一种用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的口腔微生物基因标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种区别自身免疫性肝炎和健康人群的口腔微生物基因标志物及其应用。

背景技术

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是由免疫系统介导的一种慢性、非特异性的肝脏炎症。流行病学统计显示，中国自免肝发病率高达20/100000，北欧白人年平均发病率为1.07～1.9/100000。其病因与多种遗传和环境因素有关，但尚未完全阐明。长期未经治疗的自身免疫性肝炎会增加肝硬化和/或肝细胞癌(HCC)的风险，且肝硬化失代偿期常见的顽固性腹水、上消化道出血等多种并发症的死亡率很高，对我国人民健康构成严重威胁，因此快速、及时的诊断自身免疫性肝炎是非常重要的。尽管自身免疫性肝炎的诊断标准已经基本确定且得到验证，但仍然有一部分非典型自身免疫性肝炎难以达到明确诊断，包括自身抗体变异所致的自身抗体阴性的AIH、药物诱导的AIH、重叠综合征(OS)以及移植后AIH。此外，自身免疫性肝炎诊断的金标准是肝组织活检，这种有创的诊断方法目前尚未被广大患者及其家属完全接受。因此，建立区别自身免疫性肝炎和健康人群的无创诊断模型，实现自身免疫性肝炎的早期、无创诊断，对于自身免疫性肝炎的早期发现、早期诊断和早期治疗具有重大意义。

口腔微生态系统与健康和疾病密切相关。众所周知，口腔微生物菌群失调不仅会导致口腔疾病，例如龋齿、牙周炎、口腔粘膜疾病，还会涉及全身性疾病，包括胃肠系统疾病，例如炎性肠病、肝硬化、胰腺癌，神经系统疾病，例如阿尔茨海默氏病，内分泌系统性疾病，例如糖尿病、多囊卵巢综合征，免疫系统疾病，例如类风湿关节炎和心血管系统疾病，例如动脉粥样硬化。

人类微生物组中关健功能菌可成为人类疾病的新型生物标志物。基于肠道微生物组建立疾病诊断模型已经在多个疾病中广泛应用，Qin J等率先使用宏基因组学报道了肠道微生态与2型糖尿病的相关性，指出23个菌种可能成为区分2型糖尿病的肠道微生物标志物。Qin N,Li A等(2014年Nature杂志)通过宏基因组测序技术解析了中国人群肝硬化患者肠道微生态结构，在微生物基因和功能水平上，鉴定了肝硬化特异性的15个标记物，创建了一个高准确度的肝硬化患者区分指数。口腔微生态的特征或者基于口腔微生物建立的区别模型作为特定疾病或肿瘤的区分工具正越来越多被广泛报道和认可。Cui J等对78名胃炎患者和50名健康个体进行研究，提出口腔微生态可以作为胃炎及其癌前病变的无创标志物。Lu H,指出2个菌属(原细菌属和梭菌属)可能成为区分肝癌的口腔微生物标志物，这是基于口腔微生物组建立的无创诊断模型。因而，口腔微生物可能是不同疾病诊断的有力工具。然而，用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的口腔微生物模型还未曾报道过。

发明内容

本发明提供了一种用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的口腔微生物基因标志物，由SEQ ID NO:1-5所示的5种微生物基因组成，所述微生物基因在人体口腔中明显富集。

SEQ ID NO:1-5所示的5种微生物基因的序列如下：

>OTU412

CCTACGGGTGGCTGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGgggAAACCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAAGGAAGAAGTATCTCGGTATGTAAACTTCTATCAGCAGGGAAGATAGTGACGGTACCTGACTAAGAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGgggCAAGCGTTATCCGGATTTACTGGGTGTAAAGGGAGCGTAGACGGTGTGGCAAGTCTGATGTGAAAGGCATGGGCTCAACCTGTGGACTGCATTGGAAACTGTCATACTTGAGTGCCGGAGGGGTAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGACGGTAACTGACGTTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCGAGTAGTC

>OTU277

CCTACGGGTGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGgggAAACCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGTGAAGAAGTATTTCGGTATGTAAAGCTCTATCAGCAGGGAAGATAATGACAGTACCTGACTAAGAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGgggCAAGCGTTATCCGGATTTACTGGGTGTAAAGGGAGCGTAGACGGAATGGCAAGTCTGAAGTGAAATACCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCTTTGGAAACTGTTGTTCTAGAGTGTTGGAGAGGTAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCGGAGGCGAAGGCGGCTTACTGGACAATAACTGACGTTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTAGTAGTC

>OTU315

CCTACGGGTGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCGTCAGGGAACAAGGCACTGTCTTtttGGTGGTGTTGAGGGTACCTGGATAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTGGTCGCGTCTGTCGTGAAAACTTCCGGCTCAACCGGgggCTTGCGGTGGGTACGGGCCGGCTAGAGTGCGGTAGGGGTAACTGGAACTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAAGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTTACTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTAGTAGTC

>OTU42

CCTACGGGTGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGAGAGCCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGCAGGAAGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTATACGGGAATAAAGTTTGCCACGTGTGGCATTTTGCATGTACCGTAAGAAaaaGGATCGGCTAATTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAAGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGAGCGTAGGCGGGAATCCAAGTCAGTTGTGAAACCCTGCGGCTCAACCGTAGTCGTGCAGTTGAAACTGGATTTCTTGAGTGCGCACAGGGCAGACGGAATTTGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCCGATCGCGAAGGCAGTCTGCCGGGGCGCTACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTGCGGGTATCAAACAGGATTAGATACCCTAGTAGTC

>OTU484

CCTACGGGTGGCTGCAGTCGAGAATCATTCACAATGGgggAAACCCTGATGGTGCGACGCCGCGTGGgggAATGAAGGTCTTCGGATTGTAAACCCCTGTCATGTGGGAGCAAATTAAaaaGATAGTACCACAAGAGGAAGAGACGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGTCTCAAGCGTTGTTCGGAATCACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCTGTTTCGTAAGTCGTgtgtgAAAGGCGCGGGCTCAACCCGCGGACGGCACATGATACTGCGAGACTAGAGTAATGGAGGgggAACCGGAATTCTCGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATCGAGAGGAACACTCGTGGCGAAGGCGGGTTCCTGGACATTAACTGACGCTGAGGCACGAAGGCCAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCGAGTAGTC

另外本发明还提供了一种用于检测试剂，包括用于检测SEQ ID NO:1-5所示的5种微生物基因的引物。所述引物序列为SEQ ID NO:6-7，引物序列如下：

引物Primers

测序区域V3+V4：338F-806R

上游引物：338F ACTCCTACGGGAGGCAGCA

下游引物：806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT

本发明还提供了检测试剂在建立一种区别自身免疫性肝炎和健康人群的口腔微生物试剂盒中的应用，所述检测试剂适用于检测SEQ ID NO:1-5所示的5种微生物基因。

所述微生物区别模型适用于区别自身免疫性肝炎患者和健康人群。

对所述对象的唾液进行检测，以便确定该样本是否包含所述的微生物基因，是否可以建立区别自身免疫性肝炎和健康人群的微生物基因模型。

通过收集入组对象的唾液样本，抽提微生物总DNA，完成微生物DNA的16S rDNAMiseq测序，检测是否存在权利要求1所述的5种微生物基因。

进一步的，通过收集入组对象的唾液样本，抽提微生物总DNA，进行口腔菌群的16SrDNA Miseq测序。基于高通量测序数据，建立自身免疫性肝炎和健康人群的微生物区别模型，建立自身免疫性肝炎患病率(probability of disease，POD)指数；POD指数可用于计算其区别能力，进行验证。进一步在来自不同地域的独立诊断集中进行独立验证，实现微生物基因区别模型在中国自身免疫性肝炎人群中的普适性。

具体包括：

(1)收集入组对象(自身免疫性肝炎患者和健康人群)的唾液样本，按照DNA的标准抽提方法完成唾液样本中微生物总DNA的抽提，在Illumina MiSeq平台完成口腔菌群的16SrDNA高通量测序工作；

(2)基于高通量测序数据，在微生物区别模型的队列中，在46例自身免疫性肝炎和92例健康人之间，基于一个随机森林模型，通过一个五倍交叉验证的算法，鉴定了用于该模型的最佳的5个微生物基因标志物。

(3)基于5个微生物基因标志物，通过使用随机生成的决策树的比率来计算自身免疫性肝炎的患病率(Probability of disease,POD)指数。

(4)该微生物区别模型在46例自身免疫性肝炎患者和92例健康人之间的区别能力达到99.88％，POD指数在自身免疫性肝炎患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.001)。

(5)在验证集中，该微生物区别模型在22例自身免疫性肝炎患者和44例健康对照之间的区别能力达到100.00％；POD指数在自身免疫性肝炎患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)。

(6)在独立诊断集中，该微生物区别模型在12例来自杭州的自身免疫性肝炎患者的区别能力达到95.55％；POD指数在自身免疫性肝炎患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)。

因此，本发明的微生物基因区别模型在自身免疫性肝炎和健康人群中实现了良好的区别能力。也验证了该区别模型在中国不同地域中的可行性、适用性和普适性。

另外，还提供了一种用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的口腔微生物模型的试剂盒，包括用于检测权利要求1所述的SEQ ID NO:1-5所示的5种微生物基因的引物。

本发明的具体操作步骤如下：

(1)按照前瞻性临床试验的设计原则，本发明的研究设计如图1所示。该研究方案得到了郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准。所有入组的患者签署研究方案知情同意书和临床样本收集知情同意书。

(2)每一个入组的自身免疫性肝炎患者和健康人提供一份新鲜的唾液样本，研究实验人员将样本按照每份500ul的体积分装成10份，并立即冻存于-80℃冰箱。唾液细菌总DNA的抽提方法按照试剂盒的说明书进行。

(3)完成唾液细菌总DNA样本的扩增和DNA文库构建，在IlluminaMiseq测序平台完成16S rDNA测序。所有的输出序列完成基本的预处理和基本的生物信息学分析。

(4)从所有样本中随机抽选等量的序列数，按照UPARSE传递途径拼接成对应的16SrDNA基因序列分类单元(Operational Taxonomy Units,OTUs)，将产生的所有样本的OTUs基因序列收集整理。基于微生物基因序列，使用RDP分类器2.6版本注释。

(5)基于高通量测序数据产生的代表性序列，计算出微生物基因标志物的OTUs频率文件。这些OTUs用于一个相关性研究来鉴定在自身免疫性肝炎患者和健康人群之间的OTUs丰度。使用Wilcoxon检验方法统计分析自身免疫性肝炎患者和健康人群之间差异的微生物基因标志物。

(6)在微生物区别模型的训练集中，包括46例自身免疫性肝炎患者和92例健康人，使用筛选出的OTUs丰度文件，在一个随机森林模型(R软件3.4.1和随机森林软件包4.6–12)中采用五倍交叉验证的算法(除了设置“importance＝TRUE”之外，软件参数默认)进行微生物基因标志物的筛选。采用五倍交叉验证的5次试验，获得了交叉验证错误曲线，其中最小的交叉验证错误点作为cut-off值使用。最小的交叉验证错误值加上对应值的标准差为cut-off值。筛选出小于cut-off值的错误率的5个以下的OTUs标志物的集合，选择最小数目OTUs的集合作为最佳的微生物基因标志物的集合，最终鉴定了用于该模型的最佳的5个微生物基因标志物(图2)。选择出的5个微生物OTUs标志物的基因序列见SEQ ID NO:1-5。

(7)通过使用随机生成的决策树的比率来计算患病率(Probability of disease,POD)指数。决策树预测样本为“AIH”，设置的参数预测为：proximity＝T,norm.votes＝T,predict.all＝TRUE。在LOO模式中构建的随机森林模型用于预测队列中每一个样本的POD指数，最终计算每一个样本的平均预测的POD指数。

(8)使用R 3.3.0程序包中的pROC工具计算受试者工作曲线(ROC)，用来评估微生物区别模型，曲线下面积(AUC)用于指定ROC的效应值。

(9)该微生物区别模型在46例自身免疫性肝炎和92例健康人群之间的区别能力达到99.88％(图3)，POD指数在肝癌患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图4)。

(10)在验证集中，POD指数在22例自身免疫性肝炎中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图5)，该微生物区别模型在22例自身免疫性肝炎和44例健康对照之间的区别能力达到100.00％(图6)。

(11)在独立诊断集中，POD指数在来自杭州地区的12例自身免疫性肝炎中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图5)，该微生物区别模型在在12例来自杭州的自身免疫性肝炎的区别能力达到95.55％(图7).

因此，本发明的微生物基因区别模型在自身免疫性肝炎和健康人群中实现了良好的区别能力，也验证了该区别模型在中国不同地域中的可行性、适用性和普适性。

附图说明

图1.一种用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的口腔微生物模型的研究设计和应用。

图2.基于随机森林模型采用五倍交叉验证法鉴定的最佳的口腔微生物基因标志物。

图3.在46例自身免疫性肝炎和92例健康人群的队列中，患病率(POD)指数在两组之间的表达差异；

图4.在46例自身免疫性肝炎和92例健康人群的队列中，微生物基因区别模型实现的区别效能；

图5.在验证集和独立诊断集中，与44例健康对照人群相比，患病率(POD)指数在22例自身免疫性肝炎和12例杭州自身免疫性肝炎样本的表达差异；

图6.在验证集中，患病率(POD)指数在44例健康对照和22例早期肝癌之间的区别能力；

图7.在独立诊断集中，患病率(POD)指数对12例来自杭州的自身免疫性肝炎的区别能力；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明的保护内容不仅限于这些实施例。

下列实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。下列实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为公开商业途径获得。

本发明通过收集入组对象的唾液样本，抽提微生物总DNA，进行口腔菌群的16SrDNA Miseq测序。基于高通量测序数据，在训练集中建立自身免疫性肝炎和健康人群的微生物区别模型，建立自身免疫性肝炎患病率(probability of disease，POD)指数；POD指数可用于计算其区别能力，进行验证；进一步在来自不同地域的独立诊断集中进行独立验证，实现微生物基因区别模型在中国肝癌人群中的普适性。

其操作步骤如下：

(1)按照前瞻性临床试验的设计原则，本发明的研究设计如图1所示。该研究方案得到了郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准。所有入组的患者签署研究方案知情同意书和临床样本收集知情同意书。

(2)每一个入组的自身免疫性肝炎患者和健康人提供一份新鲜的唾液样本，研究实验人员将样本按照每份500ul的体积分装成10份，并立即冻存于-80℃冰箱。唾液细菌总DNA的抽提方法按照试剂盒的说明书进行。

(3)完成唾液细菌总DNA样本的扩增和DNA文库构建，在IlluminaMiseq测序平台完成16S rDNA测序。所有的输出序列完成基本的预处理和基本的生物信息学分析。

(4)从所有样本中随机抽选等量的序列数，按照UPARSE传递途径拼接成对应的16SrDNA基因序列分类单元(Operational Taxonomy Units,OTUs)，将产生的所有样本的OTUs基因序列收集整理。基于微生物基因序列，使用RDP分类器2.6版本注释。

(5)基于高通量测序数据产生的代表性序列，计算出微生物基因标志物的OTUs频率文件。这些OTUs用于一个相关性研究来鉴定在自身免疫性肝炎患者和健康人群之间的OTUs丰度。使用Wilcoxon检验方法统计分析自身免疫性肝炎患者和健康人群之间差异的微生物基因标志物。

(6)在微生物区别模型的队列中，包括46例自身免疫性肝炎患者和92例健康人，使用筛选出的OTUs丰度文件，在一个随机森林模型(R软件3.4.1和随机森林软件包4.6–12)中采用五倍交叉验证的算法(除了设置“importance＝TRUE”之外，软件参数默认)进行微生物基因标志物的筛选。采用五倍交叉验证的5次试验，获得了交叉验证错误曲线，其中最小的交叉验证错误点作为cut-off值使用。最小的交叉验证错误值加上对应值的标准差为cut-off值。筛选出小于cut-off值的错误率的5个以下的OTUs标志物的集合，选择最小数目OTUs的集合作为最佳的微生物基因标志物的集合，最终鉴定了用于该模型的最佳的5个微生物基因标志物(图2)。选择出的5个微生物OTUs标志物的基因序列见SEQ ID NO:1-5。

(7)通过使用随机生成的决策树的比率来计算患病率(Probability of disease,POD)指数。决策树预测样本为“AIH”，设置的参数预测为：proximity＝T,norm.votes＝T,predict.all＝TRUE。在LOO模式中构建的随机森林模型用于预测每一个样本的POD指数，最终计算每一个样本的平均预测的POD指数。

(8)使用R 3.3.0程序包中的pROC工具计算受试者工作曲线(ROC)，用来评估微生物区别模型，曲线下面积(AUC)用于指定ROC的效应值。

(9)该微生物区别模型在37例自身免疫性肝炎和78例健康人群之间的区别能力达到83.25％(图4)，POD指数在自身免疫性肝炎患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.001)(图3)。

(10)在验证集中，POD指数在22例自身免疫性肝炎中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图5)，该微生物区别模型在22例自身免疫性肝炎和44例健康对照之间的区别能力达到100.00％(图6)。

(11)在独立诊断集中，POD指数在来自杭州地区的12例自身免疫性肝炎中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图5)，该微生物区别模型在在12例来自杭州的自身免疫性肝炎的区别能力达到95.55％(图7).

因此，本发明的微生物基因区别模型在自身免疫性肝炎和健康人群中实现了良好的区别能力，也验证了该区别模型在中国不同地域中的可行性、适用性和普适性。

序列表

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 一种用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的口腔微生物基因标志物及其应用

<130> 20-212069-00015465

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 440

<212> DNA

<213> 口腔微生物( oral microflora)

<400> 1

cctacgggtg gctgcagtgg ggaatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagcgacgc 60

cgcgtgaagg aagaagtatc tcggtatgta aacttctatc agcagggaag atagtgacgg 120

tacctgacta agaagccccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggggc 180

aagcgttatc cggatttact gggtgtaaag ggagcgtaga cggtgtggca agtctgatgt 240

gaaaggcatg ggctcaacct gtggactgca ttggaaactg tcatacttga gtgccggagg 300

ggtaagcgga attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagat attaggagga acaccagtgg 360

cgaaggcggc ttactggacg gtaactgacg ttgaggctcg aaagcgtggg gagcaaacag 420

gattagatac ccgagtagtc 440

<210> 2

<211> 440

<212> DNA

<213> 口腔微生物( oral microflora)

<400> 2

cctacgggtg gcagcagtgg ggaatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagcgacgc 60

cgcgtgagtg aagaagtatt tcggtatgta aagctctatc agcagggaag ataatgacag 120

tacctgacta agaagccccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggggc 180

aagcgttatc cggatttact gggtgtaaag ggagcgtaga cggaatggca agtctgaagt 240

gaaatacccg ggctcaacct gggaactgct ttggaaactg ttgttctaga gtgttggaga 300

ggtaagtgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgtagat atcaggaaga acaccggagg 360

cgaaggcggc ttactggaca ataactgacg ttgaggctcg aaagcgtggg gatcaaacag 420

gattagatac cctagtagtc 440

<210> 3

<211> 460

<212> DNA

<213> 口腔微生物( oral microflora)

<400> 3

cctacgggtg gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc 60

cgcgtgaggg atgaaggcct tcgggttgta aacctctttc gtcagggaac aaggcactgt 120

ctttttggtg gtgttgaggg tacctggata agaagcgccg gctaactacg tgccagcagc 180

cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg 240

cggctggtcg cgtctgtcgt gaaaacttcc ggctcaaccg ggggcttgcg gtgggtacgg 300

gccggctaga gtgcggtagg ggtaactgga actcctggtg tagcggtgga atgcgcagat 360

atcaggaaga acaccgatgg cgaaggcagg ttactgggcc gttactgacg ctgaggagcg 420

aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctagtagtc 460

<210> 4

<211> 460

<212> DNA

<213> 口腔微生物( oral microflora)

<400> 4

cctacgggtg gcagcagtga ggaatattgg tcaatgggcg agagcctgaa ccagccaagt 60

agcgtgcagg aagacggccc tatgggttgt aaactgcttt tatacgggaa taaagtttgc 120

cacgtgtggc attttgcatg taccgtaaga aaaaggatcg gctaattccg tgccagcagc 180

cgcggtaata cggaagatcc gagcgttatc cggatttatt gggtttaaag ggagcgtagg 240

cgggaatcca agtcagttgt gaaaccctgc ggctcaaccg tagtcgtgca gttgaaactg 300

gatttcttga gtgcgcacag ggcagacgga atttgtggtg tagcggtgaa atgcttagat 360

atcacgaaga actccgatcg cgaaggcagt ctgccggggc gctactgacg ctgaggctcg 420

aaagtgcggg tatcaaacag gattagatac cctagtagtc 460

<210> 5

<211> 446

<212> DNA

<213> 口腔微生物( oral microflora)

<400> 5

cctacgggtg gctgcagtcg agaatcattc acaatggggg aaaccctgat ggtgcgacgc 60

cgcgtggggg aatgaaggtc ttcggattgt aaacccctgt catgtgggag caaattaaaa 120

agatagtacc acaagaggaa gagacggcta actctgtgcc agcagccgcg gtaatacaga 180

ggtctcaagc gttgttcgga atcactgggc gtaaagcgtg cgtaggctgt ttcgtaagtc 240

gtgtgtgaaa ggcgcgggct caacccgcgg acggcacatg atactgcgag actagagtaa 300

tggaggggga accggaattc tcggtgtagc agtgaaatgc gtagatatcg agaggaacac 360

tcgtggcgaa ggcgggttcc tggacattaa ctgacgctga ggcacgaagg ccaggggagc 420

gaaagggatt agatacccga gtagtc 446

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actcctacgg gaggcagca 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggactachvg ggtwtctaat 20