条件具体为：25摄氏度，暗培养4天。

优选的，步骤1.3)中接种方式具体为：在无菌的超净台中将无菌的花蕾连同下部的子房沿径向一切为二，露出花药和胚珠，切去多余花梗后，切割面朝下贴在培养基上。

优选的，步骤2)中IM培养基的具体配方为：基本元素：1/2QL培养基(现有的商业化培养基)的大量和微量元素，补充24mg/LEDTA螯合铁、250mg/L硝酸钾，97mg/L七水合硫酸镁，407mg/L硝酸铵，2.2mg/LTDZ；激素：0.2mg/LIBA；碳源：30g/L蔗糖。

优选的，步骤2)中诱导体细胞胚分化成苗的培养条件具体为：25摄氏度，暗培养60天，培养30天后更换新的IM培养基。

优选的，步骤4)的具体步骤如下：在幼苗培养4周后，选择生长势健壮的组培苗，切除植株下部愈伤组织和多余的叶片，保留植株上半部约2～3cm，移入MS培养基中继代和培养，培养温度为25±2℃，光照培养，光源为日光灯，光照强度2000lx，光周期16h。

本发明具有以下优点：

1、采用全新的诱导配方：本发明重新选择培养基的元素配比、激素浓度组合，调整暗培养时间，使不经授粉的未成熟胚珠和花药直接发育成新的植株。

2、采用全新的外植体分离纯化多倍体：本发明利用植物胚珠和花药的细胞全能性和基因型来源的单一性，直接利用胚珠和花药获得基因型单一的再生植株。经细胞流式仪检测，再生植株全部为二倍体或四倍体，没有嵌合体的出现。

具体实施方式

本发明具体实施例的方法包括以下步骤：

1)外植体的建立；

1.1)外植体的获得：以梨花器官作为外植体来源；择嵌合多倍体梨9712为材料；选择梨盛花期前7天(具体日期视当年物候条件而定)以未开花的花蕾和子房为建立外植体的材料。

1.2)外植体的消毒：将采摘的梨子房在25℃，清水冲洗6小时；用70％酒精摇晃消毒30秒；无菌水涮洗30秒，重复4次；用15％次氯酸钠消毒20分钟，期间摇晃4次；最后用无菌水涮洗30秒，重复4次。

1.3)外植体的预培养：将梨子房接种在PIM培养基上预培养；PIM培养基的具体配方为：基本元素：1/2QL培养基(现有的商业化培养基)的大量和微量元素，补充24mg/LEDTA螯合铁、250mg/L硝酸钾，97mg/L七水合硫酸镁，407mg/L硝酸铵；激素：0.2mg/LIBA；碳源：30g/L蔗糖；预培养条件具体为：25摄氏度，暗培养4天；接种方式具体为：在无菌的超净台中将无菌的花蕾连同下部的子房沿径向一切为二，露出花药和胚珠，切去多余花梗后，切割面朝下贴在培养基上。

2)体细胞胚诱导成苗；将预培养的子房在无菌条件下转移至IM培养基上培养，诱导体细胞胚分化成苗；IM培养基的具体配方为：基本元素：1/2QL培养基(现有的商业化培养基)的大量和微量元素，补充24mg/LEDTA螯合铁、250mg/L硝酸钾，97mg/L七水合硫酸镁，407mg/L硝酸铵，2.2mg/LTDZ；激素：0.2mg/LIBA；碳源：30g/L蔗糖；诱导体细胞胚分化成苗的培养条件具体为：25摄氏度，暗培养60天，培养30天后更换新的IM培养基。

3)幼苗的倍性鉴定：选择健康叶片，利用解离液解离细胞后，用细胞流式仪鉴定倍性。

4)幼苗的扩繁：在幼苗培养4周后，选择生长势健壮的组培苗，切除植株下部愈伤组织和多余的叶片，保留植株上半部约2～3cm，移入MS培养基中继代和培养，培养温度为25±2℃，光照培养，光源为日光灯，光照强度2000lx，光周期16h。

经本发明的利用梨再生体系从嵌合多倍体中分离纯化多倍体的方法得到的再生植株，通过细胞流式仪检测，再生植株全部为二倍体或四倍体，没有嵌合体的出现。

本发明内容及上述实施例中未具体叙述的技术内容同现有技术。

本发明不限于上述实施例，本发明内容所述均可实施并具有所述良好效果。

以上，仅为本发明公开的具体实施方式，但本发明公开的保护范围并不局限于此，本发明公开的保护范围应以权利要求的保护范围为准。