生防植物内生细菌ZN-S2及其应用

技术领域

本发明属于作物病害防控技术领域，尤其涉及一种生防植物内生细菌ZN-S2及其在经济作物细菌性防治中的应用。

背景技术

劳尔氏菌(Ralstonia sp.)、欧文氏菌(Ervinia sp.)、黄单胞菌(Xanthomonassp.)或假单胞菌(Pseudomonas sp.)引起的作物细菌性病害，是经济作物生产中的主要病害，每年因该类病害造成的损失惨重，严重时可导致单季作物绝收。此类病原菌可通过雨水、种子、植株残体或农事操作在田间传播，通过植株气孔、伤口等处入侵植物，可快速引发植株的软腐、枯萎，导致植株器官破坏和功能丧失。部分病菌侵染的后期可在植株的表面产生肉眼清晰可见的水滴状菌脓，含大量病原菌体，可通过风力、水流或打枝、抹芽农事操作等途径传播到临近的植株表面进行侵染。

防治细菌性病害的方式依然是抗病育种为主，化学防治为辅。其中育种由于周期长，投入成本高而受限制；化学防治具有着快捷、廉价、高效的，但目前对细菌性病害有效的药剂主要有：铜制剂、锌制剂、抗生素类、噻霉酮等少数农药。但频繁使用化学农药及细菌繁殖遗传变异快和适合度高的特点，使得病原细菌快速产生抗性，影响药剂防治效果。而利用生防菌的生物防治方法可有效解决及避免药剂的抗性问题，生物防治具有高效且无毒、无害、无污染、不产生抗药性，不仅符合人们对绿色农产品的需求，而且为农业的可持续发展提供了保障，因此，植物细菌性病害生物防治的研究越来越受到重视。

植物内生细菌(Endophyte Bacteria)是指生活在植物活组织内而不引起任何直接和明显植物病变的一大类细菌，内生细菌与宿主植物关系密切，不仅将植物作为栖息场所，而且它对寄主植物有促生、防病、内生固氮等多方面的生物学作用。

植物内生菌具有着丰富的多样性，主要包括物种多样性、宿主多样性、生境多样性、形态多样性以及遗传多样性，是生防菌株重要的宝库；其次内生细菌在植株的体内，在病害爆发时具有更强的竞争优势；最后内生细菌来源于植物体内，与土壤中分离得到的根际生防菌株相比更易在植株体内定殖。

目前现有的解淀粉芽孢杆菌有：

1、2015107400654的发明《一种解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensD2WM及制备方法和应用》公开了一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM(CCTCCNo：M2015623)，能高效拮抗油茶炭疽病、油茶叶斑病、油茶黑斑病、油茶溃疡病等多种病害，且抑菌效果显著，该解淀粉芽孢杆菌在制备治疗或预防蔬菜软腐病、油茶病害的药物。

2、2017102113455的发明《一种高寒草地牧草内生细菌解淀粉芽孢杆菌菌株、微生物菌剂及其制备方法和应用》公开了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)QLY006(CGMCC No.13049)，能抑制番茄丁香假单胞叶斑病菌(Pseudomonas syringapv.tomato)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)。

3、2019104711556的发明《具有多种防病作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用、生防菌剂》公开了解淀粉芽孢杆菌MS021(CCTCC NO:M 2019268)；其对葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、苹果拟茎点霉、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、君子兰茎基腐病菌、南天竹炭疽病菌以及解淀粉欧文氏菌都具有均具有显著的拮抗作用。

4、2018107716580的发明《一株有效控制茄劳尔氏菌并促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌》公开了解淀粉芽孢杆菌CAS02(CGMCC NO.15514)，不仅对辣椒植株有促生作用，还可以抑制辣椒青枯病菌等多种病原菌的生长。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种解淀粉芽孢杆菌ZN-S2及其应用，生防植物内生细菌ZN-S2对可引发植物病害的假单胞菌、黄单胞菌、欧文氏菌、劳尔氏菌等细菌具有较好的抑制作用，对田间经济作物细菌性病害具有较好的防治效果。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZN-S2，其保藏号：CGMCC NO：18962。

本发明还同时提供了上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZN-S2的用途：用于抑制植物病原细菌的生长，从而防控植物细菌性病害。

作为本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZN-S2的用途的改进：

植物病原细菌为假单胞菌、黄单胞菌、欧文氏菌、劳尔氏菌；

防治细菌引起的软腐病、青枯病、角斑病、白叶枯病；

植物为水稻、番茄或黄瓜。

欧文氏菌对应的为白菜软腐病、甘薯茎腐病、梨枯梢病；黄单胞菌对应的为水稻白叶枯病、水稻细条病、西兰花黑腐病；假单胞菌对应的为黄瓜细菌性角斑病、松花菜花球腐烂病、西兰花花球腐烂病；劳尔氏菌对应的为番茄青枯。

本发明的菌株ZN-S2，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.18962，保藏时间2019年11月18日。

本发明的菌株ZN-S2为生防植物内生细菌ZN-S，分离自“晶品1号”铁皮石斛植株内部，是从86株内生细菌中筛选获得。

该菌在NA平板上培养可观察到乳白色不透明菌落，菌落扁平较大(直径可在3.0mm以上)，表面粗糙，有隆起，边缘不规则，在多种培养基上均不产色素，随后在菌落表面出现大量芽孢；菌体杆状，革兰氏染色阳性。在适宜条件下可产生芽孢。

本发明实际喷施时：将纯化发酵液稀释至浓度为10

本发明具有如下技术优势：

(1)本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZN-S2为植物体内分离获得的内生细菌，与其他生防菌株相比定殖性能更高，与植株相容性更强。

(2)本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZN-S2在平板拮抗实验中显示对假单胞菌、黄单胞菌、欧文氏菌、劳尔氏菌等病原菌均有较好的抑制作用，可将其应用于农作物细菌性病害的生物防治。

(3)本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZN-S2的细菌发酵液有效成分在纯化后，对番茄青枯病(劳尔氏菌)、水稻白叶枯病(黄单胞菌)等防治效果好，可将其应用于农作物该类病害中的生物防治。

(4)本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZN-S2应用于作物细菌性病害的防治，可克服化学农药使用所带来的一系列问题，有利于农产品的绿色生产，种植户可以不用或是减少其它化学农药的用量，不仅可以为农民减少开支，而且有利于提高产品质量和可持续。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为解淀粉芽孢杆菌ZN-S2菌落(左)、菌体形态特征图(右)。

图2为铁皮石斛内生细菌ZN-S2菌株16S rRNA系统发育树。

图3为解淀粉芽孢杆菌ZN-S2对不同作物病害的抑菌试验。

图4为解淀粉芽孢杆菌ZN-S2平板拮抗试验模型图。

图5为解淀粉芽孢杆菌ZN-S2对水稻白叶枯病防治效果评价。

图6为ZN-S2和其他类似菌株对水稻白叶枯病的防效。

具体实施方式

实施例1、芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株的分离培养与鉴定：

牛肉膏蛋白胨培养基(NA)：在胰蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、酵母粉1g、D-葡萄糖琼脂10g、琼脂15g中加入蒸馏水定容至1000mL；然后进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。

不加琼脂即为NB培养液。

在实验室中按下列条件分离培养，即可获得本发明所述的芽孢杆菌。

从浙江采集栽培铁皮石斛，将采集的石斛用自来水漂洗干净，石斛根茎在75％(v/v)酒精溶液中消毒30秒，然后在1％(v/v)次氯酸钠溶液中消毒10分种，无菌水漂洗3次。用无菌剪刀将根和茎剪碎，并用无菌研钵磨碎，适量无菌水悬浮植物碎末，用接种环蘸取悬浮液，在事先准备好的NA培养基平皿上划线，25℃暗培养；待菌落长出后，挑选单一菌落，用接种环在另一NA培养基平皿上进行“Z”字型划板。在NA平板上连续三次划板接种，确认为单菌落，没有其它细菌共同生长，认为获得纯培养，命名为ZN-S2。

将菌株ZN-S2进行了保藏，保藏信息如下：保藏名称：解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.18962，保藏时间2019年11月18日。

实施例2、菌株ZN-S2的鉴定：

本发明的芽孢杆菌菌株ZN-S2(即Bacillus amyloliquefaciens ZN-S2 CGMCCNO.18962)具有如下特性：菌种在NA平板上的适宜生长温度为37℃；菌落白色，表面干燥，培养24小时后直径0.5厘米，培养36小时后出现白色芽孢，菌落形状偏圆形，但边界不规则，菌体杆状，革兰氏染色呈阳性。形态图如图1所示。

将提取的ZN-S2基因组DNA进行16S rRNA测序，得到一段全长为1397bp的基因序列，在NCBI中BLAST上进行同源性比对，结果显示ZN-S2与芽孢杆菌(Bacillus sp)相似性较高。用MEGA version 6.0软件，采Maximum Likelihood法进行遗传距离分析，绘制系统发育进化树(图2)，菌株ZN-S2与Bacillus amyloliquefaciens FZB42的遗传距离最近，聚于同一分支，且Bootstrap自举值达到90。结合形态学，推测ZN-S2菌株是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

即解淀粉芽孢杆菌ZN-S2属于细菌界(Bacteria)，厚壁菌门(Firmicutes)，芽孢杆菌纲(Bacilli)，芽孢杆菌亚目(Bacillales)，芽孢杆菌科(Bacillaceae)，芽孢杆菌属(Bacillus)。

实施例3、芽孢杆菌ZN-S2对不同作物病原细菌的拮抗作用(图3、图4)：

(1)作物病原菌平板制备：按实施例1所述方法，制备NA平板，将制备好的培养基在超净工作台中倒入无菌培养皿(Φ9cm)中，制成约5mm厚的NA平板。将事先在培养液中活化的欧文氏菌(白菜软腐病、甘薯茎腐病、梨枯梢病)，黄单胞菌(水稻白叶枯病、水稻细条病、西兰花黑腐病)，假单胞菌(黄瓜细菌性角斑病、松花菜花球腐烂病、西兰花花球腐烂病)，劳尔氏菌(番茄青枯)等病原细菌，用移液枪分别吸取200μl致病菌菌液(NB培养液中活化的菌液)滴入灭菌的培养皿中，并倒入冷却至40℃-50℃的NA培养基20mL，平铺培养皿一层即可，轻轻摇晃使培养基与菌液混和均匀，静置冷却凝固，每个病原菌制备4个平板，共40个带菌平板，备用。

(2)ZN-S2 NB菌液的制备：在实施例1所述NA平板上挑取ZN-S2形态正常的单菌落接种到100mL NB培养基中置于37℃中，180r/min振荡培养，48h后用分光光度计在600nm下将ZN-S2菌液的OD值调至为1.0，备用。

(3)ZN-S2纸碟准备(为常规技术)：

将定量滤纸用打孔器(Φ0.5cm)切成纸碟，高温灭菌后备用。在步骤(1)所述的平板中，按十字放入纸碟(距离培养皿中心2cm)，并在每种病原菌的四个平板的纸碟上各滴加5μL ZN-S2 NB菌液(步骤(2)所得)，另一平板滴加5μL无菌的NB培养液，作为空白对照。将制备好的平板置于28℃培养箱中，避光培养48h后，观察并测量抑菌圈的直径。

结果表明：用ZN-S2处理过的平板，均出现明显的抑菌圈直径，如图3所示，说明ZN-S2对白菜软腐病等病原细菌有明显的拮抗作用。

实施例4、芽孢杆菌ZN-S2处理种子对防治水稻白叶枯病效果评价

(1)芽孢杆菌ZN-S2菌液处理种子：将实施例3步骤(2)所得的菌液，用无菌水稀释成50倍、100倍、200倍和400倍稀释液浸泡水稻种子，置于30℃人工气候箱中进行浸种催芽，浸种处理48h，隔24h更换菌液一次，将发芽的水稻种子播种于长宽为20cm×15cm的盆钵中，每盆播3行，每行10株，每个处理3次重复，随机排列，以无菌水浸种处理为对照，播种完成后覆膜保湿，膜上扎孔通气，放入人工气候箱中28℃培养3d，出苗后将盆钵移至玻璃温室中培养，每隔1天浇水1次，进行正常管理，备用。

(2)致病菌菌液的制备：挑取白叶枯病原菌单菌落接种于装有50mL NB培养液的250mL锥形瓶中，28℃，180r/min恒温振荡培养，24h后将菌液转至50mL无菌的离心管中6000r/min离心10min，弃上清，用无菌的0.05％Tween-20悬浮菌体，将白叶枯病原菌菌悬液的OD

(3)水稻白叶枯病接种：采用剪叶法接种水稻白叶枯病，水稻长到4-5叶时，选取生长良好的水稻叶片，用已灭菌的手术剪刀蘸取步骤(2)所述的水稻白叶枯病原菌菌液，在距离叶尖1.0cm处垂直于主脉剪下叶尖，用吸饱白叶枯病原菌菌液的脱脂棉包裹伤口，再盖膜保湿，每株水稻接种1片叶片，每处理接种90株。室内温度保持在30℃左右，相对湿度保持在90％左右，待CK发病叶面积约为1/2时，测量各处理叶片(A1～A4)的发病面积(图5)，并计算防治效果：

防治效果＝(对照病斑长度-处理病斑长度)/对照病斑长度×100％。

(4)结果表明在95％置信区间时，ZN-S2稀释50～200倍后处理叶片，对水稻白叶枯病的抑制率最高为57.37％，与对照有显著差异(p<0.05)，证明ZN-S2对水稻白叶枯病有明显的抑制效果(表1)。

表1、ZN-S2对苗期水稻白叶枯病的防治效果

注：不同小写字母表示同列数据差异性显著(ANOVA,Duncan,P<0.05)数值：平均值±标准差。

实施例5、芽孢杆菌ZN-S2茎叶喷雾处理防治水稻白叶枯病的效果评价

(1)水稻盆栽苗的制备：将水稻种子经表面杀菌后，置于30℃人工气候箱中进行无菌水浸种催芽3d；同时将栽培土高压蒸汽灭菌(121℃；110KPa)50min，25℃培养箱中放置24h后再重复灭菌一次，土壤冷却后装盆，将发芽的水稻种子播种于长宽为20cm×15cm的盆钵中，每盆播20粒，水稻苗待长至4叶期时供试验用。

(2)接种处理：待水稻苗长至4叶期时，按实施例4步骤(3)所述方法接种水稻白叶枯病原菌，接种保湿24h后。将实施例3步骤(2)所述菌液，用无菌水稀释50倍和100倍后喷雾处理(喷雾2次，间隔3d)步骤(1)所述水稻植株，室温30℃，相对湿度90％左右，保湿培养。待CK发病叶面积约为1/2时，测量叶片的发病面积，并按实施例4步骤(3)所述公式计算防治效果。

(3)结果表明在95％置信区间时，ZN-S2稀释50倍和100倍后茎叶喷雾处理水稻苗，对水稻白叶枯病的抑制率最高为分别为81.05％和65.49％，证明ZN-S2茎叶处理对水稻白叶枯病有明显的抑制效果。

实施例6、不同菌株茎叶喷雾处理防治水稻白叶枯病的效果评价

(1)试验方法

在发生白叶枯病的水稻田块，随机划分为18个小区(每小区20m

ZN-S2组：实施例3步骤(2)所述菌液，用清水稀释100倍后(约10

对比菌株：CCTCC No:M2015623(编号C1)；CGMCC No:13049(编号C2)；CCTCC NO:M2019268(编号C3)；CGMCC NO:15514(编号C4)，制备四种菌株的菌液，使用前用清水稀释，并将菌密度调成约10

清水对照组：以清水直接进行喷施，喷施方式和用量同上，设3个重复。

喷施后的7d、14d进行调查，每小区随机调查20丛水稻，每丛调查10张全叶，按如下病情分级标准进行分级统计：

0级：无病

1级：病斑面积占整片叶面积的5％以下；

3级：病斑面积占整片叶面积的6％～10％；

5级：病斑面积占整片叶面积的11％～20％；

7级：病斑面积占整片叶面积的21％～50％；

9级：病斑面积占整片叶面积的50％以上。

按下列公式计算不同菌株对水稻白叶枯病的防效。

(2)结果分析

本发明菌株ZN-S2与CCTCC No:M2015623(B.amyloliquefaciens D2WM)、CGMCCNo:13049(解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens QLY006)、CCTCC NO:M 2019268(解淀粉芽孢杆菌MS021)、CGMCC NO:15514(解淀粉芽孢杆菌CAS02)喷施后14d，所得效果对比如图6所示；该四个菌株对白叶枯病的防效均显著低于ZN-S2。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。