本申请要求于2018年2月2日提交的美国临时申请第62/625,763号的权益和优先权，所述美国临时申请的主题通过引用并入本文。
本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且在此通过引用以其整体并入。所述ASCII副本创建于2019年1月17日，被命名为RVT-801-006WO_SL.txt并且大小为11,363字节。
背景技术
作为溶酶体贮积症(LSD)，法伯病(Farber disease)是一种于1952年首次描述的出现在一名14个月大的婴儿中的病状，所述婴儿在多个关节上出现肉芽肿病变并且具有脂质贮藏的迹象。在随后的十年中，描述了其它类似的病例，所有这些病例均展现出类似的病变，并且由于喉部上存在病变而通常表现出特征性“嘶哑”的哭声或声音。还注意到这些患者中的一些患者中出现其它器官系统受累，所述其它器官系统包含肺、肝、脾和中枢神经系统(CNS)。
先前，对法伯病患者的治疗一直是症状性的并且主要目的是减轻疼痛。仅在有限数量的患者中进行了造血干细胞移植(HSCT)，并且总体上如果移植程序本身是成功的，那么结果就是积极的。成功移植的患者表现出疼痛显著减轻、运动力和活动力增加并且在一些情况下皮下结节缩小并且完全消退。然而，成功移植需要组织相容性供体细胞，并且使患者暴露量侵入性和潜在危险的免疫抑制方案中。HSCT的一种替代方案是基因治疗，在所述基因治疗中，用表达治疗性蛋白质的载体对自体供体细胞进行转导，从而避免了对组织相容性供体的需要。此方法已在法伯病敲入小鼠模型中进行了评估，并且导致组织神经酰胺减少以及巨噬细胞浸润。然而，仍然需要用于治疗法伯病的改进疗法。
先前在重度法伯病的鼠模型中进行的研究已经确立了针对重组人酸性神经酰胺酶(“rhAC”)的广泛治疗剂量范围，其中功效是基于蓄积组织神经酰胺的减少和促炎性细胞因子的减少表征的。于2018年1月12日提交(于2018年7月18日以WO 2018/132667发布)的国际申请第PCT/US18/13509号中以及在以下中的公开在此通过引用以其整体并入：He等人,2017年(2月),“法伯病的酶替代疗法：在细胞和小鼠中的概念验证研究(Enzymereplacement therapy for Farber disease:Proof-of-concept studies in cells andmice)”《BBA临床(BBA Clin.)》13(7):85-96。
然而，这些研究没有确立暴露目标。根据在重度法伯病的鼠模型中的非临床研究期间确定的治疗剂量对人体等效剂量(HED)的预测需要了解酶的药代动力学(“PK”)和组织分布(“TD”)。如本发明所讨论的，本发明主题满足此类需求。
发明内容
幼年、健康CD-1小鼠被视为法伯小鼠的亲本菌株(本说明书和实例中使用的法伯病小鼠模型)。图3示出了幼年CD-1小鼠rhAC(RVT-801)药代动力学概况与循环中的法伯小鼠实验rhAC活性概况类似。这表明，幼年CD-1小鼠提供了法伯小鼠PK的适当近似值，并且如此，使用了CD-1小鼠以表征RVT-801的鼠药代动力学，因为法伯小鼠法伯小鼠虚弱、难以交配并且并未多到足以进行完全PK评估。
因此，基于法伯小鼠的较少数量并且在菌株之间具有有限重叠数据点，本文说明书和实例中报告的数据表明CD-1小鼠体内的全身rhAC(例如，RVT-801)暴露量与法伯小鼠体内类似，并且可以代表在腹膜内施用的单个剂量的RVT-801之后法伯小鼠体内的rhAC最低全身水平。
重组人AC(例如，RVT-801)在说明书和实例中已被示出为广泛分布于与法伯病鼠模型中的神经酰胺蓄积相关联的组织(例如，肝、脾和肺)中。因此，对重组人AC(例如，RVT-801)的全身水平的测量可能潜在地会低估患有法伯病的人类受试者的相关组织中的暴露量。因此，依赖于简单的异速生长将非临床物种的剂量缩放到人类可能无法提供对用于赋予功效的组织暴露量的充足估计。
基于美国食品药品管理局(United States Food&Drug Administration)(“FDA”)对非临床物种与人类之间的缩放剂量的指导的人体等效剂量(HED)估计基于身体表面积(“BSA”)(美国卫生与公众服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，美国食品药品管理局，药品评价和研究中心(Center for Drug Evaluation and Research(CDER))，2005年，《行业指导，估计在用于成人健康志愿者中的治疗的初始临床试验中的最大安全起始剂量(Guidance for Industry.Estimating the Maximum Safe Starting Dose inInitial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)》”第1-30页)，其通过引用以其整体在此并入。然而，本文描述的HED估计方法还考虑了生理因素，所述生理因素包含但不限于从脉管系统到组织的主要清除机制。
本说明书中报告的小鼠体内的数据表明，肝和脾是用于在全身施用后摄取RVT-801的主要目标组织。
HED可以通过将BSA缩放与小鼠和人中的组织质量与身体重量(“BW”)的比率组合而得出。以此方式，可能得出剂量缩放因子，所述剂量缩放因子解决了每个物种中重组人AC(RVT-801)分布的每个隔室的相对大小。使用BSA的经过组合的HED估计和组织:BW策略呈现于表1中。
表1：经过组合的BSA-和基于组织:身体重量的HED估计，从10mg/kg小鼠剂量(MED)开始缩放
根据说明书和实例，在一个实施例中，提供了一种治疗患有法伯病的人类成人受试者的方法，所述方法包括以约0.8mg/kg的剂量向所述人类受试者施用重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)。
还在一个实施例中提供了一种治疗患有法伯病的人类儿童的方法，所述方法包括以约1.2mg/kg的剂量向所述儿童施用重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)。
还在一个实施例中提供了一种治疗患有法伯病的人类儿童的方法，所述方法包括以约2mg/kg的剂量向所述儿童施用重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)。
还在一个实施例中提供了一种治疗患有法伯病的人类儿童的方法，所述方法包括以约5mg/kg的剂量向所述儿童施用重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)。
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述人类受试者施用治疗有效剂量的重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内引起以下中的一项或多项：约0.25小时到1.0小时的T
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内引起以下的比率大于1：AUC
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内引起小鼠体内的以下中的一项或多项：AUC
在不受理论束缚的情况下，据信rhAC(RVT-801)到这些组织中的分布对于药物治疗的整体有效性是重要的。
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内引起约0.25小时到1.0小时的T
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内引起约1.23μg/mL到2.17μg/mL的C
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内引起约1.37hr*μg/mL到1.49hr*μg/mL的AUC。
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中根据图7所示的值，所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在组织或基质中引起C
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在肝组织中引起约138hr*μg/mL的AUC
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在肝组织中引起约13μg/mL的药物C
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在脾组织中引起约70.9hr*μg/mL的AUC
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在脾中引起约7.58μg/mL的药物C
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在肾组织中引起约25.8hr*μg/mL的AUC
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在肾组织中引起约2.61μg/mL的药物C
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在心脏组织中引起约4.01hr*μg/mL的AUC
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在心脏组织中引起约0.362μg/mL的药物C
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在大脑组织中引起约0.0419hr*μg/mL的AUC
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在大脑中引起约0.147μg/mL的C
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在血液中引起约0.858hr*μg/mL的AUC
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在血液中引起约1.23μg/mL的药物C
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述人类受试者施用治疗有效剂量的重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，所述单个最大有效剂量在BALF中提供了约0.000245hr*μg/mL的AUC
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在BALF中引起约0.00196μg/mL的药物C
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在肺组织中引起约8.4hr*μg/mL的AUC
在一些实施例中，一种治疗患有法伯病的人类受试者的方法可以包括向所述受试者施用治疗有效剂量的rhAC，所述治疗有效剂量可以基于在腹膜内接受单个最大有效剂量(“MED”)10mg/kg剂量的rhAC(即，RVT-801)的幼年、健康CD-1小鼠体内获得的药代动力学概况确定，其中所述rhAC在所述健康CD-1小鼠体内在肺组织中引起约1.42μg/mL的药物C
另外的目的和优点将在下面的描述中进行部分阐述，并且部分将通过描述而清楚，或者可以通过实践本公开进行了解。这些目的和优点将通过所附权利要求中特别指出的元素和组合来实现和获得。
应当理解的是，前述总体说明以及以下详细说明都仅仅是示例性和说明性的，并不限制权利要求。
并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图示出一个(几个)实施例，并且与描述一起用于解释本文所述的原理。
附图说明
图1示出了根据实例1的在以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的剂量单个注射RVT-801之后的与用RVT-801治疗的法伯病小鼠年龄匹配的健康的幼年CD-1小鼠体内的血清RVT-801水平的时间进程。
图2列出了根据实例1的在以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的剂量单个注射RVT-801之后的健康的幼年CD-1小鼠体内的血清RVT-801的药代动力学指标。
图3示出了根据实例1的在以10mg/kg的剂量单个注射RVT-801之后的健康的年龄匹配的CD-1小鼠血清中的RVT-801浓度以及法伯病小鼠的血浆中的rhAC活性，这示出了法伯小鼠与年龄匹配的亲本CD-1菌株小鼠的药代动力学概况之间具有可比较性。
图4示出了根据实例2的在以10mg/kg的剂量单个注射血清RVT-801之后的健康的幼年CD-1小鼠的血清和各种组织(肝、脾、肾、心脏、肺和大脑)中RVT-801浓度的时间进程。
图5A示出了根据实例2的在以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的剂量单个注射RVT-801之后的健康的幼年CD-1小鼠的肝脏组织中RVT-801浓度的时间进程。
图5B示出了根据实例2的在以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的剂量单个注射血清RVT-801之后的健康的幼年CD-1小鼠的脾脏组织中RVT-801浓度的时间进程。
图6A比较了根据实例2的在以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的剂量单个注射血清RVT-801之后的健康的幼年CD-1小鼠的血清、全血、肝组织提取物和脾组织中的AUC
图6B示出了根据实例2的根据在以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的剂量单个注射RVT-801之后的健康的幼年CD-1小鼠的血清、连同肝组织和脾组织中的RVT-801浓度计算出的AUC
图7示出了根据实例2的根据在以10mg/kg的剂量单个注射RVT-801之后的健康的幼年CD-1小鼠的血清、全血和各种组织提取物(肝、脾、肾、肺、心脏、大脑、支气管肺泡灌洗液(BALF))中的RVT-801浓度计算出的C
图8示出了根据实例2的在以10mg/kg的剂量单个注射RVT-801之后的健康的幼年CD-1小鼠的各种组织中AUC
图9示出了根据实例3的在法伯小鼠体内按身体表面积(BSA)缩放的根据MED估计的相对于蓄积神经酰胺在肝和脾中的10mg/kg的减少的人体等效剂量(HED)。
图10示出了根据实例3的按组织与体重的比率缩放的根据法伯小鼠体内的10mg/kg的MED估计的相对于蓄积神经酰胺在肝和脾中的减少的组织特异性HED。
图11示出了根据实例3的(1)基于BSA的HED计算和(2)基于组织与身体重量比率的HED计算两者的结果。
图12示出了本申请中的RVT-801的HED的实施例与经过批准的酶替代疗法(ERT)的剂量的比较。
图13示出了在RVT-801的单个或重复每周一次10mg/kg剂量之后，法伯小鼠的肝、脾和肾中的平均rhAC浓度-时间数据。
图14示出了关于在RVT-801的单个10mg/kg剂量之后，健康的年龄匹配的CD-1小鼠体内的rhAC血清浓度和法伯小鼠体内的酸性神经酰胺酶血浆活性的数据。
图15示出了在RVT-801的单个10mg/kg剂量之后，健康的幼年CD-1小鼠体内的最终rhAC组织:血清AUC的比率。
图16示出了在向CD-1小鼠和法伯小鼠单个IP丸剂注射10mg/kg的RVT-801之后，循环中的rhAC。
图17示出了，在向CD-1小鼠和法伯小鼠单个丸剂IP注射10mg/kg的RVT-801之后，循环和关键组织中的rhAC浓度。
图18A-E呈现了在单个丸剂IP注射10mg/kg的RVT-801(n＝3/时间点)之后，肝(图18A)、脾(图18B)、肾(图18C)、肺(图18D)和心脏(图18E)(法伯((非实心符号)和年龄匹配的CD-1(实心符号)小鼠)中的单个rhAC浓度-时间数据。
图19A-G呈现了根据实例5的在通过丸剂IP注射施用的单个10mg/kg剂量或以10mg/kg/剂量的RVT-801的多个剂量(每周一次)之后，在法伯小鼠(非实心符号)和年龄匹配的CD-1小鼠(实心符号)中的循环(图19A)、肝(图19B)、脾(图19C)、肾(图19D)、心脏(图19E)、肺(图19F)和大脑(图19G)组织中的平均rhAC浓度。
图20A和20B分别示出了在RVT-801-9013 B部分(线性图20A和对数线性图20B)中对幼年CD-1小鼠进行IP施用之后的平均rhAC组织浓度-时间曲线。
图21呈现了在对幼年CD-1小鼠进行1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的RVT-801单次给药之后，基于AUC
图22A-D呈现了在幼年的CD-1小鼠体内以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的剂量IP施用RVT-801之后，各种组织的所绘制的剂量归一化AUC对剂量水平。
序列说明
表2：本文参考的某些序列的列表。
具体实施方式
如本文所用，术语“一个(a)”或“一种(an)”意指“至少一个”或“一个或多个”，除非上下文另外明确指定。
如本文所用，术语“约”意味着数值是近似的，并且小的变化不会明显影响所公开的实施例的实践。在使用数值限制时，除非上下文另外指出，否则“约”意味着数值可以变化±10％并且保持处于所公开的实施例的范围内。
如本文所用，“酸性鞘磷脂酶活性”或“ASM活性”是指与AC紧密结合并且与其共纯化的相关脂质水解酶(Bernardo,K.、R.Hurwitz、T.Zenk、R.J.Desnick、K.Ferlinz、E.H.Schuchman和K.Sandhoff,1995,“人酸性神经酰胺酶的纯化、表征和生物合成(Purification,characterization,and biosynthesis of human acid ceramidase)”,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，270:11098-11102)。
如本文所用，术语“动物”包含但不限于人和非人脊椎动物，如野生动物、家养动物和农场动物。所述动物也可以被称为“受试者”。
如本文所用，术语“载剂”意指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂或赋形剂。药物载剂可以是液体，如水和油，包含石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物载剂也可以是生理盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。另外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。
如本文所用，“儿童”是指从新生到18岁的年龄。
如本文所用，术语“包括(comprising)”(和任何形式的包括，如“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprised)”)、“具有(having)”(和任何形式的具有，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包含(including)”(和任何形式的包含，如“包含(includes)”和“包含(include)”)或“含有(containing)”(和任何形式的含有，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包容性的或开放性的并且不排除另外的未列举的元素或方法步骤。另外，与术语“包括”结合使用的术语也被理解为能够与术语“由……组成”或“基本上由……组成”结合使用。
如本文所用，术语“暴露量”意指在体外系统或体内系统中将两个元素放在一起。例如，使rhAC多肽“暴露量”个体、受试者或细胞包含向个体或患者(如人)施用多肽，以及例如将化合物引入到含有细胞制剂或经过纯化的制剂(含有多肽)的样品中。另外，暴露量可以指代用编码多肽的核酸分子转染或感染细胞。
如本文所用，“法伯小鼠(Farber mouse和Farber mice)”、“法伯病小鼠(Farberdisease mice和Farber disease mouse)”意指重度法伯病小鼠模型(Asah1
递送给受试者的酶的“有效量”是足以改善法伯病的临床进程的量，其中临床改善通过技术人员众所周知的各种所定义参数测量。
如本文所用，可互换地使用的术语“受试者”、“个体”或“患者”意指任何动物，包含哺乳动物，如小鼠、大鼠、其它啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物，如人。
如本文所用，短语“有需要”意指已将受试者标识为对特定方法或治疗有需要。在一些实施例中，所述标识可以通过任何诊断方式。在本文所描述的任何方法和治疗中，受试者可能有需要。
如本文所用，短语“从X到Y的整数”意指包含端点的任何整数。例如，短语“从1到5的整数”表示1、2、3、4或5。
如本文所用，术语“所分离”意指本文所述描的化合物如过常规技术与以下中的任一个的其它组件分离：(a)天然来源，如植物或细胞，或(b)合成有机化学反应混合物。
如本文所用，术语“哺乳动物”意指啮齿动物(即，小鼠、大鼠或豚鼠)、猴、猫、狗、牛、马、猪或人。在一些实施例中，所述哺乳动物是人。
如本文所用，短语“药学上可接受的”意指在合理医学判断的范围内适用于与人和动物的组织暴露量的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。在一些实施例中，“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其它公认的药典中列出的用于动物并且特别用于人类。
如本文所用，术语“血清”意指任何血液衍生的基质，包含但不限于“血清”、“血浆”或“全血”。
如本文所用，短语“基本上分离”意指与其所形成或检测的环境至少部分地或基本上分离的化合物。
如本文所用，短语“治疗有效量”意指引起研究人员、兽医、医疗医生或其他临床医师寻找的组织、系统、动物、个体或人中的生物应答或药物应答的活性化合物或药剂的量。治疗效果取决于所治疗的病症或所期望的生物效果。如此，治疗效果可以是与病症相关联的症状的严重性降低和/或病症的进展的抑制(部分或完全)，或改进的治疗、治愈、病症或副作用的预防或消除。引起治疗应答所需的量可以基于受试者的年龄、健康的尺寸和性别确定。还可以基于对受试者对治疗的应答的监测确定最佳量。
可以使用技术人员已知的任何方法监测疾病状态和治疗的有效性。疾病状态的临床监测可以包含但不限于神经酰胺水平、重量、关节长度、炎症或已知与法伯病相关联的任何其它临床表型。
如本文所用，术语“治疗”、“被治疗”，或“正在治疗”意指治疗性治疗和防病措施，其中目的是减缓(减轻)不期望的生理状况、病症或疾病，或获得有益或期望的临床结果。例如，有益或期望的临床结果包含但不限于症状减轻；病状、病症或疾病的范围减小；病状、病症或疾病的状态稳定(即，不恶化)；病状、病症或疾病进展的发作延迟或减缓；病状、病症或疾病改善或缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测还是不可检测的；不一定可由患者分辨出的至少一个可测量物理参数的改善；或病状、病症或疾病的改善或改进。因此，“法伯病的治疗”或“治疗法伯病”意指减轻或改善与法伯病相关联的主要现象或次要症状或本文所述的其它病状的活动。
应进一步理解，本文所描述的、为了清楚起见在单独实施例的上下文中描述的某些特征也可以在单个实施例中以组合形式提供。相反，为简洁起见在单个实施例的上下文中描述的各种特征也可以单独提供或以任何适当的子组合提供。
在一些实施例中，提供了治疗法伯病的方法。在一些实施例中，受试者是有需要的受试者。在一些实施例中，有需要的受试者被诊断患有法伯病。在一些实施例中，受试者还被标识为具有：1)皮下结节；2)白血细胞、所培养的皮肤成纤维细胞或其它生物来源(例如，血浆)中的小于对照值的30％的酸性神经酰胺酶活性值；和/或3)酸性神经酰胺酶基因(ASAH1)的两个等位基因内的通过生物信息学、基因表达研究和/或其它方法表明酸性神经酰胺酶蛋白的功能可能丧失的核苷酸变化。在一些实施例中，所述方法包括以约0.1mg/kg到约50mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约0.8mg/kg的有效量向人类成人受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1.2mg/kg的有效量向人类儿童施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1mg/kg到约5mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。
在一些实施例中，提供了减少患有或怀疑患有法伯病的受试者中的脂肪肉芽肿的方法。在一些实施例中，受试者是有需要的受试者。在一些实施例中，所述方法包括以约0.1mg/kg到约50mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约0.8mg/kg的有效量向人类成人受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1.2mg/kg的有效量向人类儿童施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1mg/kg到约5mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。
在一些实施例中，提供了降低患有或怀疑患有法伯病的受试者中的绝对或归一化脾重量的方法。在一些实施例中，受试者是有需要的受试者。在一些实施例中，所述方法包括以约0.1mg/kg到约50mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约0.8mg/kg的有效量向人类成人受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1.2mg/kg的有效量向人类儿童施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1mg/kg到约5mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。
在一些实施例中，提供了降低患有或怀疑患有法伯病的受试者中的神经酰胺水平的方法。在一些实施例中，受试者是有需要的受试者。在一些实施例中，所述方法包括以约0.1mg/kg到约50mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约0.8mg/kg的有效量向人类成人受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1.2mg/kg的有效量向人类儿童施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1mg/kg到约5mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。
降低神经酰胺也可以指减少神经酰胺或增加神经酰胺的代谢，这将导致神经酰胺水平降低。
在一些实施例中，提供了提高患有或怀疑患有法伯病的受试者中的鞘氨醇水平的方法。在一些实施例中，受试者是有需要的受试者。在一些实施例中，所述方法包括以约0.1mg/kg到约50mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约0.8mg/kg的有效量向人类成人受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1.2mg/kg的有效量向人类儿童施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1mg/kg到约5mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9,g/kg或10mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。
本文描述了各种药物组合物，并且所述药物组合物可以基于患者和医生的偏好使用。然而，在一些实施例中，药物组合物是溶液。在一些实施例中，药物组合物包括细胞条件培养基，所述细胞条件培养基包括rhAC。如本文所用，术语“细胞条件培养基”是指已经用于培养表达rhAC的细胞并且其中将蛋白质分泌到培养基中并且然后从培养基中分离或纯化蛋白质的细胞培养基。在一些实施例中，所述培养基用于治疗受试者。例如，可以将培养基应用于受试者的皮肤以治疗本文所述的任何病状、症状或病症。
除了本文所述的施用途径外，在一些实施例中，药物组合物通过暴露量受试者的皮肤施用。在一些实施例中，施用是肠胃外施用。在一些实施例中，施用包括向受试者注射药物组合物。在一些实施例中，施用是腹膜内注射或静脉内注射。在一些实施例中，施用是口服施用。
在一些实施例中，提供了治疗有需要的受试者中的法伯病的方法，其中所述方法包括在细胞中表达重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)；从细胞中分离所表达rhAC；以及以约0.1mg/kg到约50mg/kg的有效量向受试者施用包括所分离所表达rhAC的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约0.8mg/kg的有效量向人类成人受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1.2mg/kg的有效量向人类儿童施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1mg/kg到约5mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。
在一些实施例中，提供了减少患有或怀疑患有法伯病的受试者中的脂肪肉芽肿的方法，所述方法包括在细胞中表达重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)；从细胞中分离所表达rhAC；以及以约0.1mg/kg到约50mg/kg的有效量向受试者施用包括所分离所表达rhAC的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约0.8mg/kg的有效量向人类成人受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1.2mg/kg的有效量向人类儿童施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1mg/kg到约5mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。
在一些实施例中，提供了包括治疗患有或怀疑患有法伯病的受试者中的脂肪肉芽肿病(现在为法伯病)的方法，所述方法包括在细胞中表达重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)；从细胞中分离所表达rhAC；以及以约0.1mg/kg到约50mg/kg的有效量向受试者施用包括所分离所表达rhAC的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约0.8mg/kg的有效量向人类成人受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1.2mg/kg的有效量向人类儿童施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1mg/kg到约5mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。
在一些实施例中，提供了降低患有或怀疑患有法伯病的受试者的脾重量(绝对或归一化身体重量)的方法，所述方法包括在细胞中表达重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)；从细胞中分离所表达rhAC；以及以约0.1mg/kg到约50mg/kg的有效量向受试者施用包括所分离所表达rhAC的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约0.8mg/kg的有效量向人类成人受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1.2mg/kg的有效量向人类儿童施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1mg/kg到约5mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。
在一些实施例中，提供了减少患有或怀疑患有法伯病的受试者中的神经酰胺的方法，所述方法包括在细胞中表达重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)；从细胞中分离所表达rhAC；以及以约0.1mg/kg到约50mg/kg的有效量向受试者施用包括所分离所表达rhAC的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约0.8mg/kg的有效量向人类成人受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1.2mg/kg的有效量向人类儿童施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1mg/kg到约5mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。
在一些实施例中，提供了增加患有或怀疑患有法伯病的受试者中的鞘氨醇的方法，所述方法包括在细胞中表达重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)；从细胞中分离所表达rhAC；以及以约0.1mg/kg到约50mg/kg的有效量向受试者施用包括所分离所表达rhAC的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约0.8mg/kg的有效量向人类成人受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1.2mg/kg的有效量向人类儿童施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约1mg/kg到约5mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括以约2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg的有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物。
在一些实施例中，在细胞中表达重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)包括将编码rhAC的载体转移到细胞中。在一些实施例中，载体包括编码rhAC的核酸分子。在一些实施例中，核酸分子是如本文所述的分子或编码rhAC多肽或其同源物的任何其它核酸分子，其在本文中进行了更详细的描述。在一些实施例中，载体为病毒载体。例如，载体可以是逆转录病毒载体或DNA病毒载体，如腺病毒、AAV等。在一些实施例中，载体为质粒。在一些实施例中，载体包括与rhAC可操作地连接的启动子。在一些实施例中，启动子为组成型启动子。在一些实施例中，启动子为SV40启动子、CMV启动子、EF1α启动子或其任何组合或在哺乳动物细胞为活性中的任何其它启动子。
在一些实施例中，载体被转染或感染到细胞中。在细胞中引入载体的方法不是关键的，并且可以使用任何方法提供rhAC多肽在细胞中的充分表达。
在一些实施例中，细胞为哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞不是人细胞。在一些实施例中，细胞为仓鼠细胞。在一些实施例中，细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施例中，细胞可以在无血清或基本上无血清的环境中生长。在一些实施例中，细胞衍生自CHO-K1细胞。在一些实施例中，细胞为鼠细胞。在一些实施例中，细胞为鼠骨髓瘤细胞。在一些实施例中，细胞为NS0细胞。在一些实施例中，施用的有效量如本文中在上文和下文所述。
在一些实施例中，药物组合物是如本文所述施用的。例如，在一些实施例中，组合物口服、通过吸入、通过鼻内滴注、局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉内注射、动脉内注射、肌内注射、胸膜内、腹膜内、鞘内或通过应用于粘膜而施用于受试者。
如本文所用，术语“rhAC”或“AC”是指由ASAH1基因(NCBI UniGene GeneID号：427)编码的重组人酸性神经酰胺酶。AC使连接鞘氨醇与脂质神经酰胺的脂肪酸部分的酰胺键水解(Park，J.-H.、Schuchman E.H.,2006,“酸性神经酰胺酶和人类疾病(Acid ceramidaseand human disease)”，《生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta.)》1758(12):2133-2138；Nikolova-Karakashian等人,2000,“神经酰胺酶(Ceramidases)”,《酶学方法(Methods Enzymol.)》311:194-201(2000)；Hassler等人,1993,“神经酰胺酶：酶学和代谢作用(Ceramidase:Enzymology and metabolic roles)”,《高级脂质研究(Adv.LipidRes.)》26:49-57)。两个ASAH1等位基因的突变均可能导致法伯病。
迄今为止对三种类型的神经酰胺酶进行了描述(Nikolova-Karakashian,2000)。所述神经酰胺酶根据其酶促活性最优的pH被分类为酸性、中性和碱性神经酰胺酶。AC在pH<5时具有最佳酶促活性。人AC是第一种被克隆的神经酰胺酶(Koch等人,1996,“编码人酸性神经酰胺酶的全长互补DNA的分子克隆和表征：对引起法伯病的第一分子病变的标识(Molecular Cloning and Characterization of a Full-length Complementary DNAEncoding Human Acid Ceramidase:Identification Of The First Molecular LesionCausing Farber Disease)”,《生物化学杂志》271:33110-33115)。其位于溶酶体中并且主要负责神经酰胺的分解代谢。由于遗传缺陷而导致的此酶的功能障碍导致被称为脂肪肉芽肿病或法伯病的鞘脂质代谢障碍病(Koch等人,1996，“编码人酸性神经酰胺酶的全长互补DNA的分子克隆和表征：对引起法伯病的第一个分子病变的标识”,《生物化学杂志》271:33110-33115，Young等人,2013,“鞘脂：凋亡与自噬之间的串扰的调节剂(Sphingolipids:regulators of crosstalk between apotosis and autophagy)”,《脂质研究杂志(J.Lipid.Res.)》54:5-19)。
已从几种来源中对AC(N-酰基鞘氨醇脱酰酶(N-acylsphingosine deacylase)，I.U.B.M.B.酶编号：EC 3.5.1.23)蛋白进行了纯化并且获得了人和小鼠cDNA以及基因。参见Bernardo等人,《生物化学杂志》270:11098-102(1995)；Koch等人,《生物化学杂志》2711:33110-5(1996)；Li等人,《基因组学(Genomics)》50:267-74(1998)；Li等人,《基因组学》62:223-31(1999)。所述AC蛋白是通过切割AC前体蛋白产生的(参见Ferlinz等人,《生物化学杂志》276(38):35352-60(2001))，所述AC前体蛋白是ASAH1基因的产物(NCBI UniGeneGeneID号：427)。AC蛋白[智人](NCBI登录号：AAC50907)在SEQ ID NO:1中示出。
ACα亚基开始于位置22处的氨基酸并且继续通过位置142(如序列表中的SEQ IDNO:1中以粗体示出的)，而AC的β亚基开始于位置143处的氨基酸并且继续通过位置395(如SEQ ID NO:1中以斜体示出的)。
如本文所用，“活性酸性神经酰胺酶”、“活性AC”或“呈活化形式的AC”或类似短语是指已经经过自我蛋白水解切割成为活性形式(由α-和β-亚基组成)的AC前体蛋白。人AC切割和活化的机制在(Shtraizent，N.、E.Eliyahu、J.H.Park、X.He、R.Shalgi和E.H.Schuchman,2008,“人酸性神经酰胺酶的自我蛋白水解切割和活化(Autoproteoprolytic cleavage and activation of human acid ceramidase)”,《生物化学杂志》,283(17):11253-11259)中进行了报道。活化还通过细胞内环境促进，并且基于跨物种的神经酰胺酶前体蛋白的切割位点处的高度保守序列，其预计将发生在大多数(即使不是全部)细胞类型中。
如本文所用，“非活性酸性神经酰胺酶”、“非活性AC”或“非活性酸性神经酰胺酶前体”、“非活性AC前体”或(AC前蛋白)是指未经过自我蛋白水解切割成为活性形式的AC前体蛋白。适用于本发明的此方面和所有方面的重组酸性神经酰胺酶的非活性AC前体和活性AC可以与组织、细胞和/或正在治疗的受试者同源(即，衍生自相同物种)或异源(即，衍生自不同物种)。酸性神经酰胺酶(例如，AC)前体蛋白经历了自我蛋白水解切割成为活性形式(由α和β亚基组成)。人AC切割和活化的机制在(Shtraizent,2008)中进行了报道。所述机制是通过细胞内环境促进的，并且基于跨物种的神经酰胺酶前体蛋白的切割位点处的高度保守序列，其预计将发生在大多数(即使不是全部)细胞类型中。因此，本文所用的神经酰胺酶包含活性神经酰胺酶和神经酰胺酶前体蛋白两者，其中神经酰胺酶前体蛋白通过自我蛋白水解切割转化为活性神经酰胺酶蛋白。设想了以下两者：由所关注的细胞占据前体蛋白并且因此将其转化为活性神经酰胺酶的实施例以及由不同细胞或药剂(存在于例如培养基中)将前体蛋白转化为活性神经酰胺酶的实施例。
可以用于本发明的此方面和所有方面的活性AC和非活性AC前体蛋白包含但不限于US 2016/0038574的表1中所示的那些，所述专利在此通过引用以其整体并入。
US 2016/0038574的表1(在此通过引用以其整体并入)
表1
在一些实施例中，rhAC包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
“RVT-801”是呈活化形式的用于治疗法伯病的重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)。活化rhAC的α和β亚基通过二硫键连接。分子是衍生自用表达rhAC的DNA质粒载体转染的CHO-M细胞的重组人酸性神经酰胺酶(rhAC)。RVT-801基于UniProtKB代码：Q13510。
RVT-801rhAC的治疗效果已在重度法伯病的鼠模型中确立(He等人,2017)，并且已在多项研究中用描述对组织病理学和免疫学结果的积极影响连同蓄积神经酰胺的伴随减少的端点进行表征。
在一些实施例中，rhAC是作为SEQ ID NO:1的同源物的蛋白质。在一些实施例中，rhAC由SEQ ID NO:2的核酸分子编码。在一些实施例中，rhAC由SEQ ID NO:3的核酸分子编码。在一些实施例中，rhAC由SEQ ID NO:4的核酸分子编码。在一些实施例中，序列如GenBank登录号NM_177924.3或NM_177924.4中定义的，所述登录号中的每一个均通过引用以其整体并入。编码蛋白质的核苷酸序列可以是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的完整序列，或者可以仅仅是序列的编码区。编码区例如可以是SEQ ID NO:2的核苷酸313到1500或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中发现的对应编码区。然而，如本领域的技术人员众所周知的，遗传密码是简并的，并且因此可以在不超出所公开内容的范围的情况下使用其它密码子编码同一蛋白质。由于氨基酸序列是已知的，因此编码所述氨基酸序列的任何核苷酸序列都是可以接受的。在一些实施例中，核苷酸序列包括信号肽。在一些实施例中，信号肽是由SEQ ID NO:2的核苷酸313到375编码的氨基酸序列。在一些实施例中，产生的蛋白质包括SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-21的信号肽。在一些实施例中，产生的蛋白质不包括信号肽，如SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-21的信号肽。在一些实施例中，信号肽在翻译后处理期间去除，在所述翻译后处理期间，酶被处理成其不同的亚基。在一些实施例中，针对蛋白质从中所表达的细胞，对核苷酸序列进行密码子优化。在一些实施例中，蛋白质包括α-亚基、β-亚基等。在一些实施例中，产生的蛋白质包括SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-142、45-139、134-379、143-395或1-395的肽。肽可以是单个蛋白质或不同序列的用于形成酶的多肽。在一些实施例中，蛋白质不含氨基酸残基1-21。这些区域可以由单个核苷酸序列或单独核苷酸序列或核苷酸序列的组合编码。如本文所讨论的，可以使用编码蛋白质的任何核苷酸序列，并且所述任何核苷酸序列不限于本文所描述的序列，如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。
在一些实施例中，rhAC具有酸性神经酰胺酶(AC)活性，但是不具有任何可检测酸性鞘磷脂酶活性，如在以下实例1和2中产生的rhAC。酸性鞘磷脂酶活性可以通过例如热灭活去除。热灭活也可以从rhAC制剂中除去其它污染蛋白质。参见，例如，美国专利申请公开第20160038574号，所述美国专利申请公开在此以其整体并入。
术语“同源物”是指与参考序列的序列同一性介于80％与100％之间的蛋白质序列。可以使用Vector NTI v.9.0.0(英杰公司(Invitrogen Corp.),加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carslbad,Calif.))的AlignX模块的默认设置，通过成对比对确定两条肽链之间的同一性百分比。在一些实施例中，同源物与本文所述的序列，如SEQ ID NO:1的同一性为至少或约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施例中，如与本文所述的序列相比，递送给受试者的蛋白质为保守取代。表3中示出的非限制示例性保守取代涵盖在所公开的主题的范围内。也可以进行取代以改善酶的功能，例如稳定性或酶活性。保守取代将产生具有与进行此类修饰的那些分子相似的功能特性和化学特性的分子。示例性氨基酸取代被示出在以下表3中。
表3：示例性保守取代：
如本文所用的术语“与……组合”意味着所描述的药剂可以以混合物的形式一起同时作为单一药剂或依序地作为单一药剂以任何顺序施用于受试者。
如本文所述，在一些实施例中，蛋白质是从细胞中产生的。在一些实施例中，细胞是中国仓鼠卵巢细胞，“CHO细胞”。编码本文所述的蛋白质的核酸序列可以是基因组DNA或cDNA，或编码本文所述的蛋白质中的至少一种蛋白质的RNA(例如，mRNA)。cDNA的使用需要将适合于宿主细胞的基因表达元件与基因结合，以实现所期望的蛋白质的合成。cDNA序列的使用可以优于基因组序列(其含有内含子)，因为cDNA序列可以在细菌或缺乏适当的RNA剪接系统的其它宿主中表达。本领域的技术人员可以确定表达蛋白质的最佳系统。
在一些实施例中，蛋白质是根据美国专利申请公开第20160038574号产生的，所述美国专利申请公开通过引用以其整体并入。
因为遗传密码是简并的，所以可以使用多于一个密码子编码特定氨基酸。使用遗传密码，可以标识一种或多种不同的寡核苷酸，所述寡核苷酸中的每种寡核苷酸将能够编码本文所述的氨基酸序列。
可以纯化施用于受试者以治疗法伯病或与其相关联的病状的酶。关于蛋白质的术语“经过纯化的”是指基本上不含与其天然环境中的分子相关联的其它材料的蛋白质。例如，经过纯化的蛋白质基本上不含来自其所衍生的细胞或组织的细胞材料或其它蛋白质。所述术语是指其中所分离蛋白质纯到足以进行分析或为以下的制剂：纯度为至少70％到80％(w/w)、纯度为至少80％-90％(w/w)、纯度为90％到95％、纯度为至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)。在一些实施例中，蛋白质从细胞，如但不限于CHO细胞中纯化。
施用、组合物和包括蛋白质的试剂盒
如本文所述，本文提供的实施例提供了治疗法伯病的方法。在一些实施例中，方法包括向患有法伯病或怀疑患有法伯病的受试者施用本文所述的治疗或预防有效量的一种或多种蛋白质。
受试者的治疗可以包括施用本文所述的治疗有效量的蛋白质。
蛋白质可以在本文所述的试剂盒中提供。
蛋白质可以单独或以与另外的治疗剂混合的形式使用或施用。另外的治疗剂的实例包含但不限于酸性鞘磷脂酶的抑制剂(例如，阿米替林(amitriptyline)(Becker等人,2010,“酸性鞘磷脂酶抑制剂使肺神经酰胺和囊肿性纤维化中的炎症正常化(AcidSphingomyelinase Inhibitors Normalize Pulmonary Ceramide and Inflammation inCystic Fibrosis)”,《美国呼吸细胞与分子生物学杂志(Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.)》,42:716-724，其在此通过引用以其整体并入)和神经酰胺合酶的抑制剂(例如，Shiffmann,S.、Hartmann,D.、Birod,K.、Ferreiròs,N.、Schreiber,Y.、Zivkovic,A.、Geisslinger,G.、
尽管酶替代疗法(ERT)可能是有效的，如当前针对法伯病的展示出神经酰胺蓄积减少的研究所示，但可以开发针对所述药物的抗体，即，可能降低其功效的替代酶。在此，已经显示出重复剂量耐受良好，这支持重复施用使疾病的症状减少的替代酶，尤其是根据本文以及例如美国专利申请公开第20160038574号中所描述的方法产生的酶的治疗方案。
在一些实施例中，在治疗有需要的受试者中的法伯病的方法包括以约每周一次、每2周、3周或4周一次或每月一次以有效量向受试者施用包括重组人酸性神经酰胺酶的药物组合物，持续约10周、约20周或约30周、1年、5年、10年或25年或患者的生命的存续时间。
适合的媒剂及其调配物和封装描述于例如《雷明顿：药学的科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》(第21版,Troy,D编辑,利平科特·威廉姆斯&威尔金斯公司(Lippincott Williams&Wilkins),马里兰州巴尔的摩(Baltimore,Md.)(2005)第40章和第41章)。可以采用另外的药物方法控制作用的持续时间。可以通过使用聚合物络合或吸收化合物来实现控释制剂。通过控释制剂控制作用的持续时间的另一种可能方法是将化合物并入到如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙基丙烯酸酯共聚物等聚合物材料的颗粒中。可替代地，除了将这些药剂并入到聚合物颗粒中之外，可能的是将这些材料分别包入通过例如界面聚合所制备的微胶囊中，例如羟乙基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)-微胶囊，或包入胶质药物递送系统中，例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊或粗乳液。
通常，如果施用蛋白质的全身剂量，则期望向接受者提供处于以下范围中的蛋白质的剂量：约1ng/kg-100ng/kg、100ng/kg-500ng/kg、500ng/kg-1μg/kg、1μg/kg-100μg/kg、100μg/kg-500μg/kg、500μg/kg-1mg/kg、1mg/kg-50mg/kg、50mg/kg-100mg/kg、100mg/kg-500mg/kg(接受者的体重)，但是可以施用更低或更高的剂量。
在一些实施例中，成人中的rhAC的人类剂量为约0.8mg/kg。在一些实施例中，儿童中的rhAC的人类剂量为约～1.2mg/kg。
在一些实施例中，施用的rhAC的有效量为约0.1mg/kg到约10mg/kg。在一些实施例中，有效量为约1mg/kg到约5mg/kg。在一些实施例中，有效量为约10mg/kg到约50mg/kg。在一些实施例中，有效量为约10mg/kg到约20mg/kg。在一些实施例中，有效量为约20mg/kg到约30mg/kg。在一些实施例中，有效量为约30mg/kg到约40mg/kg。在一些实施例中，有效量为约40mg/kg到约50mg/kg。在一些实施例中，有效量为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg。
剂量可以以每天一次、一天两次、一天三次、一天四次、每周一次、每周两次、每两周一次或每月一次施用。在一些实施例中，给药每周一次施用。在一些实施例中，给药每两周一次施用。治疗还可以以单个剂量时间表或多个剂量时间表给予，其中治疗的初级进程可以采用1-10次单独剂量，然后是维持和/或加强应答所需的在随后时间间隔给予的其它剂量，例如，每周一次持续1-4个月的第二剂量，以及根据需要，数月后的一个或多个随后剂量。适合的治疗方案的实例包含：(i)0个月、1个月和6个月，(ii)0天、7天和1个月，(iii)0个月和1个月，(iv)0个月和6个月，或足以引起期望减少疾病症状或降低疾病的严重度的所期望应答的其它时间表。也可以使用其它治疗时间表，如但不限于上述治疗时间表。
在本公开的某些方面，治疗在受试者为以下时开始：新生儿、年龄为1岁、2岁、3岁、4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9或10岁以下或年龄在1岁与2岁、3岁、4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9岁、10岁、25岁、50岁、60岁、70岁或80岁之间(例如，介于1岁与2岁之间、介于1岁与3岁之间等)。在一些实施例中，受试者介于16岁与61岁之间。在一些实施例中，受试者在年龄为16岁时开始治疗。在一些实施例中，受试者介于12岁与69岁之间。在一些实施例中，受试者在年龄为12岁时开始治疗。在一些实施例中，受试者介于19岁与74岁之间。在一些实施例中，受试者在年龄为19岁时开始治疗。在一些实施例中，受试者介于4岁与62岁之间。在一些实施例中，受试者在年龄为4岁时开始治疗。在一些实施例中，受试者介于7岁与42岁之间。在一些实施例中，受试者在年龄为7岁时开始治疗。在一些实施例中，受试者是新生儿。在一些实施例中，受试者介于1个月与6个月之间。在一些实施例中，受试者在年龄为1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月时开始治疗。在一些实施例中，受试者介于6岁与43岁之间。在一些实施例中，受试者在年龄为6岁时开始治疗。在一些实施例中，受试者介于5岁与31岁之间。在一些实施例中，受试者在年龄为5岁时开始治疗。在一些实施例中，受试者介于5岁与57岁之间。在一些实施例中，受试者介于5岁与29岁之间。在一些实施例中，受试者介于1岁与3岁之间。在一些实施例中，受试者在年龄为1岁时开始治疗。在一些实施例中，受试者介于10岁与70岁之间。在一些实施例中，受试者在年龄为10岁时开始治疗。在一些实施例中，受试者的年龄介于5岁与80岁之间、介于10岁与70岁之间、介于20岁与75岁之间、介于5岁与60岁之间或介于5岁与30岁之间。
在一些实施例中，以每两周约1mg/kg到约5mg/kg rhAC或约1mg/kg到约5mg/kgrhAC向诊断患有法伯病的受试者施用rhAC。在一个实施例中，在第4周时，剂量从1mg/kg或2mg/kg升高到5mg/kg。如果单个受试者不耐受剂量水平，则所述受试者的剂量可以从2mg/kg降低到1mg/kg或从5mg/kg降低到2mg/kg，视情况而定。rhAC可以每2周施用，持续至少10周、20周或30周或持续受试者的生命的存续时间。在一个实施例中，受试者被诊断患有法伯病并且被标识为具有：1)皮下结节；和/或2)白血细胞、所培养的皮肤成纤维细胞或其它生物来源(例如血浆)中的小于对照值的30％的酸性神经酰胺酶活性值；和/或3)酸性神经酰胺酶基因(ASAH1)的两个等位基因内的通过生物信息学、基因表达研究和/或其它方法表明酸性神经酰胺酶蛋白的功能可能丧失的核苷酸变化。在一些实施例中，每两周向受试者施用rhAC，持续28周。在一些实施例中，rhAC的递送是通过静脉内输注(例如，生理盐水输注)。在一些实施例中，以约1mg/kg开始并升高到约5mg/kg rhAC(例如，在第4周时升高到5mg/kg)。
在一些实施例中，随时间的推移(通常为3.5小时到4小时)静脉内输注可以为3mL/hr。在一些实施例中，在第一小时中以总体积的比率的3％输注剂量，并且在接下来的2.5小时可以输注剩余剂量(即，第二小时中的输注可以为每小时标称体积的约40％，直到剂量被施用)。未确立最大输注时间，以确保可以在逐例的基础上解决个体的耐受性。输注通过内联、低蛋白质结合、0.2微米过滤器施用。剂量按重量(以kg计)归一化，其将在每个给药间隔时基于先前研究访问时收集的重量确定。
例如，位点特异性施用可以用于身体隔室或腔，如关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口服、颊、舌下、鼻内或透皮方式。
本文所述的治疗组合物可以被制备用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)或任何其它施用，特别是液体溶液或悬浮液的形式。调配物还可以适合于可注射调配物。在一些实施例中，可注射调配物是无菌的。在一些实施例中，可注射调配物是无热原的。在一些实施例中，调配物不含与除了本文所述的抗原以外的其它抗原结合的其它抗体。
能够治疗法伯病或与rhAC活性或治疗rhAC相关病理的使用相关联的其它病况的rhAC的蛋白质旨在向受试者提供足以影响相关症状或病理的减少、解决或改善的量。此病理包含如本文所述的受试者中的法伯病的症状。如果药剂的剂量、施用途径和给药时间表足以影响此应答，则认为量是对于“影响”症状的减少是足够的或“治疗有效量”。对蛋白质的应答可以通过对受试者的受影响组织、器官或细胞的分析，如通过成像技术或通过对组织样品的离体分析测量。如果药剂的存在导致接受患者的生理的可检测变化，则所述药剂是生理显著的。在一些实施例中，如果量是可以用于治疗、改善或抑制受试者遭受的法伯病的症状的量，则所述量是治疗有效量。本文提供了此量的非限制性实例，但是如果上下文指示了另一种量，则其不旨在限于此量。
在一些实施例中，治疗的功效通过以下方式中的任一种方式评估：
·用rhAC治疗28周后与净结节(≥5mm)计数中的基线的变化百分比；
·用rhAC治疗28周后与净结节(≥10mm)计数中的基线的变化百分比以及与安慰剂的比较；
·用rhAC治疗28周后与总结节计数(不论大小)中的基线的变化百分比以及与安慰剂的比较；
·用rhAC治疗28周后与所选关节的关节活动范围的基线的变化和变化百分比以及与安慰剂的比较；
·用rhAC治疗28周后与6分钟步行距离的基线的变化和变化百分比以及与安慰剂的比较；
·用rhAC治疗28周后与肺功能测试的基线的变化和变化百分比以及与安慰剂的比较；
·用rhAC治疗28周后与FDT评分的基线的变化和变化百分比，以及与安慰剂的比较；
·用rhAC或安慰剂治疗超过28周期间与年龄别身体重量和高度的Z评分中的基线的变化和变化百分比。
在一些实施例中，以不同剂量向法伯小鼠或健康的小鼠施用之后RVT-801的药代动力学基于非隔室方法评估。非隔室药代动力学方法通过估计浓度-时间图的曲线下面积等估计与药物的暴露量，其中以下指标是本领域已知的：
表4
在一些实施例中，基于上述非隔室药代动力学方法，通过确定RVT-801的组织特异性药代动力学对治疗的组织特异性功效进行了评估。
在一些实施例中，估计了RVT-801的与法伯病小鼠的有效剂量相对应的人体等效剂量(HED)。本文中的HED的非临床评估基于两种方法：1)针对按身体表面积(BSA)在非临床物种与人之间缩放的FDA指南，以及2)肝和脾作为神经酰胺蓄积的主要组织与其中RVT-801的摄取占主导的物种之间的器官:身体重量比率。
按体表面积缩放：HED，以法伯小鼠MED(最大有效剂量)为基准并且基于BSA和人类成人或儿童的身体重量(其中HED＝动物剂量*(动物身体重量/人身体重量)
按器官:身体重量比率缩放：PK研究表明，用于从脉管系统清除的机制与摄取和/或分布到组织中相关联，因此，组织重量与身体重量的比率可能影响剂量并且BSA模型就其本身而言可能是无法充分预测的。使用HED＝MED*(组织
在一些实施例中，HED可以通过组合以上两种缩放方法确定。
蛋白质可以根据用于制备药学上有用的组合物的已知方法配制，借此这些材料或其功能衍生物与药学上可接受的载剂媒剂以混合方式组合。
还提供了本文和下文所述的试剂盒，所述试剂盒可用于执行本文所述的实施例。在一些实施例中，试剂盒包括含有上述多肽或与上述多肽联合封装的第一容器。试剂盒还可以包括含有执行实施例所需要的或便于执行实施例的溶液或与所述溶液联合包封的另一容器。容器可以由玻璃、塑料或箔制成并且可以是小瓶、瓶、小袋、管、袋等。试剂盒还可以含有如用于执行实施例的程序等书面信息或如容纳在第一容器装置中的试剂的量等分析信息。容器可以连同书面信息一起位于另一容器设备，例如盒或袋中。
本文提供的又另一方面是一种用于治疗法伯病的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包括包含rhAC多肽或编码所述rhAC多肽的核酸分子的至少一个容器。在一些实施例中，试剂盒包括包含被配置成表达rhAC的细胞的容器。在一些实施例中，细胞为CHO细胞。在一些实施例中，试剂盒包括来自表达rhAC的细胞的条件培养基。在一些实施例中，条件培养基来自CHO细胞。
现在参考以下实例描述本发明主题。提供这些实例仅是为了说明目的，并且本权利要求绝不应理解为限制于这些实例，而是应理解为包涵由于在此提供的教导而变得明显的任何和所有变化。本领域的技术人员将易于认识到多种可以改变或变更以产生本质上相似结果的非关键参数。
实例
本实例提供了在跨有效剂量的范围施用以允许随后的药代动力学和组织分布建模之后在关键组织隔室对rhAC中的处置，并且基于有效剂量和组织暴露量进一步提供了对按身体表面积或器官:身体重量的比率缩放的人体等效剂量(HED)的预测。
实例1
在健康的幼年、野生型CD-1小鼠(Asah1
生命中方案
以1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg按单个丸剂IP注射的形式对年龄为大约3.5周(幼年)的雄性CD-1小鼠施用RVT-801。在每个剂量组中通过心脏穿刺或其它经过批准的方式，从每时间点(给药前、注射后0.5、1、2、3、4、6)三(3)只动物中收集了用于药代动力学分析的血液样品，以产生每只小鼠的最大体积血液样品。将每个血液样品以其整体处理成血清，以用于通过ELISA进行的RVT-801浓度分析。
通过ELISA进行的RVT-801生物分析
夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)对于小鼠血清中的RVT-801的定量而言是合格的。所述方法使用经过亲和纯化的兔抗重组人AC(rhAC、RVT-801)多克隆抗体进行捕获，并且使用经过亲和纯化的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的兔抗rhAC多克隆抗体进行检测。使用RVT-801建立标准曲线和对照范围。在测定的所限定范围内，产生的信号与样品中RVT-801的浓度成比例。
详细的2天测定程序如下：在第1天，用100μL的捕获试剂(PBS中的1μg/mL兔抗rhAC)对96孔透明聚苯乙烯板进行涂覆，并在2-8℃下孵育过夜。在第2天执行所有其它步骤。在室温(RT)下利用震荡(～300-400rpm)进行第2天的所有孵育。简言之，用300μL的洗涤缓冲液(含有0.05％Tween-20的1X PBS，PBST)将所述板洗涤3次，并且在最终洗涤之后在纸巾上轻拍。接下来，用每孔300μL的测定缓冲液(含有0.05％Tween 20的酪蛋白/TBS)将板封闭至少1小时，并且如上所述进行洗涤。洗涤之后，将稀释到MRD(测定缓冲液的50倍)的100μL的校准标准品、对照物和样品添加到每个孔中，并且将板孵育大约2小时并且如上所述进行洗涤。接下来，将100μL的检测试剂(测定缓冲液中的0.2μg/mL HRP缀合的兔抗rhAC)添加到每个孔中，并且将板孵育大约1小时并且如上所述进行洗涤。洗涤之后，将100μL的冷底物溶液添加到每个孔中，并且将板在黑暗中孵育持续多达30分钟。通过测量650nm(A650)的吸光度监测显色。当A650介于最高标准的0.9-1.2之间时或在适当时基于显色停止反应。为了停止显色，将100μL的终止溶液添加到每个孔中，并且在450nm处利用被设置为650nm的波长校正读取板。
非隔室药代动力学分析
通过Certara WinNonlin Phoenix版本7.0的方式执行非隔室药代动力学分析。利用微软表格(Microsoft Excel)和GraphPad Prism生成暴露量比率和曲线图。
结果
为了评估酶在体内的药代动力学概况，使健康的幼年CD-1小鼠以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的剂量接受单次rhAC(RVT-801)注射，并且在注射后0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时和6小时时确定血清中的RVT-801浓度(图1)。如图2所示，在以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg进行RVT-801的单次IP给药之后，血清暴露量(AUC、C
RVT-801的幼年CD-1小鼠PK数据在以下进行讨论。在以10mg/kg给药RVT-801的幼年CD-1小鼠体内进行了两项研究：
RVT-801-9013A–集中于表征血清PK。观察到以下PK参数。
AUC 1.37小时*μg/mL
C
T
RVT-801-9013B–集中于RVT-801的组织分布和组织:血清暴露量比率。观察到以下PK参数。
AUC 1.49小时*μg/mL
C
T
此外，如图3所示，野生型CD-1小鼠的血清中的RVT-801(i.p.注射，10mg/kg)暴露量的持续时间与法伯病小鼠(带黑圈的实线；转载自国际申请第PCT/US18/13509号，其公开内容通过引用以其整体并入)中的全身性酸性神经酰胺酶(AC)活性紧密相关。基于此发现，利用与功效研究中使用的幼年法伯小鼠年龄匹配的野生型CD-1小鼠执行了对RVT-801药代动力学和组织特异性分布的进一步评估。
实例2
进一步地，评估了RVT-801在野生型CD-1小鼠的各种器官组织中的药代动力学和组织特异性分布。
分析前的组织处理
在CHAPS缓冲液中利用添加蛋白酶抑制剂混合物通过利用凯杰公司(Qiagen)TissueLyser II对样品进行处理(在30Hz的频率下每次3分钟的3个周期)，制备组织匀浆。在ELISA检测之前，将组织匀浆稀释到标准1mg/mL总蛋白质浓度。由于低蛋白质含量，在体积而非蛋白质浓度的基础上对BALF样品进行处理，以用于检测。
由所修改ELISA对组织提取物中的RVT-801进行定量
已对对于RVT-801小鼠血清的定量而言合格的ELISA方法进行了调整，以进行小鼠组织中的定量(血液、肝、脾、肾、心脏、肺和大脑)。
所修改方法包含制备组织裂解物、使用双金鸡宁酸(BCA)测定对总蛋白质进行定量以及在裂解缓冲液中制备RVT-801标准曲线。所调整方法仅对于小鼠血清质量对照样品具有50倍的最小需要的稀释(MRD)。标准品和研究样品不受MRD制约。产生的信号与样品中的RVT-801浓度成比例。所调整测定的定量的下限和上限分别为0.400ng/mL和24.5ng/mL。针对组织均质化和裂解物稀释，对所测量RVT-801浓度进行校正，视情况而定。
在执行ELISA之前，执行了可行性研究。所述可行性研究包含：1)将在RIPA缓冲液(150mM氯化钠、50mM Tris-HCl、pH 7.5、0.25％(w/v)脱氧胆酸、1％(v/v)NP-40)、CHAPS缓冲液(150mM氯化钠、50mM Tris-HCl、pH 7.5、2％(w/v)CHAPS)和小鼠血清中制备的RVT-801标准曲线进行比较，2)将小鼠血清对照样品相对于在RIPA和CHAPS缓冲液中制备的RVT-801标准曲线的回收率进行比较，3)对在使用不同的裂解缓冲液(PBS、RIPA和CHAPS)的不同组织均质化方法(在冰上孵育，30Hz下3个TissueLyser周期、30Hz下5个TissueLyser周期、超声处理)之后使用酸性磷酸酶测定试剂盒(西格玛(Sigma)CS0740)的溶酶体破坏进行比较，4)确认在CHAPS缓冲液中均质化之后使用β-半乳糖苷酶试剂盒(皮尔斯公司(Pierce)75705)的溶酶体破坏，以及5)分析掺入不同浓度水平的RVT-801的组织裂解液相对于CHAPS标准曲线的回收率。在均质化之前，在管中对除了AM沉淀物以外的所有固体样品进行称重。在每批开始时对空管进行称重，并且使用此重量计算每个管中的组织的重量。因为从文献中了解了小鼠肝密度，所以使用了此值(1.051g/mL)计算肝组织的裂解校正因子；但是，假设所有其它组织的密度为1g/mL(参见图7)。可以通过将基于尿素含量的校正因子应用于支气管肺泡灌洗液(BALF)数据以校正灌洗和收集时的样品稀释来确定上皮衬液(ELF)浓度。
药代动力学分析
以与实例1相同的方式，通过Certara WinNonlin Phoenix版本7.0执行非隔室PK分析。
结果
从循环中清除RVT-801的主要机制是进入神经酰胺蓄积中涉及的关键组织的摄取。如图4所示，RVT-801实现了跨各种器官组织(肝、脾、肾、肺和心脏)的广泛分布。RVT-801在关键组织中的暴露量明显着大于血清中，并且在RVT-801在全身循环中变得不可测量之后会持续一段延长的时间。此发现可以支持与基于血清暴露量所指示的相比更低频率给药。急性RVT-801治疗之后关键器官组织(肝、脾)中的暴露量的延长的持续时间与全身暴露量的持续时间以外发生的组织神经酰胺的最大减少相关。
肝和脾是法伯小鼠体内的神经酰胺蓄积以及RVT-801摄取的两个关键器官，如以上在实例1中所讨论的。图5A和5B分别示出了肝和脾组织提取物中RVT-801剂量应答的时间进程，其表明组织中的RVT-801暴露量随剂量(1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg)增加。在给药后～4小时，肝脏中达到了最高RVT-801浓度，并且在超过血清水平无法检测的最后采样时间点(24小时)时保持升高。观察到采样时间点之间的变化性可能是由于给药的幼年小鼠的复杂性(～16g身体重量)。
进一步地，评估了这两个关键器官中的RVT-801的药代动力学。如图6A所示，与血清和全血RVT-801相比，在每种有效剂量下，肝和脾的AUC
进一步地，评估了相比于各种其它器官相比，RVT-801在这两种器官中的药代动力学。如图7所示，RVT-801广泛分布于与法伯小鼠体内的神经酰胺蓄积相关联的组织中，如上文实例1中所述。在其它组织中，10mg/kg RVT-801达到了如图8所描绘的组织:血清比率。
讨论：这些结果确立了rhAC RVT-801在降低法伯病小鼠体内的组织神经酰胺时达到最大功效端点所需的血清和组织暴露量目标。在与神经酰胺蓄积相关联的关键组织(肝、脾)中达到的显著较高且延长的暴露量支持组织中的通过RVT-801的超出血清中的酶的可检测水平的神经酰胺减少的持续时间延长。
实例3
通过应用上述讨论的采用身体表面积或器官组织:身体重量比率的缩放策略对RVT-801在人体中的等效治疗有意义剂量(HED：人体等效剂量)进行了评估。
如图9所示，基于以下公式按身体表面积(BSA)对RVT-801的10mg/kg剂量进行缩放以解决物种之间的总体生理趋势：HED＝动物剂量×(动物身体重量/人身体重量)
如图10和11所示，使用以下公式按组织:身体重量比率缩放RVT-801的10mg/kg剂量，以解决每个物种内RVT-801分布的每个隔室的相对大小：HED＝动物剂量×(组织质量
基于身体表面积和器官与身体重量的比例将两个缩放因子组合提供了每次施用的大约1-5mg/kg的保守人体等效剂量(HED)范围，如图12所示。此HED范围与其它所销售酶替代疗法(ERT)的经过批准的剂量一致。(图12)。图12的表中汇总的其它ERT的所有剂量信息均来自产品的相应标签。
实例4
此研究的目的是确定在以丸剂IP注射的形式施用的向幼年雄性CD-1小鼠进行的1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg的单个给药治疗之后RVT-801的血清和组织药代动力学。
在对幼年小鼠进行IP施用之后，平均血清RVT-801浓度在对所有剂量组剂量施用之后的0.25小时与1小时之间最高并且随着估计的1小时的半衰期迅速下降。血清RVT-801随着剂量增加而增加，其中相比于与剂量成比例C
通过丸剂IP注射递送的法伯小鼠体内的最大有效剂量(MED)为10mg/kg，与目前研究一致。确定的在对年龄匹配的野生型CD-1小鼠进行单个10mg/kg给药之后的AUC
RVT-801-9013A–集中于表征血清PK：
AUC 1.37小时*μg/mL
C
T
RVT-801-9013B–集中于RVT-801的组织分布和组织:血清暴露量比率
AUC 1.49小时*μg/mL
C
T
此研究分两部分进行。此研究的A部分的目的是确定在以丸剂腹膜内注射的形式施用的对幼年雄性CD-1小鼠进行1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg单次给药之后RVT-801的血清药代动力学。研究的B部分的目的是表征在以丸剂腹膜内注射的形式对幼年雄性CD-1小鼠施用的1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg的单个剂量之后在法伯小鼠模型中的神经酰胺蓄积中所涉及的关键组织中对RVT-801的处置。
在此研究中使用了RVT-801原料药来源753-01-16-002。用于IP施用的媒剂调配物是无菌生理盐水。
通过丸剂腹膜内注射向年龄大约3.5周的雄性CD-1小鼠施用RVT-801。在研究的A部分中使用了总共108只小鼠并且在研究的B部分中使用了102只小鼠。NeoSome与其供应商(查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))协调动物的运输和供应日期，以允许在给药之前幼崽在饲养箱中充分适应。
根据表5通过利用无菌PBS稀释所提供的RVT-801的原料溶液制备了给药材料。
基于在剂量施用当天记录的身体重量计算单个剂量。通过丸剂IP注射向动物施用RVT-801，如表6中所详述的。
表5：给药材料制备
表6：剂量施用
按照表7中详述的时间表收集了药代动力学样品，其中全血收集物来自每剂量组每时间点的三只动物中。将从每只动物中收集的全血的整个体积处理成血清。
表7：药代动力学样品收集
在B部分中，根据表8通过利用无菌PBS稀释所提供的RVT-801的原料溶液制备了给药材料。
表8：剂量施用
按照表9中详述的时间表收集了药代动力学样品。
表9：药代动力学样品收集
*BALF-支气管肺泡灌洗液
将血液收集物分开以提供每只动物的全血和血清样品(在指示时)。
以大约-70℃储存血清PK样品，并且将其在干冰上通过过夜速递运输给BioAgilytix(生物分析供应商)，其中通过夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)执行对RVT-801浓度的确定。
在适当的时间点进行血液收集之后，直接从所有剂量组收集肝和脾。将组织轻轻吸干并且放置到预先贴标签(预先称重的)的小瓶中。记录含有组织的每个小瓶的重量，并且在运输前以-70℃储存样品。未向组织中添加缓冲液、防腐剂或抗生素，并且在研究的任何阶段均未执行组织灌注。针对10mg/kg剂量组，如针对肝和脾所描述的对大脑、肾、心脏和肺进行收集和处理。另外，在适当的时间点通过肺灌洗技术进行血液收集之后，直接从10mg/kg剂量组收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，所述肺灌洗技术向肺滴注0.5mL磷酸盐缓冲生理盐水并且随后收集大约0.35mL的BALF。将BALF样品放置在适合的容器中并进行离心以产生上清液和肺泡巨噬细胞沉淀物。除去上清液并且将其放置到单独小瓶中。在运输前以-70℃储存上清液和细胞沉淀物。
使用三只另外的小鼠提供无药物基质。将对照基质样品用作每个剂量组的给药前样品。如上所述，执行样品的收集、处理和储存。使用合格的夹心ELISA方法(BioAgilytixBAL-17-333-036.01-REP)确定了血清中RVT-801的浓度。血清测定的LLOQ为20ng/mL，并且所述测定的ULOQ为1224ng/mL。
对血清方法进行调整以进行血液、肝、脾、肾、心脏、肺和大脑中的定量。所修改方法包含制备组织裂解物、使用双金鸡宁酸(BCA)测定对总蛋白质进行定量以及将裂解缓冲液中的总蛋白质浓度稀释为1mg/mL，以及在裂解缓冲液中制备RVT-801标准曲线。由于低蛋白质含量，所以在体积的基础上而非标准化蛋白质浓度的基础上对BALF样品进行了处理。所调整方法仅对于小鼠血清质量对照样品具有50倍的最小需要的稀释(MRD)。标准品和研究样品不受MRD制约。产生的信号与样品中的RVT-801浓度成比例。所调整测定的LLOQ为0.400ng/mL，并且所述测定的ULOQ为24.5ng/mL。针对组织均质化和裂解物稀释，对所测量RVT-801浓度进行校正。在最终生物分析报告中提供了对生物分析方法和结果的说明。
使用非隔室方法产生了表10中的药代动力学参数，所述非隔室方法采用了使用复合血清和组织浓度-时间数据的Phoenix
表10：药代动力学参数定义
以单位ng/mL从生物分析实验室接收了RVT-801浓度值并将所述值转换成单位μg/mL以进行PK分析和报告。除了被报告为具有2个小数位的T
将低于定量限制(BLQ)的所有浓度设置为零，并且计算了在每个时间点每个剂量组的平均浓度，以报告浓度-时间汇总统计和平均浓度-时间数字。在非隔室分析中使用了为BLQ的平均浓度，未进行调整。
将等于0的任何平均浓度(所有值为BLQ)视为BLQ，并且如下进行处理以用于NCA：
如果BLQ值出现在曲线中的可测量浓度之后并且跟随有可量化值，则将其对待为缺失数据。
如果BLQ值出现在收集间隔结束时(在最后可量化浓度之后)，则将其对待为缺失数据。
如果在C
结果。
表11中呈现了RVT-801的用于B部分的PK分析的单个小鼠血清和组织浓度-时间数据。
表11：来自A部分的单个动物血清RVT-801浓度-时间数据
表12中呈现了按组织和剂量分组的复合平均RVT-801浓度-时间数据。
表12：来自A部分的按时间点汇总的单个动物血清RVT-801浓度-时间数据。
10mg/kg剂量组的平均RVT-801浓度-时间数据在图20中被展示出具有覆盖在线性轴上的组织。
图20A和20B分别示出了在B部分(线性和对数线性)中在对幼年小鼠进行IP施用之后平均RVT-801组织浓度-时间概况。
在对幼年小鼠进行IP施用之后，平均血清RVT-801浓度在对所有剂量组剂量施用之后的0.25小时时最高。血清RVT-801浓度迅速下降。最后非零平均浓度对于1mg/kg剂量出现在3小时时，对于3mg/kg剂量出现在给药后4小时时并且对于10mg/kg剂量出现在给药后4小时时。跨剂量组的血清浓度的变化性很大。研究的B部分中的血清浓度总体上与来自A部分的血清浓度一致。
在10mg/kg的剂量之后，组织中的RVT-801浓度在给药后的第一时间点时是可量化的，并且在对肺给药后0.5小时以及在肝、脾、肾和心脏中给药后1小时最高。RVT-801的浓度直到给药后18小时在组织中总体上保持可量化。
来自A部分和B部分的按剂量分组的复合平均RVT-801血清浓度-时间数据分别在表13和14以表格列出。
表13：A部分中按剂量水平的复合平均RVT-801血清浓度-时间数据
定量限制(<0.0200μg/mL)
平均值-3只动物的平均值
SD-标准偏差
表14：B部分中按剂量水平的复合平均RVT-801血清浓度-时间数据
NS-无收集的样品
平均值-3只动物的平均值
SD-标准偏差
RVT-801的按基质的复合平均非隔室PK参数呈现在表15中。
表15：对CD-1幼年小鼠进行IP施用之后，组织和血清中的复合平均RVT-801非隔室药代动力学参数–B部分
组织与血清暴露量比率在表16中提供并且在图21中显示。图21呈现了基于AUC
针对10mg/kg剂量组仅收集了BALF、大脑、心脏、肾和肺。
表16：对幼年小鼠进行IP施用之后RVT-801组织:血清暴露量(AUC
组织:血清比率基于由血清中的由AUC
*BALF中RVT-801浓度表示在PBS中稀释的上皮衬液(ELF)的水平。
需要用于解释稀释的校正因子以反映ELF中的浓度。
所绘制的剂量归一化PK参数对各种组织的剂量水平呈现于图22A-D中。
图22A描绘了在以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg施用RVT-801之后血液中的剂量归一化曲线下面积(DNAUC)数据。
图22B描绘了在以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg施用RVT-801之后血清中的剂量归一化曲线下面积(DNAUC)数据。
图22C描绘了在以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg施用RVT-801之后肝组织中的剂量归一化曲线下面积(DNAUC)数据。
图22D描绘了在以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg施用RVT-801之后脾中的剂量归一化曲线下面积(DNAUC)数据。
RVT-801的全身性血清暴露量是短寿命的，其中相比于组织浓度血清中的浓度保持可量化的持续时间短得多；血清中4小时比组织中18-24小时。T
RVT-801广泛分布于组织中，其中组织与血清暴露量(AUC
BALF样品由在磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)滴注液中稀释的上皮衬液(ELF)组成。所测定样品中不存在肺泡细胞群，因为通过在BALF收集后立即进行离心除去了细胞。需要反映天然肺液在PBS中的稀释的校正因子，以将BALF中的RVT-801浓度转换到ELF中的水平。未执行作为此探索性研究的一部分对绝对稀释因子的确定。可以通过将BALF中的尿素含量与来自同一动物的血浆中的尿素含量进行比较来确定校正因子，因为普遍接受上皮液中的天然尿素水平用于反映血浆尿素含量(Rennard SI、Bassset G、Lecossier D、O'Donnell KM、Pinkston P、Martin PG、Crystal RG,1986,《“对使用尿素作为稀释的标记通过灌洗回收的上皮衬液的体积的估计(Estimation of volume of epithelial lining fluidrecovered by lavage using urea as marker of dilution)”,《应用生理学杂志(J ofApplied Physiology)》1986,60(2):532-538)。Berkhout等人使用类的收集方法确定了校正因子(Berkhout J、Melchers MJ、van Mil AC、Seyedmousavi S、Lagarde CM、NicholsWW、Mouton JW,2015“进入大腿和肺感染的小鼠的上皮衬液的头孢他啶和阿维巴坦的药代动力学与渗透(Pharmacokinetics and penetration of ceftazidime and avibactaminto epithelial lining fluid in thigh-and lung-infected mice)”,《抗菌剂与化疗(Antimicrob Agents Chemother)》,59(4):2299-2304)是高度可变的(对于2mL总滴注体积，平均值：11.6倍；范围：4.3到144.2倍)，并且表明当前研究中的可能稀释度(0.5mL滴注体积)可能高达36倍。
血液中RVT-801的浓度与血液:血清比率的范围为0.127到0.584的血清相比更低，这表明RVT-801不优先与红细胞缔合。参见表17。
表17：对幼年小鼠进行IP施用之后RVT-801血液:血清暴露量(AUC
此研究的目的是确定在以丸剂IP注射的形式施用的向幼年雄性CD-1小鼠进行的1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg的单个给药治疗之后RVT-801的血清和组织药代动力学。在对幼年小鼠进行IP施用之后，平均血清RVT-801浓度在对所有剂量组剂量施用之后的0.25小时与1小时之间最高并且随着估计的1小时的半衰期迅速下降。血清RVT-801随着剂量增加而增加，其中相比于与剂量成比例C
RVT-801经历了从全身循环中迅速清除，与从血清到其它组织的广泛分布一致。观察到RVT-801的最高暴露量为肝>脾>肾>肺>心脏>全血>BALF。基于AUC
实例5
利用总共12只法伯小鼠进行了在给药的年龄在4-5周的法伯小鼠体内的组织分布研究(研究RVT-801-9021；A部分)。对六只动物各自以10mg/kg施用了RVT-801的单个剂量或对三只以10mg/kg/剂量施用了RVT-801的每周一次剂量。剂量组包含任何性别的动物，因为Asah1
表18 RVT-801-9021剂量施用
媒剂1：无菌PBS中稀释。
通过丸剂腹膜内(IP)注射向在剂量初始时年龄为4-5周的雄性和雌性法伯小鼠施用单个或重复每周一次剂量的RVT-801。如表19所指示的制备给药材料。基于在剂量施用当天记录的身体重量计算单个剂量。将RVT-801在无菌盐水中稀释，并且在施用的每一天新鲜制备给药材料。
表19：RVT-801-9021给药材料制备
注意：施用的每一天新鲜制备给药材料。
实验被设计为确定在向法伯小鼠单个或重复施用RVT-801之后的所选时间点循环和组织中的rhAC的浓度，并且关于在CD-1小鼠体内确立的药代动力学评估到关键组织中的RVT-801分布的范围和程度。
实例6
在未经治疗和经过治疗的法伯小鼠体内进行了免疫分型研究。在第4周、第6周和第8周时向未经治疗的法伯小鼠和野生型(WT)小鼠给药。在大约4周时向经过治疗的法伯小鼠给药。利使用11只(雄性/雌性)未经治疗的法伯小鼠、8只(雄性/雌性)未经治疗的WT小鼠和7只(雄性/雌性)经过治疗的法伯小鼠进行了研究。以每周一次剂量的RVT-801施用给药。将研究的此部分指定为RVT-801-9025 B部分。
实例5和6中施用的rhAC包含pH为7.4的10mg/ml(实际9.91mg/ml)的rhAC溶液。
在施用RVT-801之后，根据标准操作程序对小鼠实施安乐死，并且在施用后6小时和24小时收集了PK样品(在重复剂量组中第三次每周注射RVT-801之后收集样品)。由于法伯小鼠的有限的可用性，因此药代动力学样品收集被约束于两个时间点。通过心包穿刺将全血收集到锂肝素小瓶中，并且将其以其整体处理成血浆。从每只动物中收获完整肝、脾、肾、肺、心脏、大脑和胸腺组织，轻轻吸干并放置到单个小瓶中。在任何阶段，不固定组织也不用利用缓冲液对其进行灌注，并且在不添加缓冲液、防腐剂、蛋白酶抑制剂或抗生素的情况下冷冻样品。以大约-70℃储存血浆和组织样品，并且在干冰上运输到生物分析设施以进行分析。PK样品收集详述于表20中。
表20：RVT-801药代动力学样品收集
基于组织的ELISA
通过由BioAgilytix(北卡罗来纳州达拉谟(Durham,NC))进行的ELISA测量了在施用RVT-801之后法伯小鼠组织中的rhAC的浓度。
针对在均质化缓冲液中制备的校准标准品使组织样品运行，所述校标准品具有基于血清或基于缓冲液的质量控制(QC)样品。
将产生的组织样品在含有蛋白酶抑制剂混合物(HALT，赛默科技公司(ThermoScientific))的缓冲液(150mM氯化钠、50mM Tris-HCl、pH 7.5、2％(w/v)CHAPS，赛默科技公司)中均质化。使用TissueLyser II(凯杰公司)，以30Hz用单个5mm不锈钢微珠对样品进行处理，持续各自三分钟的三个周期。在周期之间将匀浆放置于2-8℃下以控制样品温度。用比色二辛可宁酸(BCA)蛋白质定量试剂盒(皮尔斯)确定每种组织匀浆的总蛋白质浓度，并且在通过ELISA进行分析之前用缓冲液将样品稀释到1mg/mL的标称总蛋白质浓度。
将捕获抗体(兔抗rhAC)涂覆在微量滴定板上。用蛋白质缓冲液封闭所述板并且对其进行洗涤以除去过量捕获和阻断试剂。将所稀释组织匀浆连同校准标准品和QC添加到板中并进行孵育，以允许样品和对照中的rhAC与涂覆板的抗体缀合。对板进行洗涤以除去未缀合的rhAC，并用检测抗体(兔抗rhAC-HRP)孵育。对板进行洗涤以除去未结合的检测抗体，并且利用添加比色底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB))进行孵育，以使与检测抗体缀合的rhAC可视化。在添加终止溶液之后读取样品吸光度。测定使用表21中列出的参数生成了与样品中的rhAC的浓度成比例的信号。从标准曲线中插入组织匀浆中的RVT-801浓度，并且通过应用稀释因子进行校正以计算天然组织中的浓度。
表21：RVT-801组织ELISA汇总
通过合格的ELISA分析确定了法伯小鼠血浆中的rhAC的含量。简言之，用捕获试剂(兔抗rhAC)对微量滴定板进行涂覆、封闭、洗涤，并且用产生的血浆样品以及基质匹配的校准标准品和QC进行孵育。孵育之后，对板进行洗涤以除去未结合的rhAC，并且然后用检测试剂(兔抗rhAC-HRP)进行孵育。通过进一步洗涤除去过量(未结合的)检测试剂，并且将比色底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB))添加到所述板上。最后，添加终止溶液以淬灭比色显影并且读取样品的吸光度。测定中生成的比色信号的强度与样品中的rhAC的浓度成比例。对于测定参数的汇总，参见表22。根据标准曲线反向计算出法伯小鼠血浆样品中的RVT-801浓度。
表22：RVT-801血浆ELISA汇总
由于给药后时期内数据点的数量和时间密度不足，因此未针对法伯小鼠计算RVT-801浓度-时间曲线下面积；Asah1
RVT-801浓度数据被报告为具有三个有效数字，并且T
在计算平均浓度-时间数据时，将被报告低于定量限制(BLQ)的所有产生的样品浓度对待为具有等于零的值。
结果
来自以10mg/kg/剂量接受RVT-801的单个或重复每周一次剂量的法伯小鼠的血浆和所选组织中的平均rhAC浓度-时间数据在表6中呈现，而单独数据在表7中进行了详述。
在RVT-801的单个剂量之后，在施用后6小时(第一给药后时间点)时跨从法伯小鼠收集的所有生物基质测量了最大rhAC浓度；然而，这些数据可能会受到可行采样时间点的有限数量的影响。
在以10mg/kg/剂量重复施用RVT-801之后，循环中的以及跨在给药后6小和24小时时收集的组织的rhAC水平通常低于CD-1小鼠(RVT-801-9021)中以10mg/kg施用的RVT-801的单个剂量之后的水平，其中多个24小时重复剂量样品低于定量限制。此趋势在向法伯小鼠施用RVT-801之后，在总体rhAC含量最高的三个组织(肝、脾和肾)中显而易见，其中平均单个剂量24小时浓度高于按数量级重复施用后的浓度(图13)。此总体趋势的一个例外是大脑，其中具有可量化rhAC浓度的唯一样品来自接受多个剂量的RVT-801的两只小鼠。
图21呈现了在对幼年CD-1小鼠进行1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的RVT-801单个给药之后，基于AUC
表23：平均法伯小鼠RVT-801血浆和组织浓度-时间数据
表23：通过丸剂IP注射以10mg/kg/剂量接受RVT-801的单个剂量或重复每周一次剂量之后的法伯(Asah1
BLQ：低于定量限制
NC：未收集
表24：单独法伯小鼠RVT-801血浆和组织浓度-时间数据
表24呈现了通过丸剂IP注射以10mg/kg/剂量接受RVT-801的单个剂量或重复每周一次剂量之后的法伯(Asah1
BLQ：低于定量限制
NC：未收集
结果。
先前在年龄～3.5周的健康的幼年雄性CD-1小鼠体内表征了RVT-801的鼠药代动力学(RVT-801-9013 A部分)。在使大约大小以及其年龄为在重度法伯模型中进行的功效研究的初始时的法伯小鼠刚断奶后，对小鼠进行给药。采用CD-1小鼠以进行总体ADME研究的决定是基于共同遗传背景(法伯小鼠的亲本菌株)连同重度法伯小鼠的影响其适用性和可用性以描述所施用RVT-801的完整浓度-时间进程的恶病质性质和特征性脆弱。
当以单个IP丸剂注射以1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg向健康幼年雄性CD-1小鼠施用时，RVT-801的全身暴露量通常以上比例方式相对于按照C
表25：单个IP丸剂注射之后RVT-801在健康幼年CD-1小鼠体内的非隔室血清药代动力学
表25.在对健康幼年雄性CD-1小鼠进行单个IP丸剂注射之后RVT-801的血清药代动力学；在施用后24小时收集的PK样品，n＝3每时间点。
C
T
T
AUC
t
Vz/F：血管外施用之后的表观分布体积
CL/F：血管外施用之后的表观清除
RVT-801在CD-1小鼠体内的暴露量持续时间和总体消除动力学与给任一菌株的rhAC的单个10mg/kg剂量之后法伯小鼠体内的测量的酸性神经酰胺酶活性的持续时间和半衰期密切相关(图14)。此观察使使用CD-1小鼠表征RVT-801的鼠药代动力学并且将一般ADME属性外推到疾病模型的方法具有另外的可信度。
图15示出了在RVT-801的单个10mg/kg剂量之后，健康的幼年CD-1小鼠体内的最终rhAC组织:血清AUC的比率。
当以单个IP丸剂注射以1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg向幼年雄性CD-1小鼠施用时，RVT-801实现了到一系列所选组织和器官的广泛分布(RVT-801-9013B部分)中。基于AUC按肝>脾>肾>肺>心脏>血清>血液所指示的暴露量顺序对组织排序(图15、表9)。
体内血液分布分析表明RVT-801不优先与红细胞缔合。观察到组织中暴露量的持续时间相对于血清显著延长；虽然在给药后RVT-801在血清中可量化高达达4-6小时，但是血清暴露量在施用后通常持续至少18-24小时。
在以10mg/kg RVT-801的剂量给予CD-1小鼠时，选择用于分析的组织中的大多数可量化rhAC分布到肝、脾和肾，所述剂量与法伯小鼠模型中的基于肝和脾中的神经酰胺的蓄积水平的降低的最大有效剂量(MED)相关。
表26：单个IP丸剂注射之后RVT-801在健康幼年CD-1小鼠体内的全身和组织药代动力学
表26.在对健康幼年雄性CD-1小鼠进行单个IP丸剂注射之后RVT-801的全身和组织药代动力学；在施用后24小时收集的PK样品，n＝3每时间点。
C
T
T
AUC
RVT-801在法伯小鼠体内的单个剂量药代动力学(限于两个施用后时间点)与CD-1小鼠体内表征的暴露量概况的比较表明在向任一菌株单个10mg/kg丸剂IP注射RVT-801之后，rhAC暴露量在法伯小鼠体内更高，其中rhAC的全身水平显著增加并且在分析的时间点时跨组织的暴露量通常较高(表26)。
表27：单个10mg/kg IP给药之后CD-1小鼠和法伯小鼠体内的RVT-801药代动力学
表27.单个10mg/kg丸剂IP注射无菌盐水形式的RVT-801之后年龄大约3.5周的健康雄性CD-1小鼠以及4-5周大的雄性和雌性法伯小鼠(Asah1
RVT-801的单个10mg/kg IP给药之后在法伯血浆和CD-1血清中测量的全身rhAC水平表明法伯小鼠经历了与如由在施用后6小时以及在循环中持续存在时的较高水平所指示的CD-1小鼠相比较高的全身rhAC暴露量。然而在法伯血浆中具有可量化24小时浓度时间点的情况下，rhAC在CD-1小鼠血清中不可检测/低于超过6小时的定量限制。(图16)。
在法伯小鼠中，所分析的RVT-801跨所有生物基质的最高浓度出现在给药后6小时。尽管法伯研究并未被设计为明确定义C
RVT-801的单个剂量之后rhAC在循环中和主要暴露量组织中的比较展示于图17A中。单独数据点的传播的比较呈现在图18中，其中RVT-801的单个剂量之后的给定时间点时rhAC浓度的可变性可以被理解为跨所分析的组织。再次，给药后24小时时法伯中的暴露量相对于CD-1小鼠的增加是显而易见的。
图17示出了在单个10mg/kg丸剂IP注射RVT-801(n＝3只动物每时间点)之后，在法伯(非实心符号)小鼠和CD-1(实心符号)小鼠体内，rhAC在循环和三个主要暴露量组织中的浓度。收集样品并在施用后24小时对其进行了分析。仅在给药后6小时和24小时时收集了来自法伯小鼠的样品。6小时CD-1脾数据是由单个可量化值驱动。
图18呈现了在单个10mg/kg丸剂IP注射RVT-801(n＝3每时间点)之后，在法伯(非实心符号)小鼠和CD-1(实心符号)小鼠体内，肝(图18A)、脾(图18B)、肾(图18C)、肺(图18D)和心脏(图18E)的单个rhAC浓度-时间数据。收集样品并在施用后24小时对其进行了分析。
幼年、健康CD-1小鼠被视为法伯病小鼠模型的亲本菌株。图3示出了在血液中幼年CD-1小鼠RVT-801药代动力学概况与法伯小鼠实验rhAC活性概况类似。这表明幼年CD-1小鼠提供了法伯小鼠PK的适当近似值-因为法伯小鼠虚弱、难以交配并且并未多到足以进行完全PK评估。
尽管基于法伯小鼠的较少数量并且在菌株之间具有有限重叠数据点，但数据表明在RVT-801的单个10mg/kg剂量之后法伯中的全身rhAC暴露量相对于CD-1小鼠显著更高。产生的全身PK样品在许多潜在的重要方面有所不同；Farber小鼠为性别混合的，比健康的年龄匹配的CD-1显著较小，并且表现出深刻的病理学，产生血浆样品，同时从幼年雄性CD-1小鼠体内收集了血清。
所观察到的RVT-801暴露量的差异不太可能是分析菌株之间的不同基质的结果，因为血清和血浆中的蛋白质含量(除凝血因子外)大致相似。另外，所测量的法伯血浆暴露量的增加不是相对于血清的血浆ELISA敏感度和/或报告另外的数据点(即，给药后24小时)的能力增加的结果，所述能力由于方法敏感度的差异在CD-1血清中将无法检测。所报告的法伯血浆数据远高于LLOQ，并且以类似方式执行了血浆和血清方法(表27)。
表27：ELISA性能–血清与血浆
MRD：最低所需稀释
LLOQ：定量下限
ULOQ：定量上限
给药之后组织中的RhAC浓度并未显示出依赖于法伯小鼠
尽管已证明了野生型小鼠和法伯小鼠之间存在明显的免疫学差异，但其对RVT-801的药代动力学的影响不清楚。抗药物抗体(ADA)可以延长药物-抗体复合物的循环，但是在施用RVT-801的单个剂量的24小时内观察到了直接讨论的PK差异，并且在这些样品中未检测到ADA。
可能的是，在法伯小鼠体内观察到的暴露量相对于CD-1小鼠的差异是法伯病小鼠模型的多器官生理变化的结果。
Farber小鼠与CD-1小鼠之间的在RVT-801从腹膜腔到脉管系统的分布速率和/或rhAC从循环进入组织的摄取方面的差异可以解释观察到的菌株之间的PK差异。然而，在没有对有限可用数据的解释进行汇总的情况下，未根据当前研究评估这些潜在趋势。
对RVT-801-9021中的剂量小组进行比较，在重复每周一次施用RVT-801时不存在rhAC的表观蓄积。相反，然而有限的数据表明与以同一剂量水平(10mg/kg/剂量)单个注射相比，在多个每周一次剂量内使用RVT-801时所分析的rhAC在循环中和跨组织的浓度较低。跨所有基质，除了大脑外，在施用后6小时和24小时单个剂量浓度时间数据在RVT-801的单个剂量之后比每周三次剂量更高(图19A-G)。进一步地，这些数据与由于在RVT-801的多个剂量之后较低的绝对rhAC浓度和较高的清除率引起的较低暴露量的场景相一致。将有必要进行进一步研究以探索这些明显趋势，并且确立数据是否与在重复施用时RVT-801的总体鼠药代动力学一致，或者法伯病小鼠模型固有的病理学的特征是否影响rhAC的摄取、布置和清除。
图19A-G呈现了根据实例5(RVT-801-9021)的在单个10mg/kg剂量之后CD-1小鼠体内的以及在通过丸剂IP注射施用的单个10mg/kg剂量或以10mg/kg/剂量多个每周一次剂量之后法伯小鼠体内的平均rhAC浓度。
图20A和20B分别示出了在RVT-801-9013 B部分(线性图20A和对数线性图20B)中对幼年CD-1小鼠进行IP施用之后的平均rhAC组织浓度-时间曲线。
图21呈现了在CD-1小鼠体内基于1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的RVT-801的单个剂量的基于AUC
图22A-D呈现了在CD-1小鼠体内以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的剂量IP施用RVT-801之后，各种组织的所绘制的剂量归一化PK参数对剂量水平。
图19A呈现了在通过丸剂IP注射RVT-801单个剂量施用10mg/kg/剂量后血清中全身rhAC浓度的图。图19A还呈现了在通过丸剂IP注射RVT-801剂量施用10mg/kg/剂量后法伯小鼠体内的血浆浓度。另外，图19A呈现了在注射RVT-80的重复剂量施用后的血浆浓度。还呈现了通过丸剂IP注射RVT-801施用单个10mg/kg/剂量的CD-1小鼠体内的ae血清浓度。
图19B呈现了在CD-1小鼠体内在通过丸剂IP注射RVT-801的单个10mg/kg/剂量后RVT-801在肝组织中的浓度。图19B还呈现了在用通过丸剂IP注射RVT-801的单个10mg/kg/剂量治疗的法伯小鼠体内RVT-801在肝组织中的浓度。图19B另外呈现了在用通过丸剂IP注射RVT-801的重复10mg/kg/剂量治疗的法伯小鼠体内RVT-801在肝组织中的浓度。
图19C呈现了在CD-1小鼠体内在通过丸剂IP注射RVT-801的单个10mg/kg/剂量后RVT-801在脾组织中的浓度。图19C还呈现了在用通过丸剂IP注射RVT-801的单个10mg/kg/剂量治疗的法伯小鼠体内RVT-801在脾组织中的浓度。图19C另外呈现了在用通过丸剂IP注射RVT-801的重复10mg/kg/剂量治疗的法伯小鼠体内RVT-801在肝组织中的浓度。
图19D呈现了在CD-1小鼠体内在通过丸剂IP注射RVT-801的单个10mg/kg/剂量后RVT-801在肾组织中的浓度。图19D还呈现了在用通过丸剂IP注射RVT-801的单个10mg/kg/剂量治疗的法伯小鼠体内RVT-801在肾组织中的浓度。图19C另外呈现了在用通过丸剂IP注射RVT-801的重复10mg/kg/剂量治疗的法伯小鼠体内RVT-801在肾组织中的浓度。
图19E呈现了在CD-1小鼠体内在通过丸剂IP注射RVT-801的单个10mg/kg/剂量后RVT-801在心脏组织中的浓度。图19E还呈现了在用通过丸剂IP注射RVT-801的单个10mg/kg/剂量治疗的法伯小鼠体内RVT-801在心脏组织中的浓度。图19E另外呈现了在用通过丸剂IP注射RVT-801的重复10mg/kg/剂量治疗的法伯小鼠体内RVT-801在心脏组织中的浓度。
图19F呈现了在CD-1小鼠体内在通过丸剂IP注射RVT-801的单个10mg/kg/剂量后RVT-801在肺组织中的浓度。图19F还呈现了在用通过丸剂IP注射RVT-801的单个10mg/kg/剂量治疗的法伯小鼠体内RVT-801在肺组织中的浓度。图19F另外呈现了在用通过丸剂IP注射RVT-801的重复10mg/kg/剂量治疗的法伯小鼠体内RVT-801在肺组织中的浓度。
图19G呈现了在CD-1小鼠体内在通过丸剂IP注射RVT-801的单个10mg/kg/剂量后RVT-801在大脑组织中的浓度。图19G另外呈现了在用通过丸剂IP注射RVT-801的重复10mg/kg/剂量治疗的法伯小鼠体内RVT-801在大脑组织中的浓度。
缩写
ASAH1＝酸性神经酰胺酶基因。
AUC＝浓度-时间曲线下面积。
AUC
AUC
BMI＝身体质量指数。
BW＝身体重量。
cDNA＝互补脱氧核糖核酸。
CFR＝《联邦规则汇编(Code of Federal Regulations)》。
CI＝置信区间。
CL＝清除。
C
CNS＝中枢神经系统。
FDA＝美国食品药品管理局。
HED＝人体等效剂量。
HSCT＝造血干细胞移植。
IP＝腹膜内。
IV＝静脉内。
MCP-1＝单核细胞趋化蛋白1。
PD＝一种或多种药效动力学。
PK＝一种药或多种药代动力学。
PRN＝pro re nata。
rhAC＝重组人酸性神经酰胺酶。
SD＝标准偏差。
SMA-PME＝脊髓性肌萎缩伴进行性肌阵挛性癫痫。
t
出于其预期目的在本申请中讨论的参考文献基于其上下文而变得清楚，所述参考文献通过引用以其整体并入。
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等效物
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如本文所用，术语约是指数值，包含例如整数、分数和百分数，无论是否明确指出。术语约通常是指本领域的普通技术人员会认为等同于所列举的值(例如，具有相同的功能或结果)的数值范围(例如，所列举范围的+/-5-10％)。当诸如至少和约的术语出现在数值或范围的列表之前时，所述术语修饰列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语约可以包含四舍五入为最接近的有效数字的数值。
序列表
<110> 恩真万特诊疗公司
<120> 用于治疗法伯病的方法
<130> RVT-801-006WO
<140>
<141>
<150> 62/625,763
<151> 2018-02-02
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成多肽（Description of Artificial Sequence:Synthetic polypeptide）
<220>
<221>
<222>
<223> 重组人酸性神经酰胺酶（Recombinant human acid ceramidase）
<400> 1
Met Pro Gly Arg Ser Cys Val Ala Leu Val Leu Leu Ala Ala Ala Val
1 5 10 15
Ser Cys Ala Val Ala Gln His Ala Pro Pro Trp Thr Glu Asp Cys Arg
20 25 30
Lys Ser Thr Tyr Pro Pro Ser Gly Pro Thr Tyr Arg Gly Ala Val Pro
35 40 45
Trp Tyr Thr Ile Asn Leu Asp Leu Pro Pro Tyr Lys Arg Trp His Glu
50 55 60
Leu Met Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Lys Val Ile Val Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Asn Met Ile Asn Thr Phe Val Pro Ser Gly Lys Ile Met Gln Val
85 90 95
Val Asp Glu Lys Leu Pro Gly Leu Leu Gly Asn Phe Pro Gly Pro Phe
100 105 110
Glu Glu Glu Met Lys Gly Ile Ala Ala Val Thr Asp Ile Pro Leu Gly
115 120 125
Glu Ile Ile Ser Phe Asn Ile Phe Tyr Glu Leu Phe Thr Ile Cys Thr
130 135 140
Ser Ile Val Ala Glu Asp Lys Lys Gly His Leu Ile His Gly Arg Asn
145 150 155 160
Met Asp Phe Gly Val Phe Leu Gly Trp Asn Ile Asn Asn Asp Thr Trp
165 170 175
Val Ile Thr Glu Gln Leu Lys Pro Leu Thr Val Asn Leu Asp Phe Gln
180 185 190
Arg Asn Asn Lys Thr Val Phe Lys Ala Ser Ser Phe Ala Gly Tyr Val
195 200 205
Gly Met Leu Thr Gly Phe Lys Pro Gly Leu Phe Ser Leu Thr Leu Asn
210 215 220
Glu Arg Phe Ser Ile Asn Gly Gly Tyr Leu Gly Ile Leu Glu Trp Ile
225 230 235 240
Leu Gly Lys Lys Asp Val Met Trp Ile Gly Phe Leu Thr Arg Thr Val
245 250 255
Leu Glu Asn Ser Thr Ser Tyr Glu Glu Ala Lys Asn Leu Leu Thr Lys
260 265 270
Thr Lys Ile Leu Ala Pro Ala Tyr Phe Ile Leu Gly Gly Asn Gln Ser
275 280 285
Gly Glu Gly Cys Val Ile Thr Arg Asp Arg Lys Glu Ser Leu Asp Val
290 295 300
Tyr Glu Leu Asp Ala Lys Gln Gly Arg Trp Tyr Val Val Gln Thr Asn
305 310 315 320
Tyr Asp Arg Trp Lys His Pro Phe Phe Leu Asp Asp Arg Arg Thr Pro
325 330 335
Ala Lys Met Cys Leu Asn Arg Thr Ser Gln Glu Asn Ile Ser Phe Glu
340 345 350
Thr Met Tyr Asp Val Leu Ser Thr Lys Pro Val Leu Asn Lys Leu Thr
355 360 365
Val Tyr Thr Thr Leu Ile Asp Val Thr Lys Gly Gln Phe Glu Thr Tyr
370 375 380
Leu Arg Asp Cys Pro Asp Pro Cys Ile Gly Trp
385 390 395
<210> 2
<211> 2618
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸（Description of Artificial Sequence:Synthetic polynucleotide）
<220>
<221>
<222>
<223> 编码重组人酸性神经酰胺酶（Encodes recombinant human acid ceramidase）
<400> 2
ggctcggtcc gactattgcc cgcggtgggg gagggggatg gatcacgcca cgcgccaaag 60
gcgatcgcga ctctccttct gcaggtagcc tggaaggctc tctctctttc tctacgccac 120
ccttttcgtg gcactgaaaa gccccgtcct ctcctcccag tcccgcctcc tccgagcgtt 180
ccccctactg cctggaatgg tgcggtccca ggtcgcgggt cacgcggcgg agggggcgtg 240
gcctgccccc ggcccagccg gctcttcttt gcctctgctg gagtccgggg agtggcgttg 300
gctgctagag cgatgccggg ccggagttgc gtcgccttag tcctcctggc tgccgccgtc 360
agctgtgccg tcgcgcagca cgcgccgccg tggacagagg actgcagaaa atcaacctat 420
cctccttcag gaccaacgta cagaggtgca gttccatggt acaccataaa tcttgactta 480
ccaccctaca aaagatggca tgaattgatg cttgacaagg caccagtgct aaaggttata 540
gtgaattctc tgaagaatat gataaataca ttcgtgccaa gtggaaaaat tatgcaggtg 600
gtggatgaaa aattgcctgg cctacttggc aactttcctg gcccttttga agaggaaatg 660
aagggtattg ccgctgttac tgatatacct ttaggagaga ttatttcatt caatattttt 720
tatgaattat ttaccatttg tacttcaata gtagcagaag acaaaaaagg tcatctaata 780
catgggagaa acatggattt tggagtattt cttgggtgga acataaataa tgatacctgg 840
gtcataactg agcaactaaa acctttaaca gtgaatttgg atttccaaag aaacaacaaa 900
actgtcttca aggcttcaag ctttgctggc tatgtgggca tgttaacagg attcaaacca 960
ggactgttca gtcttacact gaatgaacgt ttcagtataa atggtggtta tctgggtatt 1020
ctagaatgga ttctgggaaa gaaagatgtc atgtggatag ggttcctcac tagaacagtt 1080
ctggaaaata gcacaagtta tgaagaagcc aagaatttat tgaccaagac caagatattg 1140
gccccagcct actttatcct gggaggcaac cagtctgggg aaggttgtgt gattacacga 1200
gacagaaagg aatcattgga tgtatatgaa ctcgatgcta agcagggtag atggtatgtg 1260
gtacaaacaa attatgaccg ttggaaacat cccttcttcc ttgatgatcg cagaacgcct 1320
gcaaagatgt gtctgaaccg caccagccaa gagaatatct catttgaaac catgtatgat 1380
gtcctgtcaa caaaacctgt cctcaacaag ctgaccgtat acacaacctt gatagatgtt 1440
accaaaggtc aattcgaaac ttacctgcgg gactgccctg acccttgtat aggttggtga 1500
gcacacgtct ggcctacaga atgcggcctc tgagacatga agacaccatc tccatgtgac 1560
cgaacactgc agctgtctga ccttccaaag actaagactc gcggcaggtt ctctttgagt 1620
caatagcttg tcttcgtcca tctgttgaca aatgacagat cttttttttt tccccctatc 1680
agttgatttt tcttatttac agataacttc tttaggggaa gtaaaacagt catctagaat 1740
tcactgagtt ttgtttcact ttgacatttg gggatctggt gggcagtcga accatggtga 1800
actccacctc cgtggaataa atggagattc agcgtgggtg ttgaatccag cacgtctgtg 1860
tgagtaacgg gacagtaaac actccacatt cttcagtttt tcacttctac ctacatattt 1920
gtatgttttt ctgtataaca gccttttcct tctggttcta actgctgtta aaattaatat 1980
atcattatct ttgctgttat tgacagcgat ataattttat tacatatgat tagagggatg 2040
agacagacat tcacctgtat atttctttta atgggcacaa aatgggccct tgcctctaaa 2100
tagcactttt tggggttcaa gaagtaatca gtatgcaaag caatctttta tacaataatt 2160
gaagtgttcc ctttttcata attactctac ttcccagtaa ccctaaggaa gttgctaact 2220
taaaaaactg catcccacgt tctgttaatt tagtaaataa acaagtcaaa gacttgtgga 2280
aaataggaag tgaacccata ttttaaattc tcataagtag cattcatgta ataaacaggt 2340
ttttagtttg ttcttcagat tgatagggag ttttaaagaa attttagtag ttactaaaat 2400
tatgttactg tatttttcag aaatcaaact gcttatgaaa agtactaata gaacttgtta 2460
acctttctaa ccttcacgat taactgtgaa atgtacgtca tttgtgcaag accgtttgtc 2520
cacttcattt tgtataatca cagttgtgtt cctgacactc aataaacagt cactggaaag 2580
agtgccagtc agcagtcatg cacgctgatt gggtgtgt 2618
<210> 3
<211> 1276
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸（Description of Artificial Sequence:Synthetic polynucleotide）
<220>
<221>
<222>
<223> 编码重组人酸性神经酰胺酶（Encodes recombinant human acid ceramidase）
<400> 3
aagcttaccg ccaccatgaa ctgctgcatc ggcctgggtg agaaggcgcg tggctcgcac 60
cgcgccagct acccctccct gagcgccctc ttcaccgagg cgtccatcct cggattcggg 120
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ggcccgacgt accgcggcgc cgtcccctgg tacacgatca acctggacct ccccccgtac 240
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ttcaccatct gcacctccat cgtagccgag gacaagaagg gccacctgat ccacggtcgc 540
aacatggact tcggcgtctt cctgggctgg aacatcaaca acgacacctg ggtcatcacc 600
gagcagctga agccgctcac cgtgaacctc gatttccagc gcaacaacaa gacggtgttc 660
aaggccagct ccttcgccgg gtacgtcggg atgctcacgg gcttcaagcc gggactgttc 720
tcgctgaccc tcaacgagcg gttctccatc aacgggggct acctcggcat cctggagtgg 780
attctcggca agaaggacgt gatgtggatc ggcttcctca cacggaccgt gctggaaaac 840
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<211> 1276
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸（Description of Artificial Sequence:Synthetic polynucleotide）
<220>
<221>
<222>
<223> 编码重组人酸性神经酰胺酶（Encodes recombinant human acid ceramidase）
<400> 4
aagcttaccg ccaccatgaa ctgctgcatc gggctgggag agaaagctcg cgggtcccac 60
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ggaccaacgt acagaggtgc agttccatgg tacaccataa atcttgactt accaccctac 240
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tgtctgaacc gcaccagcca agagaatatc tcatttgaaa ccatgtatga tgtcctgtca 1140
acaaaacctg tcctcaacaa gctgaccgta tacacaacct tgatagatgt taccaaaggt 1200
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gtcggggcgg ccggcc 1276
机译： 治疗法伯病的方法
机译： 用于治疗法布里病的方法和组合物
机译： 用于治疗法布里病的方法和组合物
