一种组合物用于制备基于调控抑癌相关基因治疗胃癌药物的用途

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种组合物用于制备基于调控抑癌相关基因治疗胃癌药物的用途，更具体的涉及基于调控CDK1、CDK6、P53和/或TGF-β抑癌基因治疗胃癌药物的用途。

背景技术

据报道，全球胃癌(gastric cancer，GC)的每年发病率居第4、5位，每年死亡率在所有肿瘤占第2位。近年对于胃癌的诊治虽然有很大进步，但其5年生存率依然很低，作为一种高度恶性的肿瘤，GC具有无限制性细胞增殖、侵袭、转移等特性，属于预后较差的肿瘤病症，关注并重视胃癌治疗及其研究意义重大。目前，诸如胃癌等肿瘤的药物治疗面临两大难题，即非特异性毒副反应和多药耐药性，使得寻找高效、低毒的化疗药物具有非常重要的意义。目前，从中药中提取有效的抗癌药物已成为肿瘤药物治疗研究的一大热点，并取得了较大的发展。

研究显示，GC的发生发展是一个复杂的过程，绝大多数胃癌发生过程遵循Correa级联反应提出的胃癌发生模式：即正常胃黏膜-浅表性胃炎-萎缩性胃炎-小肠型肠上皮化生-大肠型肠上皮化生-异型增生(中重度)-胃癌。胃癌的发生是一个多基因、多步骤、多阶段的发展过程，一般情况下，胃黏膜的上皮细胞增殖分化一般处于动态平衡的状态，这种平衡的维持主要作用于癌基因、抑癌基因和一些生长因子的调控。如这种平衡发生失衡，即癌基因发生激活，抑癌基因发生抑制，生长因子参与及DNA微卫星不稳定，使胃黏膜上皮细胞增殖过度而又不能启动凋亡信号，就可能发生癌变。可见，在胃癌的发病过程中，首先出现的即是癌细胞的无限制性增殖，而细胞凋亡的异常起着重要的作用，细胞存活或死亡依靠生存和凋亡信号之间的平衡，这个平衡的维持涉及多种分子和基因。

为了探究治疗胃癌药物的具体分子调控机制，研究人员对于细胞中细胞周期、增殖、凋亡、分化以及DNA损伤修复等生物学过程进行了靶向研究。研究表明，抑癌基因主要是通过抑制细胞增殖、促进分化、诱导细胞凋亡发挥抗癌作用。据文献报道，P53是一种转录抑制因子，当细胞DNA出现轻微损伤时，P53会启动许多下游基因，其中包括调控CDK基因，使细胞周期阻滞，起始DNA损伤修复。但在细胞DNA发生严重损伤情况下，P53将诱导凋亡因子表达，使细胞进入程序性死亡。另外，CDK1和CDK6作为CDK家族中重要组成，在细胞增殖过程中发挥重要作用。CDK1(细胞周期蛋白依赖性激酶1)是G2期-M期过度的重要调节因子，据报道，CDK1可与周期蛋白B协同作用促进细胞进入减数分裂时期，CDK1在CRC循环肿瘤细胞中表达上调，CDK1在促进G2-M期转变、调节G1进程以及G1期向S期转变中起到关键作用，研究表明CDK1表达水平上升与癌细胞增殖或癌症不良预后密切相关，而CDK1的高表达率预示着CRC患者预后效果较差。此外，文献报道CDK6在乳腺癌细胞中过度表达，其表达水平与细胞增殖具有紧密联系。因此，包括CDKs在内的与细胞周期调控相关的分子已成为研究热点，被认为是多种癌症中潜在的预后和治疗标志物。细胞中CDKs表达的改变往往会导致细胞异常增殖，以及相关基因或蛋白的功能障碍。通过上调CDK相关抑制因子，从而使CDK表达下调，进一步诱导细胞周期阻滞在G1期。此外，TGF-β信号的一些下游靶点是重要的细胞周期关键基因，包括CDKN1A(p21)、CDKN1B(p27)和CDKN2B(p15)，它们的激活会导致生长抑制。而且，在正常上皮细胞，TGF-β能调节几种促进细胞周期停滞的基因表达，在这些细胞，TGF-β能迅速诱导两个细胞周期调节蛋白激酶抑制因子p21Cip1和p15Ink4b，并且下调Myc、Id1和Id2(这三个转录因子涉及增殖和分化抑制)。上述5个基因被认为是TGF-β细胞生长抑制程序的一部分，目前研究至少在皮肤、肺脏和乳腺上皮细胞是这样。TGF-β在上皮细胞和造血细胞中是有力的抗增殖因子，而且TGF-β在某些细胞类型能作为凋亡诱导物起作用，几个基因反应已经牵涉在TGF-β诱导的凋亡作用中，如TIEG-1作为一转录因子能在多种细胞类型中诱导凋亡和抑制增殖。因此，基于P53、TGF-β、CDK1、CDK6等从抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡等方面调控抑癌功能的相关基因作为治疗胃癌药物直接或间接调控靶基因，进而开发新的治疗胃癌的药物，具有积极的意义。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种组合物用于制备基于调控CDK1、CDK6、P53和/或TGF-β抑癌基因治疗胃癌药物的用途，进而开发更多潜在治疗胃癌的新的药物制剂。

本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种可调控CDK1、CDK6、P53和/或TGF-β抑癌基因以治疗胃癌的药物制剂。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种组合物用于制备基于调控抑癌相关基因治疗胃癌药物的用途，所述组合物包括芹菜素、白术内酯Ⅲ、大黄酚、鞣花酸、槲皮素、柠檬苦素、香蒲新苷、茯苓酸、γ-松油烯、β-榄香烯或柚皮素中的至少一种。

更优的，所述组合物包括摩尔比为4：10：1：6：8的芹菜素、白术内酯Ⅲ、大黄酚、鞣花酸和槲皮素。

更优的，所述组合物包括摩尔比为50：1：50：100：625：1000的柠檬苦素、香蒲新苷、茯苓酸、γ-松油烯、β-榄香烯和柚皮素。

更优的，所述组合物包括摩尔比为4：10：1：6的芹菜素、白术内酯Ⅲ、大黄酚和鞣花酸。

更优的，所述组合物包括摩尔比为40：50：1：50的槲皮素、柠檬苦素、香蒲新苷和茯苓酸。

具体的，所述抑癌基因包括CDKs、P53和/或TGF-β基因；

更具体的，所述CDKs基因为抑制胃癌细胞增殖相关基因，所述P53和TGF-β基因为促进胃癌细胞凋亡相关基因。

具体的，所述CDKs基因包括CDK1和CDK6。

本发明还公开了一种基于调控CDKs、P53和/或TGF-β抑癌基因治疗胃癌药物，所述药物的有效成分包括芹菜素、白术内酯Ⅲ、大黄酚、鞣花酸、槲皮素、柠檬苦素、香蒲新苷、茯苓酸、γ-松油烯、β-榄香烯或柚皮素中的至少一种。

本发明还公开了一种治疗胃癌的药物，所述药物的有效成分包括芹菜素、白术内酯Ⅲ、大黄酚、鞣花酸、槲皮素、柠檬苦素、香蒲新苷、茯苓酸、γ-松油烯、β-榄香烯或柚皮素中的至少一种。

本发明还公开了一种摩罗丹用于制备基于调控CDKs、P53和/或TGF-β抑癌基因以治疗胃癌的药物制剂的用途。

本发明基于中成药摩罗丹的指纹图谱分析，初步确定了摩罗丹中若干药物组分及其可能调控的靶标基因；通过转录组分析数据中表达量发生显著变化的基因中，挑选出CDK1、CDK6、P53和/或TGF-β等抑癌相关的基因作为摩罗丹直接或间接调控靶基因，随后进一步通过摩罗丹细胞学实验探究进行高通量转录本分析(RNAseq)，进一步明确了摩罗丹中有效物质的作用靶点，最后通过荧光定量(qRT-PCR)的方法验证了摩罗丹中具有抑胃癌功能的有效物质，筛选出包括芹菜素、白术内酯Ⅲ、大黄酚、鞣花酸、槲皮素、柠檬苦素、香蒲新苷、茯苓酸、γ-松油烯、β-榄香烯或柚皮素在内的有效成分，进一步于胃上皮细胞体系中进行细胞学实验，从成分层面明晰了摩罗丹抑胃癌的有效成分，体外验证实验表明，这组物质能够抑制胃癌细胞的CDK1、CDK6等可抑制胃癌细胞增殖的相关基因指标，也可以调控P53和TGF-β等促进细胞凋亡相关基因的指标，均对胃癌的治疗具有一定的作用，为开发新的治疗胃癌药物提供理论支持。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为摩罗丹有效成分对抑癌靶基因CDK1的定量检测结果；

图2为摩罗丹有效成分对抑癌靶基因CDK6的定量检测结果；

图3为摩罗丹有效成分对抑癌靶基因P53的定量检测结果；

图4为摩罗丹有效成分对抑癌靶基因TGF-β的定量检测结果

图5为A组-D组中不同有效物质组合下作用细胞后的形态图片；其中，-0：药物作用之前；-24：药物作用24h之后；

图6为A组-D组中不同有效物质组合下对细胞凋亡的影响；

图7为单一的有效成分作用细胞后的形态图片；

图8为单一的有效成分对细胞凋亡的影响。

具体实施方式

实施例1

摩罗丹是由百合、茯苓、玄参、乌药、泽泻、麦冬、当归、白术、茵陈、白芍、石斛、九节菖蒲、川芎、三七、地榆、延胡索、蒲黄、鸡内金等18味药材组成的纯中药制剂，具有和胃健脾、通络定痛、健脾消胀的作用，可以显著减低CAG患者EGF和EGFR的表达，临床实际使用效果颇佳。摩罗丹被中华医学会消化病学分会制定的《中国慢性胃炎共识意见》(2017)、中华中医药学会发布的《慢性胃炎中医专家诊疗共识意见》(2017)等推选为治疗慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎的首选推荐用药。

针对探究摩罗丹中有效抑胃癌成分的问题，本发明通过文献研究和摩罗丹指纹图谱分析，初步确定了摩罗丹中若干药物组分及其可能调控的靶标基因；随后进一步通过摩罗丹细胞学实验探究进行高通量转录本分析(RNAseq)，进一步明确了摩罗丹中有效物质的作用靶点，最后通过荧光定量(qRT-PCR)的方法验证了摩罗丹中具有抑胃癌功能的有效物质。

为探究摩罗丹抑癌的具体分子调控机制，本实施例对经摩罗丹处理的胃上皮细胞进行转录组分析。分析结果显示，摩罗丹主要影响了细胞中细胞周期、增殖、凋亡、分化以及DNA损伤修复等生物学过程。本发明进一步从转录组分析数据中表达量发生显著变化的基因中，挑选出CDK1、CDK6、P53、TGF-β等分别从抑制胃癌细胞增殖及促进细胞凋亡等方面抑癌的相关基因作为摩罗丹直接或间接调控靶基因，初步筛选出摩罗丹中候选有效成分，通过细胞学以及分子学实验验证，鉴别出摩罗丹中能有效抑癌的药物成分。

摩罗丹摩罗丹指纹图谱建立及所含天然药物组分鉴定

通过使用代谢组学分析的方法，本发明前期对摩罗丹中所含有效天然药物组分进行了鉴定，通过数据库比对成功识别出220种化合物组分，这与文献挖掘结果较一致，部分化合物组分如下表1所示。

表1 摩罗丹化合物组分(部分)

摩罗丹中药物组分调控生物功能富集分析

将摩罗丹施加于胃上皮细胞培养基中，处理细胞24h后收集并进行转录组分析。通过富集分析，甄别出摩罗丹主要影响的生物学功能以及调控的靶基因功能。通过对文献中已报道的相关调控因子的分析，进一步对摩罗丹指纹图谱中药物组分进行识别，进一步精确摩罗丹中调控抑癌的有效组分。

结合文献中关于药物天然化合物的药效报道，以及综合考虑药品购买、施加等问题。本实施例从摩罗丹指纹图谱库筛选出11种化合物，进行细胞学实验(见下表2)。各种化合物细胞学实验施加浓度参考文献报道或进行IC50测定确立。

表2 摩罗丹抑癌潜在有效组分

荧光定量验证摩罗丹中抑癌的有效物质

通过对转录组分析结果分析，筛选出摩罗丹中抑癌相关的靶基因。通过设计对应各靶基因的特异性引物，对各摩罗丹中预测有效组分处理后的细胞转录本进行定量检测。在本实施例方案中，将摩罗丹中预测的各种有效组分，通过细胞凋亡检测实验以及文献挖掘，得各预测组分合适处理浓度。

将上述预测的各有效组分分别溶于DMSO中后，施加于培养于6孔板上的SGC-7901细胞培养基中，以DMSO处理细胞作为阴性对照组。SGC-7901细胞在药物处理24小时后收集，并进行RNA提取。

提取RNA的步骤如下：

(1)倒掉细胞培养液，用PBS洗一遍，6孔板每孔加入1ml Trizol，轻柔摇晃至液体覆盖整个表面，室温静置，每2分钟摇晃一次，然后移入1.5ml无RNA酶EP管中；

(2)RNA分离，加200ul氯仿(总体积1/5)，用手剧烈震荡，室温静置；

(3)于4℃、12000rpm，离心10-15min(平衡放入，提前打开离心机预冷)，离心后体系分层，上层：RNA(无色)，中层：蛋白质，下层：酚-氯仿相；

(4)取上层液相至1.5ml无RNA酶EP管中(冰上预冷)，加入500ul异丙醇，轻柔摇晃混匀，室温静置，4℃、12000rpm，离心10-15min，得到RNA粗提沉淀；

(5)弃上清，加入1ml75％乙醇，用手剧烈震荡悬浮沉淀，2-8℃、7500rpm，离心5-10min，用移液器或者真空泵抽走上清；

(6)将EP管倒置空气中5-10分钟(或者用枪头吸走全部上清)，干燥RNA沉淀，(不能在真空中离心干燥)，注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度；

(7)用无RNase水重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，室温静置，测浓度后-20℃保存。

测量RNA浓度的步骤如下：每个样本取1ul，利用微量紫外分光光度计测量每个RNA样品的浓度，根据浓度，计算出需要反转录的RNA总量。利用全式金反转录试剂盒，进行反转录。

cDNA的合成：根据上一步得出的各组浓度计算反转录体系的所需的体积，我们一般定量20uL的反转录体系中含有5mg总RNA。配置好反转录体系后，将反转录管放入金属浴中进行反转录，设置程序为42℃，15min，85℃，5s，运行完成后在4℃保存。

Real Time PCR检测mRNA的表达：将反转录好的cDNA取出置于冰上，同时配置20μL实时定量PCR体系：2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10μL，Forward Primer0.8μL，Reverse Primer 0.8μL，模版cDNA 2μL，RNase-free water 6.4μL。各基因序列如下表3所示。配置好反应体系后上机CFX96进行mRNA表达检测，反应程序为95℃，15s；60℃，30s；72℃，30s共进行40个这样的循环。运行完毕后分析Ct值并查看熔解曲线。qRT-PCR定量检测靶基因源于RNAseq分析结果，这些基因分别参与细胞增殖、细胞凋亡以及分化、免疫反应，炎症反应等生物学过程。

表3 qRT-PCR的引物序列

实施例2摩罗丹抑癌功能的物质鉴定。

本实施例中，从转录组分析数据中表达量发生显著变化的基因中，将P53、TGF-β、CDK1、CDK6等基因转录本的变化作为调控抑癌的标志基因。

采用SGC-7901细胞株(由本室冻存保藏，购买于ATCC细胞库)作为药品处理对象，该细胞具有繁殖迅速，易于培养等特点。将培养的SGC-7901细胞接种于6孔板上(每孔培养50w个细胞)，使用DMEM(10％FBS)培养基培养至全部贴壁。将上述筛选的摩罗丹候选有效组分使用DMSO溶解后，分别施加于SGC-7901细胞培养液中，孵育24h后收集处理后的细胞。按照前述实施例1中处理步骤提取RNA后进行反转录，使用待检测基因特异性引物进行qRT-PCR检测。

上述筛选的摩罗丹潜在有效组分分别针对于CDK1、CDK6、P53和TGF-β相关抑癌靶基因的定量检测结果分别见图1-4所示。

实验结果表明，摩罗丹中含有多种物质对抑癌功能相关的信号分子具有调控作用。例如芹菜素、白术内酯Ⅲ、大黄酚、鞣花酸、槲皮素、柠檬苦素、香蒲新苷、茯苓酸、γ-松油烯、β-榄香烯、柚皮素可显著抑制CDK1和CDK6的表达(如图1中A和图1中B)，同时，这些成分又可显著提高P53的表达(如图1中C)；β-榄香烯、柚皮素可以显著抑制CDK1和CDK6的表达，同时又可显著提高P53和TGF-β(如图1中D)的转录水平。可见，摩罗丹中所含有成分可以分别从抑制胃癌细胞增殖(CDK1和CDK6)及调控促进细胞凋亡(P53和TGF-β)等方面发挥抑癌作用，并为新的潜在治疗胃癌的药物开发提供理论基础。

实施例3

本实施例中，分别选择芹菜素、白术内酯Ⅲ、大黄酚、鞣花酸、槲皮素、柠檬苦素、香蒲新苷、茯苓酸、γ-松油烯、β-榄香烯及柚皮素这11种物质，按照不同的摩尔比例的组合，验证不同组合方式下促进细胞凋亡的优势。

采用SGC-7901细胞株(由本室冻存保藏，购买于ATCC细胞库)作为药品处理对象，该细胞具有繁殖迅速，易于培养等特点。

将培养的SGC-7901细胞接种于6孔板上(每孔培养50w个细胞)，使用DMEM(10％FBS)培养基培养至全部贴壁，将上述筛选的11种有效组分使用DMSO溶解后，按照以下四种组合方式(摩尔浓度比)进行混合：

A组：芹菜素：白术内酯Ⅲ：大黄酚：鞣花酸：槲皮素＝4：10：1：6：8；

B组：柠檬苦素：香蒲新苷：茯苓酸：γ-松油烯：β-榄香烯：柚皮素＝50：1：50：100：625：1000；

C组：芹菜素：白术内酯Ⅲ：大黄酚：鞣花酸＝4：10：1：6；

D组：槲皮素：柠檬苦素：香蒲新苷：茯苓酸＝40：50：1：50。

分别将上述四组混合物按照下表4所示剂量施加于SGC-7901细胞培养液中，具体的添加量如下表格，孵育24h后，首先在倒置显微镜下拍照，观察药物作用后的结果，实验结果如图5所示，按照四种组合方式处理细胞24h之后，明显促进了细胞的凋亡。拍照之后，收集细胞，利用MUSE细胞质控分析仪，测定了细胞凋亡的情况，从实验结果可以看出，加药处理之后，细胞存活率明显下降，细胞凋亡率明显升高，实验结果如图6所示，实验结果量化之后如表5所示。

表4 各组混合物加入剂量

表5 细胞凋亡率

可见，本发明筛选的有效物质之间存在协同增效的作用，可以更进一步提高促进胃癌细胞凋亡的作用。

实施例4

本实施例中，分别选择芹菜素、白术内酯Ⅲ、大黄酚、鞣花酸、槲皮素、柠檬苦素、香蒲新苷、茯苓酸、γ-松油烯、β-榄香烯及柚皮素这11种物质，以一定的摩尔浓度作用SGC-7901细胞，验证不同物质对胃癌相关抑癌细胞调控的情况。

采用SGC-7901细胞株(由本室冻存保藏，购买于ATCC细胞库)作为药品处理对象，该细胞具有繁殖迅速，易于培养等特点。

将培养的SGC-7901细胞接种于6孔板上(每孔培养50w个细胞)，使用DMEM(10％FBS)培养基培养至全部贴壁，分别将上述筛选的11种有效组分使用DMSO溶解后，分别以一定的摩尔浓度添加到SGC-7901培养基中，孵育24h后，首先在倒置显微镜下拍照，观察药物作用后的结果。

实验结果如图7所示，加入化合物处理细胞24h之后，促进细胞的凋亡。拍照之后，收集细胞，利用MUSE细胞质控分析仪，测定了细胞凋亡的情况，从实验结果可以看出，加药处理之后，细胞存活率有所下降，细胞凋亡率有所升高，实验结果如图8所示，实验结果量化之后如表6所示。

表6 细胞凋亡率

可见，本发明筛选的有效物质均具有较好的促进胃癌细胞凋亡的功效，而经选定配比下的组合物则具有更优的促进效果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。