子宫内菌群改善用剂和组合物、及子宫内菌群被改善或正常化了的状态的判定方法

技术领域

本发明涉及用于改善子宫内的菌群的剂和子宫内的菌群改善用组合物、以及子宫内菌群被改善或正常化了的状态的判定方法。

背景技术

已知在生殖适龄期的健康的女性的阴道内，乳杆菌(Lactobacillus)属细菌丰富存在，通过乳杆菌产生的乳酸、抗菌物质，形成其它病原性细菌、病毒等不能增殖的环境，乳杆菌担负守护阴道避免感染症的作用。

另一方面，关于子宫内的细菌环境，虽然与阴道在空间上相连，但是由于从宫颈管分泌的粘膜屏障的存在，可以认为是无菌的(非专利文献1)。在2000年初，对各个细菌确立特征性16S核糖体RNA(rRNA)基因的DNA扩增法，可以以被离析出的细菌的DNA序列信息鉴定细菌。进一步，可以一次解析庞大的DNA的新一代测序技术出现，将试样中存在的来源于全部细菌的16S rRNA基因汇总进行解析，从而能够在不离析的情况下调查难培养性、微量的细菌的存在。通过多种细菌而复杂构成的细菌群落被称为菌群、微生物群、菌丛，可以把握哪种细菌占整体的多少比例。近年来，通过使用了该新一代测序仪的菌群解析，明确了在子宫内也存在菌群。2015年美国罗格斯大学的Franasiak等人调查了使用新一代测序仪进行体外受精时的子宫内细菌环境，报导了在子宫内也大量栖息乳杆菌属细菌(非专利文献2)。同年，华盛顿大学的Mitchell等人也报导了在子宫内也具有来源于阴道内的菌群，在正常的子宫内膜大量栖息乳杆菌属细菌(非专利文献3)。

生殖器内的细菌环境在生殖医疗中是重要的，报导了与不孕症、反复流产/早产或死产的不育症有关。特别是，子宫内菌群为了理解将体外受精的受精卵送回的子宫内的环境也是非常重要的。2016年西班牙的Moreno等人调查了不孕与阴道和子宫内的菌群的关系。其结果，报导了子宫内的菌群在着床期间中非常稳定地保持，此外，乳杆菌属细菌的降低与体外授精患者的妊娠率/妊娠继续率/生产成功率的降低相关等(非专利文献4)。同样地，2017年中国的Jia等人调查了女性生殖管的菌群，报导了在从阴道到输卵管的生殖管中，独特的菌群固定存在。阴道内和子宫内的菌与伴随不孕的生殖器疾病显示相关，暗示出今后可作为疾病的生物标志物而使用的可能性(非专利文献5)。

本发明人等为了检测与阴道相比细菌的存在量少大约1,000～10,000倍的子宫内菌群，确立了独特的样品采取方法和解析方法(非专利文献6)。通过这些方法，调查了健康者志愿者7名、体外受精实施患者79名、一般不孕患者23名的子宫内和阴道内菌群，结果在整体的约30％的被检者中，确认了阴道内菌群与子宫内菌群的背离。此外，子宫内乳杆菌占有率在健康者志愿者中为平均99.50％，与此相对，对于体外受精实施患者，为平均63.90％。进一步，在研究期间中妊娠的18名乳杆菌占有率变为96.45％，对于妊娠组，明确了子宫内的乳杆菌占有率高。

如以上所述那样，通过新的解析技术而明确了在子宫内构成与阴道内不同的菌群。到现在为止，指出了子宫内菌群除了妊娠成效以外，还与子宫内膜异位症、子宫内膜癌、子宫内膜炎、绒毛膜羊膜炎相关(非专利文献1)。宫颈部的感染症被称为宫颈炎。另一方面，子宫体部的炎症根据罹患病灶，将子宫内膜的炎症称为子宫内膜炎，将肌层的炎症称为子宫肌层炎，将浆膜的炎症称为子宫周围炎，但大部分为子宫内膜炎。大部分的子宫内膜炎为上行性感染，作为病原菌，可举出链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、厌氧性菌等。在妊娠期中如果这些菌感染绒毛、羊水，则引起绒毛膜羊膜炎，成为早产的原因。这样的感染可以认为起因于轻度的子宫内菌群紊乱，因此子宫内菌群的改善是重要的。

然而，对于如以往那样的、阴道内洗涤、抗生素施与、激素疗法等各种处置，实际情况是对子宫内环境的改善未发挥充分的效果。作为代表性抗生素的氨苄西林、阿莫西林等青霉素系抗菌药对厌氧性菌的效果弱，即使在JAID/JSC感染症治疗指南2014，Sanford(JAID/JSC感染症治療ガイドライン2014，サンフォード)中也不作为细菌性阴道症的治疗法而推荐。因此，对于这些单独的抗生素，可以认为增加乳杆菌的效果低。此外，作为由抗菌药治疗引起的副作用，也已知很少对皮肤、肝脏等产生障碍。

这样，通过将子宫内菌群的紊乱正常化的治疗法的开发的必要性提高，但迄今为止，关于改善子宫内菌群的治疗/介入方法的报导完全不存在。

乳铁蛋白为在1939年在牛乳中发现的铁结合性的蛋白质，然后，表明了在除牛以外的大量哺乳动物的乳汁中包含。对于人，乳铁蛋白在母乳、特别是初乳中大量包含，在成人中也是在泪、唾液、胰液和其它外分泌液、中性粒细胞中包含的铁结合性的生理活性蛋白质。乳铁蛋白通过夺取细菌的生存和增殖所需要的铁的能力而具有抑菌活性，此外，具有经由细菌膜向脂多糖的结合的细菌溶解、对上皮细胞的细菌粘接的阻碍、对宿主细胞的侵入阻碍这样的抗菌活性(非专利文献7)。

2012年，Giunta等人报导了向铁缺乏症的孕妇经口施与1天200mg的乳铁蛋白一个月，结果阴道内的感染症治愈，阴道内的微生物菌群正常化，早产风险降低了(非专利文献8)。同样地2014年，大槻等人报导了作为来源于乳的蛋白成分之一的乳铁蛋白对于早产的预防是有效的(非专利文献9)。根据2017年的大槻等人的论文，报导了反复早产的难治性细菌性阴道炎患者的女性的阴道内的菌群，作为在正常的阴道内多的乳酸菌的一种的乳杆菌属细菌显著减少，通过长期经口(700mg/天)和在阴道内直接施与乳铁蛋白，从而乳杆菌属细菌增加，达到妊娠，然后在不早产的情况下生产(非专利文献10)。2017年，意大利的Pino等人报导了向细菌性阴道炎的患者阴道内施与100～200mg的乳铁蛋白，在2周后进行了细菌的检查，结果加德纳菌(Gardnerella)、普雷沃氏菌(Prevotella)、和毛螺菌(Lachnospira)显著减少，乳杆菌增加了(非专利文献11)。通过以上，确认到乳铁蛋白对乳杆菌在阴道内显示增殖效果的益生(prebiotics)作用，显示出乳铁蛋白对于细菌性阴道炎的治疗也是有效的。

这样，关于作为生理活性蛋白质的乳铁蛋白，改善阴道内菌群的效果近年来相继发表，但着眼于子宫内菌群的效果仍然未知。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Baker JM et al.,Front Immunol.2018Mar 2；9:208.UterineMicrobiota:Residents,Tourists,or invaders？

非专利文献2：Franasiak JM et al.,J Assist Reprod Genet.2016Jan；33(1):129-36.Endometrial microbiome at the time of embryo transfer:next-generationsequencing of the 16S ribosomal subunit.

非专利文献3：Mitchell CM et al.,Am J Obstet Gynecol.2015May；212(5):611.e1-9.Colonization of the upper genital tract by vaginal bacterial speciesin nonpregnant women.

非专利文献4：Moreno I et al.,Am J Obstet Gynecol.2016Dec；215(6):684-703.Evidence that the endometrial microbiota has an effect on implantationsuccess or failure.

非专利文献5：Chen C et al.,Nat Commun.2017Oct 17；8(1):875.Themicrobiota continuum along the female reproductive tract and its relation touterine-related diseases.

非专利文献6：Kyono K et al.,Reprod Med Biol.Jul；17(3):297-306.Analysisof endometrial microbiota by 16S ribosomal RNA gene sequencing amonginfertile patients:a single-center pilot study.

非专利文献7：Valenti P et al.Front Immunol.2018；9:376.Role ofLactobacilli and Lactoferrin in the Mucosal Cervicovaginal Defense

非专利文献8：Giunta G et al.,Mol Med Rep.2012Jan；5(1):162-6.Influenceof lactoferrin in preventing preterm delivery:a pilot study.

非专利文献9：Otsuki et al.,J Obstet Gynaecol Res.2014Feb；40(2):583-5.Administration of oral and vaginal prebiotic lactoferrin for a woman with arefractory vaginitis recurring preterm delivery:appearance of lactobacillusin vaginal flora followed by term delivery.

非专利文献10：Otsuki et al.,Biochem Cell Biol.2017Feb；95(1):31-33.Effects of lactoferrin in 6patients with refractory bacterial vaginosis.

非专利文献11：Pino A et al.,Microb Ecol Health Dis.2017；28(1):1357417.Bacterial biota of women with bacterial vaginosis treated withlactoferrin:an open prospective randomized trial.

非专利文献12：Walters,W.et al.,mSystems,2016；1(1),e00009-15.Improvedbacterial 16S rRNA gene(V4 and V4-5)and fungal internal transcribed spacermarker gene primers for microbial community surveys.

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的是提供子宫内的菌群的改善剂和改善用组合物。本发明进一步的目的是提供判定子宫内的菌群的改善或正常化的方法。

用于解决课题的方法

本发明人等发现乳铁蛋白改善子宫内菌群，从而完成了本发明。

根据本发明，提供：

〔1〕一种子宫内的菌群改善用剂，其以乳铁蛋白或其盐作为有效成分；

〔2〕一种起因于子宫内的菌群紊乱的疾病的治疗或预防剂，其以乳铁蛋白或其盐作为有效成分，上述起因于子宫内的菌群紊乱的疾病为不孕症、流产、早产、不育症、子宫内膜异位症、子宫内膜癌、宫颈炎、子宫内膜炎、和/或绒毛膜羊膜炎等；

〔3〕一种组合物，其含有上述〔1〕或〔2〕所述的剂；

〔4〕根据上述〔3〕所述的组合物，其为药物组合物；

〔5〕根据上述〔3〕所述的组合物，其为饮食品组合物；

〔6〕一种子宫内菌群被改善或正常化了的状态的判定方法，其特征在于，包含下述工序：使用在上述〔1〕～〔5〕中任一项所述的剂或组合物的施与或摄取前、施与或摄取中、或者施与或摄取后的2个以上时刻从被检者的子宫内采取到的多个检体，利用基于16S核糖体RNA基因的扩增的菌群解析方法，测定子宫内菌群中的乳杆菌占有率的工序；以及算出上述多个检体的上述占有率之差的工序；

〔7〕根据上述〔6〕所述的方法，上述菌群解析方法为以16S核糖体V4区域作为扩增对象的扩增子测序法；

〔8〕一种起因于子宫内菌群紊乱的疾病的治疗或预防方法，其包含下述步骤：将以乳铁蛋白或其盐作为有效成分的子宫内的菌群改善用剂或含有该剂的组合物施与到对象；

〔9〕根据上述〔8〕所述的方法，上述起因于子宫内的菌群紊乱的疾病为不孕症、流产、早产、不育症、子宫内膜异位症、子宫内膜癌、宫颈炎、子宫内膜炎、和绒毛膜羊膜炎中的任1种以上。

发明的效果

通过本发明，提供将子宫内菌群正常化的有效手段。乳铁蛋白为在母乳中也包含的成分，安全性非常高，几乎没有副作用的担心，因此与其它药品等的并用也容易。此外，乳铁蛋白也作为食品、补充剂的成分而利用，能够容易地经口施与或摄取，因此在不需要医疗机构的治疗的情况下，就可以改善子宫内菌群。因此，通过本发明的剂或组合物，可以安全简便地将子宫内菌群正常化。

通过本发明的子宫内菌群被改善或正常化了的状态的判定方法，可以简便地判定本发明的剂或组合物的效果，以是否继续本发明的剂或组合物的施与或摄取为代表，可以容易地进行是否追加或变更其它治疗等的判断。

具体实施方式

本发明的剂以乳铁蛋白或其盐作为有效成分。此外，本发明的组合物、例如药物组合物或饮食品组合物为含有那样的以乳铁蛋白作为有效成分的本发明的剂的组合物。本发明的剂、或组合物例如药物组合物或饮食品组合物对子宫内菌群改善是有效的。在本发明中所谓子宫内菌群的改善，是指使子宫内菌群中的乳杆菌的占有率提高。下文对判定子宫内菌群的改善或正常化的方法进行描述。

乳铁蛋白为分子量为8万左右的高分子，具有与2个3价铁离子形成螯合物的性质，但在本发明中使用的“乳铁蛋白”，不限于从哺乳动物的乳汁等提取的来源于生物体的乳铁蛋白，只要发挥乳铁蛋白的生物活性、特别是子宫内膜菌群的改善作用，就可以使用任何乳铁蛋白。如果举出其例子，则有由以人为代表的各种哺乳动物(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊、骆驼等)获得的天然的乳铁蛋白(例如，牛乳所包含的牛乳铁蛋白)、从乳铁蛋白通过常规方法将铁除去了的脱铁乳铁蛋白(无铁离子型)、使金属(铁、铜、锌、锰等)离子与脱铁乳铁蛋白螯合而成的金属饱和或不饱和乳铁蛋白、通过基因工程技术而生产的基因重组乳铁蛋白、和使聚乙二醇链与这些乳铁蛋白结合而成的物质等。另外，在基因重组乳铁蛋白中，除了基于被改变了的乳铁蛋白基因而产生的重组型乳铁蛋白以外，也包含转基因动物泌乳的乳铁蛋白、乳铁蛋白的活性片段等功能性等效物。

在本发明中能够使用的所谓乳铁蛋白的盐，为上述那样的任意的乳铁蛋白的、生理学上能够容许的盐例如为钠盐、钾盐、硫酸盐、磷酸盐等。

本发明的剂或组合物可以包含上述那样的乳铁蛋白中的仅1种，或也可以包含2种以上。乳铁蛋白为公知的物质，因此可以使用市售品。此外，可以使用从含有乳铁蛋白的乳等，通过公知的方法例如使用磺化载体将乳铁蛋白纯化的方法(日本特开平3-109400号公报)纯化而得的乳铁蛋白。进而，根据用途，也可以使用为来自乳等的分级物并且以高浓度含有乳铁蛋白的物质(例如，从乳中除去了糖类的分级物)。

本发明的剂以乳铁蛋白作为唯一的必需成分，但本发明的剂或组合物可以根据需要包含在制药或食品业界中公知的各种成分、添加剂。本发明的药物组合物、饮食品组合物的形态没有特别限定。本发明的饮食品组合物被经口施与，其形态可以为各种食品、食品原材料、饮料、饮剂等形态。本发明的组合物优选为方便经口施与的剂型例如粉末剂、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形态。

作为本发明的药物组合物、饮食品组合物那样的组合物可以包含的添加剂，可以举出在制药或食品业界中被日常使用的赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、表面活性剂、流动性促进剂、着色剂、香料等。这些添加剂根据所希望的剂型等来适当选择。

例如，在本发明的药物组合物或饮食品组合物为粉末剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂等形态的情况下，作为所使用的赋形剂，有乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、乳糖醇等单糖或二糖类、玉米淀粉、马铃薯淀粉那样的淀粉类、结晶纤维素、作为无机物的轻质硅胶、合成硅酸铝、偏硅酸铝镁(Magnesium Aluminometasilicate)、磷酸氢钙、二氧化硅等。此外，根据需要，除了上述赋形剂以外，还可以适当使用粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动性促进剂、着色剂、香料等。

作为崩解剂，有淀粉类、羧基甲基纤维素(CMC)、羟基丙基纤维素(HPC)、羧基甲基纤维素·钠盐、聚乙烯吡咯烷酮等。作为润滑剂，可以使用蔗糖脂肪酸酯、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

作为粘合剂，可举出例如，淀粉、糊精、阿拉伯胶末、明胶、羟基丙基淀粉、羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、结晶性纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮。

作为表面活性剂，可举出大豆卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯等，作为润滑剂，可举出滑石、蜡、蔗糖脂肪酸酯、加氢植物油、硬脂酸钙、硬脂酸镁等，作为流动性促进剂，可举出硅酸酐、干燥氢氧化铝、硅酸镁等。

乳铁蛋白在高温/多湿条件下不稳定，因此本发明的组合物优选在干燥状态下制剂化。

乳铁蛋白粉末通常比重非常轻，因此不能直接压片，因此为了获得作为更加维持了药理效果的稳定的制剂的本发明的组合物，例如，将有效成分与赋形剂、粘合剂、崩解剂混合，将混合物用扒渣机(slag machine)进行强压成型而制作薄而大的平坦圆盘，将其压碎而过筛，制备一定大小的颗粒。在制成片剂的情况下，在颗粒中加入润滑剂进行压片，将片剂根据需要用涂布皮膜覆盖而制品化为好。此外，在制成胶囊剂的情况下，将颗粒的一定量填充于胶囊，制成胶囊剂为好。

本发明的经口(药物或饮食品)组合物可以制成肠溶性的制剂。已知乳铁蛋白在胃酸酸性的状态下，通过作为胃内的蛋白分解酶的胃蛋白酶而被分解，此外，可以认为乳铁蛋白的吸收作用部位存在于以小肠作为中心的肠道。将乳铁蛋白加工为肠溶性制剂的方法没有特别限定。例如，为了制成肠溶性，用以对胃液具有抵抗性且在小肠内溶解的基剂例如选自虫胶、羟基丙基甲基纤维素/邻苯二甲酸酯、羧基甲基乙基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、甲基丙烯酸共聚物、不溶于水的乙基纤维素和甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物中的基剂作为主成分的皮膜来调制肠溶性的胶囊，填充包含有效成分的颗粒，或者将在包含有效成分的颗粒中加入润滑剂进行压片而获得的片剂用上述皮膜进行涂布为好。

制造的组合物是否为肠溶性可以通过使用第一液(pH1.2，日本药典/一般试验法41)和第二液(pH6.8)而试验崩解性来确认，所述第一液是在氯化钠2.0g中加入盐酸和水进行溶解，制成1000ml而得，所述第二液是在0.2M磷酸二氢钾试液250ml中加入0.2N氢氧化钠试液118ml，并且加水制成1000ml而得。即使在第一液中浸泡120分钟也不崩解，在第二液中浸泡60分钟则崩解的片剂或颗粒是在胃中不溶解，流入到十二指肠后才开始崩解，有效成分被溶出的片剂或颗粒，可以判断为肠溶性。

除了肠溶性制剂的使用以外，作为可以将乳铁蛋白送到肠道的方法，可举出使用由双层脂质层构成的脂质体制剂。脂质体制剂在胃内也不崩解，在小肠中通过胆汁而乳化、崩解，因此可以将乳铁蛋白送到肠道的吸收部位。或者，可以为单纯地使胃内的pH高，即并用碱性剂，使胃蛋白酶不作用于乳铁蛋白的方法。

本发明的剂或组合物的施与途径例如为经口、经皮、注射、经肠、直肠内施与等。本发明的药物组合物和饮食品组合物的优选的施与途径为经口。

本发明的剂或组合物可以单独施与，也可以与其它药剂并用。此外，在将本发明的剂或组合物与其它药剂并用的情况下，可以将两者同时使用，也可以前后使用。

对子宫内菌群的改善有效的本发明的剂或组合物的每1天的施与或摄取量根据其制剂形态、施与方法、对象者的年龄和体重等不同而不同，但对于人，一般而言，可以将作为有效成分每1天以乳铁蛋白计为约0.1mg～约5,000mg、优选为约0.5mg～约2,000mg、最优选为约10mg～约1,000mg一次性或分开在饭前、饭后、饭中和/或睡前等施与。

本发明的剂或组合物可以向人和除人以外的动物、优选为哺乳类的对象施与。作为除人以外的动物的例子，可举出牛、马、猪、绵羊等家畜、和犬、猫等伴侣动物。施与或摄取量对于宠物等哺乳动物(除人以外)，作为乳铁蛋白，优选为0.2mg～300mg/kg体重/天。

通过本发明的剂或组合物，子宫内菌群是否被改善或正常化了可以通过使用在本发明的剂或组合物的施与或摄取前、施与或摄取中、或者施与或摄取后的2个以上时刻从被检者的子宫内采取到的检体，通过基于16S rRNA基因的扩增的菌群解析方法，测定子宫内菌群中的乳杆菌占有率，将采取时刻不同的多个检体的占有率进行比较而算出其差来判定。

作为检体，只要是从子宫内采取的试样，并且包含子宫内的细菌即可，采取方法也没有限定，使用例如使用移液管而采取到的子宫内腔液等。

关于采取检体的时刻的组合，没有特别限定，只要具有1天以上的间隔即可，可以为本发明的剂或组合物的施与或摄取前、施与或摄取中、或着施与或摄取后的任意时刻。2个以上时刻的检体优选包含本发明的剂或组合物的施与或摄取中、或者施与或摄取后的至少1个检体。例如，在采取2个时刻的检体的情况下，优选为本发明的剂或组合物的施与或摄取前、与施与或摄取中或施与或摄取中后；施与或摄取中的2次不同的时刻；施与或摄取中、与施与或摄取后；施与或摄取后的2次不同的时刻中的任一者。

在本发明的判定方法中使用的菌群解析方法一般包含以下工序：(1)提取从被检者采取到的检体中的基因组DNA，使来源于细菌的16S rRNA基因的DNA序列的一部分或全长扩增；(2)制作向DNA扩增产物施与了接头序列而得的库，利用新一代测序仪进行测序；(3)将所得的序列读段组合数据解析的软件，推定菌的来源和检体中的占有率。

作为基于16S rRNA基因的扩增的菌群解析方法，可举出例如16S扩增子测序法、鸟枪序列法、16S全长扩增子测序法等、或与它们同等的菌群解析法。作为16S rRNA基因的扩增对象区域，优选使用人检体的16S rRNA测序中一般使用的V1-V2、V3-V5、和/或V4的可变区域。特别是，优选使用以能够高灵敏度地检测存在于生殖器的菌的V4区域作为对象的引物集，以V4区域作为对象的扩增子测序法可以检测包含假单胞菌(Pseudomonas)、埃希氏菌(Escherichia)、沙门氏菌(Salmonella)、乳杆菌(Lactobacillus)、肠球菌(Enterococcus)、利斯特氏菌(Listeria)、芽孢杆菌(Bacillus)、加德纳菌(Gardnerella)和双歧杆菌(Bifidobacterium)和2种酵母的广范围的微生物，因此是最优选的。

关于本发明，子宫内菌群被正常化了的状态是指：在通过上述那样的基于16SrRNA基因的扩增的菌群解析方法，测定了从子宫内采取到的检体的情况下，乳杆菌占有率为50％以上的状态，该乳杆菌占有率优选为70％以上，更优选为90％以上。关于相同检体，在由各种方法得到的测定值的差超过一般误差的范围的情况下，以通过采用使用了新一代测序仪(例如商品名“MiSeq”(Illumina K.K.))的16S扩增子测序法的菌群解析法测得的值作为基准。

关于本发明，所谓子宫内菌群被改善了的状态，在通过如上述那样的菌群解析法测定了在2个时刻从子宫内采取到的检体的情况下，是指与先采取到的检体相比，后采取到的检体中的乳杆菌占有率增加了。

实施例

以下显示例子来更具体地说明本发明。

[实施例1]

本发明人等以接受了不孕治疗诊所诊断的45岁以下的体外受精实施患者作为对象而实施子宫内菌群解析，其结果，向子宫内细菌的平衡紊乱的患者(被检者)进行乳铁蛋白的经口施与，研究了其效果。

＜子宫内菌群解析＞

子宫内菌群解析基本上按照非专利文献6所记载的方法，如以下那样实施。擦掉被检者的宫颈管和宫颈部的粘液，将胚胎移植用导管(商品名“Kitazato(注册商标)IUIcatheter”(Kitazato Corporation,Japan))从阴道向子宫内小心插入，作为检体回收了子宫内腔液。回收的子宫内腔液转移到用于菌的失活和稳定化的保存液1mL(商品名“MMBcollection tube”(DNA Genotek Inc.,Canada))中。

为了提取菌基因组DNA，在保存液中加入蛋白酶K(Proteinase K)和溶菌酶(lysozyme)，使菌溶解。基因组DNA使用DNA提取试剂盒(商品名“Agencourt Genfind v2Blood&Serum DNA Isolation Kit”(Beckman Coulter Inc,USA))提取。提取的DNA的浓度使用商品名“Qubit dsDNA HS Assay Kit”(ThermoFisher Scientific K.K.)测定。

菌群解析通过使用了新一代测序仪的16S扩增子测序法来实施。基于“EarthMicrobiome Project”的规程(非专利文献12)，使用将16S rRNA基因的V4区域扩增的序列和将Illumina Nextera XT接头序列连接了的引物进行了菌DNA的扩增(非专利文献6)。制作出包含25ng/μL的DNA、各200μmol/L的脱氧核糖核苷酸三磷酸、400nmol/L的各引物、2.5U的商品名“FastStart HiFi polymerase”、20mg/mL BSA(Sigma)、0.5mol/L甜菜碱(Sigma)和MgCl

＜病例1＞

该被检者确认了通过乳杆菌40％、链球菌(Streptococcus)60％而构成的非乳杆菌控制性菌群(Non-Lactobacillus Dominant Microbiota)。对于该被检者，将青霉素系抗生素阿莫西林750mg/天施与7天。然后，将市售的乳铁蛋白制剂(商品名“乳铁蛋白GX”(NRLファーマ制))以乳铁蛋白量300mg/天的用量经口施与。在50天连续的乳铁蛋白施与后进行了第2次的子宫内菌群解析，结果乳杆菌增加到100％，确认了子宫内菌群的改善。

阿莫西林对厌氧性菌的效果弱，对于单独的阿莫西林，增加乳杆菌的效果低，反而乳杆菌也具有变为阿莫西林的靶的可能性。因此，可以认为通过施与乳铁蛋白，从而在子宫内乳杆菌增殖，子宫内菌群被改善了。

＜病例2＞

该被检者的子宫内菌群极度不平衡，初次的子宫内菌群解析的结果为乳杆菌0.1％、链球菌94.7％、其它5.2％。对于该被检者，将阿莫西林750mg/天施与14天。从施与阿莫西林开始后第5天(初次检查后第32天)，与病例1同样地将乳铁蛋白制剂以乳铁蛋白量300mg/天的用量连续经口施与。对于在阿莫西林施与结束后(初次检查后第57天/乳铁蛋白施与开始后第25天)进行的第2次子宫内菌群解析，链球菌减少到17％，乳杆菌增加到16.2％，但是显著确认到埃希氏菌(Escherichia)等其它菌的增加。由于未确认到单独阿莫西林的效果，因此将头孢系抗生素头孢地尼以300mg/天从乳铁蛋白施与开始后第53天(初次检查后第85天)施与7天并且并用了益生菌卫生棉条(商品名“Florgynal TamponProbiotique”(Laboratoires IPRAD,Paris,France))。这些处置结束后仅继续乳铁蛋白制剂的施与，其结果，对于从初次检查起第119天实施的第3次检查，乳杆菌改善到98.1％。乳铁蛋白制剂的施与以乳铁蛋白量300mg/天的用量连续142天。该被检者之后自然妊娠了。

因此，可知乳铁蛋白可以改善子宫内菌群的不平衡，可以显示出预防或改善起因于子宫内菌群紊乱的各问题的效果。此外，在该试验的实施中，没有与副作用有关的报导。因此，可以说该方法和所使用的乳铁蛋白制剂的安全性高。

[实施例2]乳铁蛋白片的制造

在从牛乳提取的乳铁蛋白原料粉末(作为蛋白质为纯度95％以上；蛋白质中的乳铁蛋白为90％以上)20kg中，加入乳糖18.5kg、结晶纤维素(商品名“アビセル”)19.7kg、羧基甲基纤维素·钙盐1.2kg、蔗糖脂肪酸酯0.6kg，将所得的混合物用混合机粉碎，制成通过100目的粉末。将该混合粉末通过压片机进行压片，制成长径9mm、重量300mg的片剂。在1片中含有乳铁蛋白原料粉末100mg。

[实施例3]肠溶性乳铁蛋白片的制造(其1)

在涂布机(フロイント産業(株)制，ハイコーターHCT-48N)中，加入在实施例1中制造的片剂。向该片剂喷洒由虫胶9.6质量％、L-精氨酸1.5质量％、山梨糖醇1.9质量％、蔗糖脂肪酸酯2.4质量％、乙醇4.8质量％、纯化水79.8％构成的肠溶性涂布液，实施以相对于片剂的比计为8～9质量％的肠溶性涂布而制成制品。

[实施例4]肠溶性乳铁蛋白片的制造(其2)

在涂布机(フロイント産業(株)制，ハイコーターHCT-48N)中，加入在实施例1中制造的片剂。向该片剂喷洒由羧基甲基纤维素9质量％、甘油脂肪酸酯1质量％、乙醇45质量％、二氯甲烷45质量％构成的肠溶性涂布液，实施以相对于片剂的比计为12质量％的肠溶性涂布而制成制品。

[实施例5]肠溶性乳铁蛋白片的制造(其3)

在涂布机(フロイント産業(株)制，ハイコーターHCT-48N)中，加入在实施例1中制造的片剂。向该片剂喷洒将作为由玉米谷粒获得的蛋白质的玉米醇溶蛋白8质量份、甘油2质量份溶解于70质量％乙醇水溶液150质量份而成的肠溶性涂布液，获得了实施以相对于片剂的比计为10质量％的涂布而成的片剂。

[实施例6]肠溶性乳铁蛋白片的制造(其4)

在涂布机(フロイント産業(株)制，ハイコーターHCT-48N)中，加入在实施例1中制造的片剂。向该片剂喷洒将紫胶(shellac)30质量份、蓖麻油7质量份溶解于异丙醇63质量份而成的肠溶性涂布液，获得了实施以相对于片剂的比计为10质量％的涂布而成的片剂。

该申请基于平成30年9月20日申请的日本专利申请、特愿2018-176473，特愿2018-176473的说明书和权利要求书所记载的内容全部包含于该申请说明书。