作为免疫调节剂的TGR5信号传导的调节剂

本申请要求于2018年9月25日提交的并且题为“Regulator of TGR5 Signalingas Immunomodulatory Agent”的PCT申请No.PCT/CN2018/107358的优先权，其公开内容在此通过引用并入。

技术领域

本公开内容提供了增强免疫的方法，其包括向有此需要的对象施用TGR5激动剂，例如胆汁酸(BA)。本文还提供了抑制免疫的方法，其包括向有此需要的对象施用TGR5拮抗剂。本公开内容还提供了鉴定免疫调节剂的方法，其包括使TGR5与候选试剂相互作用。

背景技术

胆汁酸(BA)是主要见于哺乳动物和另一些脊椎动物的胆汁中的类固醇酸。初级胆汁酸是由肝合成的那些，而次级胆汁酸由结肠中的细菌作用产生。缀合胆汁酸是与牛磺酸或甘氨酸缀合的那些，而游离胆汁酸对应于未缀合的胆汁酸。

小肠中胆汁酸/盐的浓度足够高以形成胶束并溶解脂质。含胆汁酸的胶束帮助脂肪酶消化脂质并将其带到肠刷状缘膜附近，这导致脂肪吸收。

胆汁酸具有其他功能，包括从身体中消除胆固醇，驱动胆汁的流动以消除某些分解代谢物(包括胆红素)，乳化脂溶性维生素以使其能够吸收，以及帮助运动并减少见于小肠和胆道中的细菌菌群。

Y.Calmus和同事发现，鹅脱氧胆酸和熊脱氧胆酸抑制白介素-1、白介素-6和肿瘤坏死因子-α的产生，并在体外对单核细胞活性发挥或多或少的强免疫抑制作用，这被认为是由TGR5活化介导的(Calmus Y,Guechot J,Podevin P,Bonnefis MT,Giboudeau J,Poupon R.Differential effects of chenodeoxycholic and ursodeoxycholic acidson interleukin1,interleukin 6and tumor necrosis factor-alpha production bymonocytes.Hepatology 1992；16:719–23.[15])。

TGR5的抗炎作用是通过抑制促炎转录核因子κB(NF-κB)来介导的(Pols TWH,Nomura M,Harach T,et al.TGR5 activation inhibits atherosclerosis by reducingmacrophage inflammation and lipid loading.Cell Metabolism 2011；14:747–57；WangY-D,Chen W-D,Yu D,Forman BM,Huang W.The G-protein-coupled bile acid receptor,Gpbar1(TGR5),negatively regulates hepatic inflammatory response throughantagonizing NF-κB in mice.Hepatology2011；54:1421–32)。在来自TGR5基因敲除小鼠的巨噬细胞中，被NF-κB靶向的多种促炎基因(诱导型NOS、干扰素诱导蛋白和IL-1α)的mRNA水平高于来自野生型小鼠的巨噬细胞中的那些。同样，在巨噬细胞系RAW264.7中，TGR5的活化抑制NF-κB的活化。当TGR5被活化或过表达时，LPS处理之后NF-κB的转录活性被抑制。

然而，本发明人出人意料地发现胆汁酸增强固有免疫应答，然后发现了与现有技术知识不同的TGR5-GRK-β-抑制蛋白-SRC信号传导(TGR5-GRK-β-arrestin-SRCsignaling)的新的免疫调节作用，并因此完成了本发明。

发明内容

本发明基于本发明人的出乎意料的发现，即胆汁酸增强固有免疫应答。

病毒感染引起胆汁酸例如鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)、石胆酸(lithocholic acid，LAC)或脱氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)的细胞内积聚。

胆汁酸例如CDCA、LAC和DCA充当TGR5的激动剂，其活化下游信号传导组分GRK、β-抑制蛋白和SRC。

胆汁酸和一般地TGR5-GRK-β-抑制蛋白-SRC的激动剂诱导免疫应答，从而能够清除病毒。

在第一方面，本公开内容提供了在有此需要的对象中增强免疫的方法，其包括

向所述对象施用TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src激动剂。

在一个实施方案中，所述免疫是针对微生物感染例如细菌感染、病毒感染、真菌感染的免疫。

在一个特定的实施方案中，病毒感染由以下引起：DNA病毒或RNA病毒例如ssDNA病毒、dsDNA病毒、ssRNA病毒或dsRNA病毒，例如选自单纯疱疹病毒(HSV)包括HSV-1和HSV-2、人巨细胞病毒(HCMV)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、寨卡病毒(Zika Virus)、EV71、流感病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒以及人乳头状瘤病毒(HPV)的病毒。

在另一个实施方案中，微生物感染引起疾病，所述疾病例如选自结核病、念珠菌病、曲霉病、藻类病(alginosis)、诺卡菌和隐球菌病。

在另一个实施方案中，免疫是针对肿瘤例如实体瘤或白血病的免疫。

在另一个实施方案中，TGR5-β-抑制蛋白-Src激动剂是TGR5激动剂、GRK激动剂、β-抑制蛋白激动剂和/或Src激动剂，

其中GRK激动剂是例如GRK1、GRK2、GRK3、GRK4、GRK5和/或GRK6的激动剂，特别是GRK2、GKR4和/或GRK6的激动剂，更特别是GRK6的激动剂，并且

其中β-抑制蛋白激动剂是例如β-抑制蛋白-1和/或β-抑制蛋白-2的激动剂。

在另一个实施方案中，TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src激动剂是胆汁酸源，特别是胆汁酸，例如初级胆汁酸或次级胆汁酸、非缀合胆汁酸或缀合胆汁酸。

在另一个实施方案中，胆汁酸选自胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDA)、脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、酮石胆酸(ketolithocholic acid)、磺基石胆酸(sulpholithocholic acid)、熊脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛磺石胆酸及其任意组合。

在第二方面，本公开内容提供了在有此需要的对象中抑制免疫的方法，其包括

向所述对象施用TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src拮抗剂。

在一个实施方案中，免疫与自身免疫病相关。

在另一个实施方案中，TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src拮抗剂是TGR5拮抗剂、β-抑制蛋白-1/2拮抗剂和/或Src拮抗剂。

在第三方面，本公开内容提供了在有此需要的对象中治疗可通过调节免疫来治疗的疾病的方法，其包括向所述对象施用TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src调节剂。

在一个实施方案中，所述疾病选自微生物感染包括病毒感染、细菌感染和真菌感染，肿瘤包括实体瘤和白血病，并且所述TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src调节剂是TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src激动剂，例如TGR5激动剂、β-抑制蛋白-1/2激动剂和/或Src激动剂。

在另一个实施方案中，所述疾病是自身免疫病，并且所述TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src调节剂是TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src拮抗剂，例如TGR5拮抗剂、β-抑制蛋白-1/2拮抗剂和/或Src拮抗剂。

在第四方面，本公开内容提供了对有此需要的对象进行疫苗接种的方法，其包括向所述对象单独施用或施用在疫苗组合物中的TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src激动剂例如TGR5激动剂、β-抑制蛋白-1/2激动剂和/或Src激动剂作为佐剂。

相应地，本公开内容提供了疫苗接种佐剂组合物，其包含TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src激动剂，例如TGR5激动剂、β-抑制蛋白-1/2激动剂和/或Src激动剂。并且本公开内容还提供了疫苗组合物，其包含TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src激动剂例如TGR5激动剂、β-抑制蛋白-1/2激动剂和/或Src激动剂作为佐剂。

在第五方面，本公开内容提供了鉴定免疫调节剂的方法，其包括

使候选试剂与TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src途径的报道子接触，以及

确定TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src途径的活性，

其中TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src途径的活性改变指示所述候选试剂是免疫调节剂。

在一个实施方案中，TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src途径的活性增强指示所述候选试剂是免疫增强剂，并且TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src途径的活性降低指示所述候选试剂是免疫抑制剂。

附图说明

图1.病毒感染通过NF-κB依赖性方式诱导参与BA的生物合成和吸收的数种蛋白质的表达。

A.病毒感染诱导参与BA代谢的基因表达的热图。将THP1细胞用HSV-1或SeV感染指定时间，然后进行指定基因的表达的qPCR分析，然后通过热图对数据进行分析。

B.不同抑制剂对病毒诱导的参与BA代谢的数种基因表达的作用。将THP1细胞用DMSO或指定抑制剂进行处理，然后用HSV-1或SeV感染4小时，然后进行指定基因的表达的qPCR分析。

C.IRF3或p65敲除对SeV诱导的参与BA代谢的蛋白质表达的作用。将用对照、IRF3或p65的gRNA稳定转导的THP1细胞用SeV感染指定时间，然后进行指定基因的qPCR分析。

D.IRF3或p65敲除对HSV-1诱导的参与BA代谢的蛋白质表达的作用。与C类似地进行实验，不同之处在于使用HSV-1代替SeV。

E.p65与指定基因的启动子结合的CHIP分析。将THP1细胞用SeV或HSV-1感染指定时间，然后进行CHIP测定，然后用指定引物进行p65结合的DNA片段的丰度的qPCR分析。

F.VISA敲除对病毒感染诱导的参与BA代谢的蛋白质表达的作用。将用对照和VISA的gRNA稳定转导的THP1细胞用SeV感染指定时间，然后进行指定基因的qPCR分析。

G.MITA敲除对病毒感染诱导的参与BA代谢的蛋白质表达的作用。将用对照和MITA的gRNA稳定转导的THP1细胞用HSV-1感染指定时间，然后进行指定基因的qPCR分析。

H.VISA敲除对病毒感染诱导的IKKα/β、p65和IRF3磷酸化的作用。将用对照和VISA的gRNA稳定转导的THP1细胞用SeV感染指定时间，并且裂解细胞以用指定抗体进行免疫印迹分析。

I.MITA敲除对病毒感染诱导的IKKα/β、p65和IRF3磷酸化的作用。将用对照和MITA的gRNA稳定转导的THP1细胞用HSV-1感染指定时间，并且裂解细胞以用指定抗体进行免疫印迹分析。

J.病毒感染诱导的参与BA代谢的蛋白质的表达。将THP1细胞用HSV-1或SeV感染指定时间，然后进行指定基因的表达的qPCR分析。

K.UV处理对病毒诱导的参与BA代谢的基因表达的作用。将THP-1细胞用野生型或经UV处理的HSV-1和SeV感染指定时间，然后进行指定基因的表达的qPCR分析。

L.UV处理对病毒诱导的IRF3、IKKα/β和p65磷酸化的作用。将THP-1细胞用野生型或经UV处理的HSV-1和SeV感染指定时间，然后用指定抗体进行免疫印迹分析。

图2.病毒感染通过生物合成和吸收二者诱导细胞内胆汁酸的积聚。

A.在完全和空白培养基中培养的THP-1细胞中细胞内BA的测量。将THP-1细胞在更新的完全培养基(CM)或空白培养基(BM)中培养，然后用SeV或HSV-1感染指定时间，然后收获细胞以用于测量BA。

B.在完全和空白培养基中培养的肝细胞中细胞内BA的测量。与(A)类似地进行实验，不同之处在于使用肝WRL68细胞。

C.通过MS对在完全培养基(CM)或空白培养基中培养的原代小鼠肝细胞中的细胞内BA的分析。将原代小鼠肝细胞在完全或空白培养基(BM)中培养24小时，然后用SeV或HSV-1感染指定时间，然后收获细胞以用于通过MS进行细胞内BA的分析。

D.敲低OATP、CYP7A1、CYP7B1或HSD3B7对病毒诱导的细胞内BA积聚的作用。将用对照，OATP、CYP7A1、CYP7B1或HSD3B7的shRNA稳定转导的THP1细胞用HSV-1或SeV感染6小时，然后收获细胞以用于测量TBA。

E.在完全和空白培养基中培养的HEK293细胞中细胞内BA的测量。将HEK293细胞在更新的完全培养基(CM)或空白培养基(BM)中培养，然后用SeV感染指定时间，然后收获细胞以用于测量BA。

图3.

病毒触发的细胞内BA积聚促进了I型IFN产生和抗病毒固有免疫应答。

A.单独敲低OATP、CYP7A1、CYP7B1、CYP27A1和HSD3B7对病毒触发的IFNB1和CXCL10表达的作用。将用对照或者OATP、CYP7A1、CYP7B1、CYP27A1或HSD3B7的shRNA稳定转导的THP1细胞用HSV-1或SeV 8感染小时，然后进行指定基因的表达的qPCR分析。

B.单独敲低OATP、CYP7A1、CYP7B1、CYP27A1和HSD3B7对IFN-γ诱导的IRF1表达的作用。如A进行实验，不同之处在于在指定基因的表达的qPCR分析之前用IFN-γ处理8小时。

C.单独敲低OATP、CYP7A1和CYP7B1对病毒触发的IRF3磷酸化的作用。将用对照或者OATP、CYP7A1或CYP7B1的shRNA稳定转导的THP1细胞用HSV-1或SeV感染4小时，然后用指定抗体进行免疫印迹分析。

D.BA对I型IFN和另一些抗病毒基因的诱导。将Raw264.7细胞通过指定浓度的指定BA进行处理，然后进行指定基因表达的qPCR分析。

E.BA对TBK1和IRF3磷酸化的诱导。将Raw264.7细胞通过指定浓度的CDCA和LCA进行处理，然后用指定抗体进行免疫印迹分析。

F.BA对病毒诱导的I型IFN和另一些抗病毒基因的表达的作用。将Raw264.7细胞用HSV-1或SeV感染半小时，然后用LCA或CDCA(100μM)进行处理，然后用指定抗体进行免疫印迹分析。

G.BA对病毒诱导的IRF3磷酸化的作用。将Raw264.7细胞用HSV-1或SeV感染半小时，然后用CDCA(100μM)进行处理，然后用指定抗体进行免疫印迹分析。

H.BA对病毒复制的作用。将RAW264.7细胞用VSV-GFP感染1小时，然后更换为含有DMSO或指定浓度的CDCA的培养基，然后将细胞培养另外的24小时，然后进行荧光显微镜实验和流式细胞术分析。

I.肝中BA生物合成途径的示意图。

J.在报道子测定中，单独敲低参与BA生物合成途径的许多酶对病毒诱导的以及经转染RNA和DNA诱导的IFN-β活化的作用。将HEK293细胞用指定质粒转染36小时，然后进行病毒感染10小时或者转染RNA或DNA 18小时，然后裂解细胞以用于萤光素酶测定。

K.在报道子测定中，单独敲低参与BA生物合成途径的许多酶对IFN-γ诱导的IRF1活化的作用。将HEK293细胞用指定质粒转染36小时，然后IFN-γ刺激10小时，然后裂解细胞以用于萤光素酶测定。

L.BA对I型IFN和另一些抗病毒基因的诱导。将Raw264.7细胞用LCA(200μM)或CDCA(200μM)处理指定时间，然后进行指定基因的表达的qPCR分析。

M.BA对病毒复制的作用。将RAW264.7细胞用VSV-GFP感染1小时，然后更换含有DMSO或指定浓度的CDCA的培养基，然后将细胞培养另外的24小时，然后进行流式细胞术分析。

图4.

TGR5-GRK-β-抑制蛋白-SRC途径响应于病毒感染而被活化。

A.在报道子测定中，敲低TGR5或FXR对病毒诱导的IFN-β活化和IFN-γ诱导的IRF1活化的作用。将HEK293细胞用指定质粒以及报道质粒转染36小时，然后用SeV感染或用IFN-γ处理12小时，然后裂解细胞以用于萤光素酶测定。左图示出了指定质粒的敲低效率。

B.Tgr5缺陷对病毒诱导的Ifnb1和Cxcl10表达的作用。将Tgr5

C.Tgr5缺陷对病毒诱导的TBK1和IRF3磷酸化的作用。将Tgr5

D.CDCA和INT-777对Tgr5

E.ARRB1/2缺陷对病毒诱导的IFNB1和CXCL10表达的作用。将用对照或者ARRB1/2的gRNA稳定转导的THP1细胞用SeV或HSV-1感染8小时，然后进行指定基因的表达的qPCR分析。

F.敲低GRK对病毒触发的IFN-β活化的作用。将HEK293细胞用指定质粒转染，然后用SeV感染12小时，然后裂解细胞以用于萤光素酶测定。

G.INT-777和BA处理对SRC的pY416的诱导。将HEK293细胞用DMSO、INT-777或指定BA处理1小时，然后用指定抗体进行免疫印迹分析。

H.TGR5缺陷对Y416处病毒诱导的p-SRC的作用。将Tgr5

I.通过病毒感染诱导的β-抑制蛋白1/2、GRK6和SRC与TGR5的缔合。将HEK293细胞用SeV感染指定时间，然后裂解细胞以用预免疫的血清或TGR5抗体进行免疫共沉淀，然后用指定抗体对免疫沉淀物和裂解物进行免疫印迹分析。

J.SRC缺陷对病毒诱导的IFNB1和CXCL10表达的作用。将用对照或者SRC的gRNA稳定转导的MLF用qSeV或HSV-1感染8小时，然后进行指定基因的表达的qPCR分析。

K.SRC缺陷对病毒诱导的TBK1和IRF3磷酸化的作用。将用对照或者SRC的gRNA稳定转导的MLF用SeV感染指定时间，然后用指定抗体进行免疫印迹分析。

L.Tgr5缺陷对经转染核苷酸和cGAMP诱导的Ifnb1和Cxcl10表达的作用。将Tgr5

M.INT-777对I型IFN和另一些抗病毒基因的诱导。将Raw264.7细胞用指定浓度的INT-777进行处理，然后进行指定基因的表达的qPCR分析。

N.G蛋白或β-抑制蛋白缺陷对病毒触发的IFN-β活化的作用。将HEK293细胞用指定质粒以及报道质粒转染36小时，然后进行SeV感染10小时，然后裂解细胞以用于萤光素酶测定。左图示出了指定质粒的敲低效率。

O.对GRK-shRNA的敲低效率的检查。将HEK293细胞用指定质粒转染48小时，然后进行指定基因的表达的qPCR分析。

P.G蛋白、β-抑制蛋白或GRK缺陷对IFN-γ诱导的IRF1活化的作用。将HEK293细胞用指定质粒以及报道质粒转染36小时，然后进行IFN-γ处理10小时，然后裂解细胞以用于萤光素酶测定。

Q.β-抑制蛋白或GRK缺陷对病毒诱导的TBK1和IRF3磷酸化的作用。将HEK293细胞用指定质粒转染36小时，然后进行SeV感染指定时间，然后用指定抗体进行免疫印迹分析。

R.β-抑制蛋白1/2缺陷对病毒诱导的SRC的pY416的作用。将HEK293细胞用指定质粒转染36小时，然后进行SeV感染指定时间，然后用指定抗体进行免疫印迹分析。

S.SRC缺陷对病毒触发的IFN-β活化的作用。将HEK293细胞用指定质粒以及报道质粒转染36小时，然后进行SeV感染10小时，然后裂解细胞以用于萤光素酶测定。左图示出了指定质粒的敲低效率。

T.SRC缺陷对IFN-γ诱导的IRF1活化的作用。将HEK293细胞用指定质粒以及报道质粒转染36小时，然后进行IFN-γ处理10小时，然后裂解细胞以用于萤光素酶测定。

图5.

SRC介导抗病毒信号传导的多种组分的全局酪氨酸磷酸化

A.SRC与过表达系统中抗病毒信号传导中的多种蛋白质的相互作用。将HEK293细胞用指定质粒转染24小时，然后裂解细胞以用于用IgG或HA抗体进行免疫共沉淀，然后用指定抗体对免疫沉淀物和裂解物进行免疫印迹分析。

B.SRC与由病毒感染诱导的抗病毒信号传导中的多种蛋白质的内源性缔合。将MLF用SeV或HSV-1感染指定时间，然后裂解细胞以用于用IgG或SRC抗体进行免疫共沉淀，然后用指定抗体对免疫沉淀物和裂解物进行免疫印迹分析。

C.SRC对抗病毒信号传导中多种蛋白质的酪氨酸磷酸化的作用。将HEK293细胞用指定质粒转染24小时，然后裂解细胞以用于用HA抗体进行免疫沉淀，然后用指定抗体对免疫沉淀物和裂解物进行免疫印迹分析。

D.SRC缺陷对病毒诱导的抗病毒信号传导中多种蛋白质的酪氨酸磷酸化的作用。将用对照或者SRC的gRNA稳定转导的MLF用SeV或HSV-1感染指定时间，然后裂解细胞以用于用指定抗体进行免疫沉淀，然后用指定抗体对免疫沉淀物和裂解物进行免疫印迹分析。

E-H.抗病毒信号传导中多种蛋白质的SRC靶向酪氨酸磷酸化位点的鉴定。将HEK293细胞用指定质粒转染24小时，然后裂解细胞以用于用指定抗体进行免疫沉淀，并用指定抗体对免疫沉淀物进行免疫印迹分析。

I.抗病毒信号传导中野生型蛋白质及其突变体对ISRE的活化。将HEK293细胞用指定质粒以及报道质粒转染24小时，然后裂解细胞以用于萤光素酶测定。

J.通过GPS 3.0程序对抗病毒信号传导中多种蛋白质的SRC靶向磷酸化位点预测。

图6.

BA-TGR5途径对于宿主针对体内病毒感染的防御至关重要。

A.Tgr5缺陷对病毒诱导的血清细胞因子表达的作用。将Tgr5

B.Tgr5

C.病毒感染后Tgr5

D.CDCA对Tgr5

E.CDCA对病毒感染诱导的小鼠死亡的作用。将Tgr5

F.用于通过BA代谢调节抗病毒固有免疫的工作模型。

发明详述

定义

术语“胆汁酸(BA)”是主要见于哺乳动物和另一些脊椎动物的胆汁中的类固醇酸。不同物种可以在肝中合成不同分子形式的胆汁酸。

初级胆汁酸，包括胆酸(CA)和鹅脱氧胆酸(CDCA)，是由动物的肝合成的那些。次级胆汁酸，包括脱氧胆酸(DCA)和石胆酸(LCA)，是由肠中的细菌作用产生的。应当理解的是，初级胆汁酸和次级胆汁酸仅是通过其合成位置来分类。特定初级胆汁酸可以在除动物肝之外的另一位置产生，而特定次级胆汁酸可以通过除细菌作用之外的另一作用以及在除肠之外的另一位置产生。

胆汁酸可替代地分为游离胆汁酸和缀合胆汁酸。游离胆汁酸是为原位合成之后的原始形式的那些，包括CA、CDCA、DCA和LCA。缀合胆汁酸是游离胆汁酸与牛磺酸或甘氨酸的缀合物，包括牛磺胆酸和甘氨胆酸(胆酸的衍生物)，以及牛磺鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸的衍生物)，以及还包括DCA和LCA的牛磺酸和甘氨酸缀合物。胆汁酸通常为其盐形式，主要是钾盐和钠盐。这些为盐形式的胆汁酸通常称为胆汁盐。

在人中，牛磺胆酸和甘氨胆酸(胆酸的衍生物)以及牛磺鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸的衍生物)是胆汁中的主要胆汁盐，并且浓度大致相等。还发现了其7-α-脱羟基衍生物、脱氧胆酸和石胆酸的缀合盐，其中胆酸、鹅脱氧胆酸和脱氧胆酸的衍生物占人胆汁胆汁酸的超过90％。

术语“胆汁酸源”是指这样的物质，其在使用其的事件中能够提供胆汁酸。例如，胆汁酸源可以是胆汁酸本身、其盐、其缀合物、其衍生物，或其任何混合物。术语胆汁酸的衍生物意指可以转化为胆汁酸的物质。例如，胆汁酸的衍生物可以是胆汁酸的缀合物。

术语“激动剂”是与受体结合并活化该受体以产生生物响应的试剂，其中受体通常是信号传导途径的成员。在本文中，TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src激动剂是结合TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src途径的受体成员并活化该途径以产生增强的免疫应答、特别是固有免疫应答的试剂。术语“拮抗剂”具有与“激动剂”相反的含义。拮抗剂通过结合并阻断受体(而不是像激动剂那样活化受体)来阻断或抑制(dampen)生物响应。拮抗剂与其受体的结合将破坏受体与其激动剂的相互作用并抑制受体的功能。

虽然可能不正确，但是在一个特定的实施方案中，如果本领域已知化合物作为本公开内容的激动剂或拮抗剂发挥作用，则在该特定情况下可以将该化合物排除在激动剂/拮抗剂的定义之外。例如，TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src激动剂是本领域中不知其作为TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src激动剂发挥作用的试剂，同时TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src拮抗剂是本领域中不知其作为TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src拮抗剂发挥作用的试剂。

术语“途径”或“信号传导途径”描述了细胞中的一组分子，其共同作用以控制一种或更多种细胞功能，例如固有免疫应答。在途径中的第一个分子接收信号之后，其活化另一个分子。该过程重复进行直到最后一个分子被活化并且细胞功能得以实现。例如，TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src途径具有必需的成员，包括TGR5、GRK、β-抑制蛋白和Src，并且在该途径被活化时增强固有免疫应答。在特定情况下，阻断固有免疫途径(如TGR5-GRK-β-抑制蛋白-Src)可能会导致健康障碍，例如癌症，并且可以开发药物来增强该途径，并且这些药物可以帮助阻断癌细胞生长并杀伤癌细胞。

实施例

实验程序

试剂、抗体、病毒和细胞

以下购自指定制造商：激酶抑制剂BMS-345541、SAR-20347和MRT67307(MCE)；INT-777(MCE)；LCA、CDCA、DCA和CA(Sigma)；ISD45和HSV120(Sangon)、poly(I:C)和2’3’-cGAMP(Invivogen)；毛地黄皂苷(Sigma)；lipofectamine 2000(Invitrogen)；IFN-γ(Peptech)；BA测定试剂盒(Sigma)；鼠IFN-β和IFN-α(PBL)的ELISA试剂盒；小鼠抗HA(Covance)、Flag和β-肌动蛋白(Sigma)单克隆抗体；兔抗SRC、p-SRC(Y416)、β-抑制蛋白1、β-抑制蛋白2、GRK6、MITA、p-p65、p-IKKα/β和IKKα/β和p-IRF3(S396)(CST)、TBK1和p-TBK1(S172)(Abcam)、IRF3和p65(Santa Cruz Biotechnology)多克隆抗体。使用各自的重组蛋白作为抗原产生针对鼠TGR5、RIG-1、IRF3和VISA的小鼠抗血清。SeV、EMCV、HSV-1和VSV-GFP在先前已经描述(Huet al,2016and 2017)。HEK293细胞和HFF获自ATCC。HEK293T细胞最初由Gary Johnson博士(National Jewish Health)提供。如所描述的(Hu et al.,2015)制备原代Tgr5

构建体

通过标准分子生物学技术构建了以下：Flag和HA标记的SRC，HA标记的RIG-1、VISA、cGAS、MITA、TBK1、IRF3或其突变体，用于IRF3、p65、VISA、MITA、β-抑制蛋白1/2和SRC的CRISPR-Cas9 gRNA质粒，用于CYP7A1、CYP7B1、OATP、CYP27A1、HSD3B7、AKR1D1、AMACR、ACOX1、ACOX2、HSD17B4、EHHADH、SCP2、GNAI1、GNAI2、GNAI3、GNAS、ARRB1、ARRB2、GRK2、GRK3、GRK4、GRK5、GRK6和SRC的pSuper.Retro-shRNA质粒(Oligoengine)。

Tgr5敲除小鼠

Tgr5敲除小鼠由Di Wang博士(Zhejiang University,China)提供。所有动物实验均根据武汉大学动物护理和使用委员会(Wuhan University animal care and usecommittee)的指南进行。

转染

通过标准磷酸钙沉淀法转染HEK293和293T细胞。根据制造商推荐的程序用lipofectamine 2000转染BMDM。

通过质谱法测量细胞内BA

已经描述了通过MS进行BA分析(Zhu et al.,2015)。简单地说，将细胞样品在冰上解冻，然后将1mL甲醇添加至样品。涡旋5分钟之后，通过超声细胞破碎机将细胞破碎另外的5分钟，然后在4℃下以13680g离心5分钟，然后收集上清液。将该过程重复两次。将合并的上清液在氮气下干燥，并在100μL乙腈中重构，然后按顺序添加20μL碘化2-氯-1-甲基吡啶(20μmol/mL)、40μL三乙胺(20μmol/mL)和40μL d4-2-二甲基氨基乙胺(20μmol/mL)(Zhu etal.,2015)。将反应溶液在40℃下涡旋1小时，然后在氮气下蒸发。将用2-二甲基氨基乙胺进行化学标记之后的标准溶液(CA、LCA、CDCA、DCA)用作内标物。将2ng/mL IS添加至样品，然后溶解在100μL 20％乙腈(v/v)中，并经受LC-ESI-MS/MS系统，该系统由Shimadzu MS-8050质谱仪(Tokyo,Japan)和Shimadzu LC-20AD HPLC系统(Tokyo,Japan)组成。在40℃下在Acquity UPLC BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters)上进行分离。流动相由(A)ACN和(B)水中的甲酸(0.1％，v/v)组成。使用以下梯度：0至2分钟80％B，2至4分钟80％至75％B，4至8分钟75％至72％，8至11分钟72％至70％，11至12分钟70％至40％B，12至14分钟40％至20％B，14至15分钟20％至10％B以及15至16分钟10％至80％B。流动相的流速设定为0.4mL/分钟。选择[M+H]+的多反应监测(MRM)和适当的产物离子来定量BA。Zhu,Q.F.,Hao,Y.H.,Liu,M.Z.,Yue,J.，Ni,J.,Yuan,B.F.,Feng,Y.Q.,Journal of Chromatography A,1410(2015)154-163

qPCR

分离总RNA以用于qPCR分析，以测量指定基因的mRNA水平。显示的数据是相对于GAPDH归一化的指定mRNA的相对丰度。使用以下引物进行qPCR：

鼠Ifnb1：正向-TCCTGCTGTGCTTCTCCACCACA(SEQ ID NO:1)；

反向AAGTCCGCCCTGTAGGTGAGGTT(SEQ ID NO:2)。

鼠Isg56：正向-ACAGCAACCATGGGAGAGAATGCTG(SEQ ID NO:3)；

反向-ACGTAGGCCAGGAGGTTGTGCAT(SEQ ID NO:4)。

鼠Cxcl10：正向-ATCATCCCTGCGAGCCTATCCT(SEQ ID NO:5)；

反向-GACCTTTTTTGGCTAAACGCTTTG(SEQ ID NO:6)。

鼠Ifnb1：正向-TCCTGCTGTGCTTCTCCACCACA(SEQ ID NO:7)；

反向-AAGTCCGCCCTGTAGGTGAGGTT(SEQ ID NO:8)。

鼠Isg56：正向-ACAGCAACCATGGGAGAGAATGCTG(SEQ ID NO:9)；

反向-ACGTAGGCCAGGAGGTTGTGCAT(SEQ ID NO:10)。

鼠Cxcl10：正向-ATCATCCCTGCGAGCCTATCCT(SEQ ID NO:11)；

反向-GACCTTTTTTGGCTAAACGCTTTC(SEQ ID NO:12)。

鼠Gapdh：正向-ACGGCCGCATCTTCTTGTGCA(SEQ ID NO:13)；

反向-ACGGCCAAATCCGTTCACACC(SEQ ID NO:14)。

免疫共沉淀和免疫印迹分析

用RIPA缓冲液加完全蛋白酶抑制剂和20mM NEM裂解细胞，然后将裂解物进行声处理1分钟。将裂解物在4℃下以14000rpm离心20分钟。将上清液与相应抗体于4℃下孵育过夜，然后添加蛋白G珠2小时。将珠用冷的PBS加0.5M NaCl洗涤3次，然后用PBS进行另外的洗涤。通过8％SDS-PAGE分离蛋白质，然后用指定抗体进行免疫印迹分析。

噬斑测定

为了测量小鼠脑中HSV-1的复制，将速冻脑称重并在MEM培养基中匀浆3次(每次5秒)。匀浆后，将脑悬液以1620g离心30分钟，并将上清液用于接种在24孔板中的Vero细胞单层上的噬斑测定。

为了测量细胞中HSV-1的复制，将细胞用HSV-1(MOI＝0.01)感染指定时间，然后收集上清液用于接种在24孔板中的Vero细胞单层上的噬斑测定。通过在37℃下与连续稀释度的脑悬液孵育1小时来感染细胞。感染1小时之后，覆盖2％的甲基纤维素，并将板孵育约48小时。除去覆盖物，并将细胞用4％多聚甲醛固定15分钟，并用1％结晶紫染色30分钟，然后进行噬斑计数。

统计

对于小鼠实验，没有使用特定的盲法，但是每个样品组中的小鼠随机选择。每个实验组的样本量(n)在每个相应图例中进行了描述。GraphPad Prism软件用于所有统计分析。显示为直方图的定量数据表示为平均值±s.d.(表示为误差条)。使用Student未配对t检验(Student’s unpaired t-test)和对数秩(Log-rank)(Mantel-Cox)检验分析数据。星号的数目表示相对于P值的显著性程度。统计学显著性设定为P<0.05。

实验结果

1.病毒感染通过立即早期NF-κB活化来诱导BA转运体和合成酶的表达

为了研究BA代谢与固有抗病毒免疫之间的关系，本发明人首先检查了病毒感染之后人单核细胞THP1细胞中参与BA生物合成和吸收的基因的表达。出乎意料的是，DNA病毒单纯疱疹病毒1(HSV-1)和RNA病毒仙台病毒(SeV)二者特异性地诱导了参与胆汁酸生物合成的数种关键限速酶(包括CYP7A1、CYP7B1和CYP27A1)以及质膜定位的胆汁酸转运体OATP的转录(图1A和1J)。在这些实验中，HSV-1和SeV还诱导经典抗病毒基因IFNB1的转录，但不诱导以下的转录：其他非限速酶包括HSD3B7、SLC27A5、AKR1D1、AKR1C4、AMACR、ACOX1/2、HSD17B4、EHHADH和SCP2，或者其他转运体包括SLC51A和SLC51B，其主要形成充当负责将胆汁酸从肠上皮细胞输出到门脉血中的肠基底外侧转运体的异二聚体。(图1A)。此外，在THP1细胞中几乎未检测到数种肝和肝肠组织限制性蛋白质(包括CYP8B1、SLC27A5、NTCP和ASTB)的表达(图1A)。

病毒感染活化激酶IKKα/β和TBK1(其分别活化NF-κB和IRF3)，从而导致I型干扰素(IFN)和促炎细胞因子的诱导。I型干扰素通过JAK-STAT途径进一步诱导下游抗病毒基因。为了研究病毒感染如何诱导BA转运体和生物合成酶(TBE)，本发明人检查了IKKα/β抑制剂BMS-345541、TBK1抑制剂MRT67307以及JAK抑制剂SAR-20347对病毒触发的BA TBE基因转录的作用。本发明人发现，BMS-345541而不是MRT67307或SAR-20347消除了THP1细胞中HSV-1-和SeV诱导的CYP7A1、CYP7B1、CYP27A1和OATP基因的转录(图1B)。在同一实验中，所有三种抑制剂均削弱了病毒诱导的IFNB1基因转录(图1B)。这些结果表明，病毒触发的NF-κB活化对于诱导BA TBE基因至关重要。一致地，CRISPER/Cas9介导的NF-κB反式活化子p65而不是IRF3的敲除显著抑制SeV和HSV-1诱导的BA TBE基因以及公知的NF-κB靶向基因IKBA的转录(图1C和D)。CHIP测定表明，病毒感染诱导p65与BA TBE和IKBA基因的启动子的结合，但不诱导与染色质的基因间区的结合(图1E)。这些结果表明，病毒感染以NF-κB依赖性过程诱导参与胆汁酸生物合成和吸收的数种关键基因的转录。

本实验表明，分别为病毒RNA和DNA触发的NF-κB活化途径中的关键衔接子的VISA/MAVS或MITA/STING的缺陷分别削弱了SeV和HSV-1诱导的IFNB1基因转录，但是对病毒诱导的BA TBE(CYP7A1、CYP7B1、CYP27A1、OAT)和IKBA基因的转录没有明显作用(图1F和G)。有趣的是，生化分析表明，虽然VISA/MAVS或MITA/STING缺陷分别消除了SeV和HSV-1诱导的IRF3磷酸化，但是其缺陷仅在病毒感染之后的晚期(4至10小时)而不是立即早期(2小时)削弱IKKα/β和p65的磷酸化，其是NF-κB活化的标志(图1H和I)。这些结果表明，病毒感染之后，NF-κB的第一波以及VISA或MITA非依赖性活化驱动了BA TBE基因的转录。一致地，削弱病毒复制但不是进入细胞的病毒的UV处理削弱了HSV-1或SeV诱导的IFNB1基因转录，但不影响病毒诱导的BA TBE基因转录(图1K)。此外，经UV处理的病毒在病毒感染的立即早期(2小时)诱导了IKKα/β和p65的正常磷酸化，但是在晚期(4至10小时)不能诱导其磷酸化(图1L)。在同一实验中，在野生型细胞中，在SeV或HSV-1感染之后4小时时诱导了IRF3磷酸化，这分别在VISA或MITA缺陷细胞中或通过病毒的UV处理被消除(图1H和I，图1L)。这些结果表明，IRF3活化发生在第一波VISA和MITA依赖性NF-κB活化之后，并且分别需要病毒复制和VISA或MITA依赖性信号传导。

2.病毒感染诱导细胞内BA的积聚

本发明人出乎意料地发现，在含FBS的完全培养基(CM)或不含FBS的基础培养基(BM)中培养的人单核THP1、肝WRL68和HEK293细胞中，HSV-1感染和SeV感染二者引起细胞内BA水平的急剧提高(图2A和B，图2E)。有趣的是，与CM相比，在BM中培养的细胞中病毒感染之后BA水平的提高低约40％(图2A和B，图2E)。由于CM含有BA，而BM不含BA，因此这些结果表明，从头生物合成和细胞外至细胞内的运输二者有助于病毒诱导的细胞内BA的积聚。本结果还表明，在病毒感染之后，BA水平在早期(3至6小时)迅速提高，然后在后期(12小时)降低，这与BA在调节固有抗病毒应答中的关键作用相一致(见下面)。唯一的例外是在CM中培养的肝WRL68中，截止SeV感染之后12小时，BA水平持续提高而不降低(图2B)。肝细胞可能对RNA病毒诱导的细胞外BA摄取响应更长时间。

BA包括多种初级和次级分子。本发明人进一步通过质谱法(MS)确定了病毒感染之后积聚了哪些BA。本发明人发现，在持续6小时的HSV-1或SeV感染之后，在用BM培养的原代小鼠肝细胞中，仅初级胆汁酸CDCA和CA显著提高，而次级胆汁酸LCA或DCA则没有，表明在病毒感染之后仅初级BA生物合成。但是，在持续6小时的HSV-1或SeV感染之后，在CM中培养的原代小鼠肝细胞中所有检查的BA包括CDCA、CA、LCA和DCA均提高(图2C)，这表明病毒感染诱导了从培养基摄取初级胆汁酸CDCA和CA以及次级胆汁酸LCA和DCA。

接下来，本发明人研究了BA转运体和生物合成酶对病毒诱导的BA细胞内积聚的贡献。本发明人发现，shRNA介导的BA生物合成酶CYP7A1、CYP7B1或HSD3B7(CYP7A1和CYP7B1的常见下游酶)或者BA转运体OATP的敲低显著抑制了在CM中培养的THP1细胞中HSV-1和SeV诱导的BA水平的提高(图2D)。当在BM中培养THP1时，CYP7A1、CYP7B1或HSD3B7而不是OATP的敲低显著抑制了HSV-1或SeV诱导的细胞内BA水平的提高(图2D)。总之，这些结果表明病毒感染诱导的细胞内BA的积聚是由CYP7A1和CYP7B1介导的从头生物合成以及OATP介导的从培养基中摄取二者引起的。

3.BA是固有免疫应答的有效诱导剂

本发明人使用固有抗病毒免疫应答作为实例进一步研究了BA在固有免疫中的重要性。本发明人出人意料地发现，敲低OATP、CYP7A1、CYP7B1、CYP27A1或HSD3B7显著抑制了HSV-1或SeV诱导的下游抗病毒IFNB1和CXCL10基因的转录(图3A)。作为对照，这些BA转运体和生物合成酶的敲低不影响IFN-γ诱导的IRF1基因转录(图3B)。一致地，在CYP7A1、CYP7B1或CYP27A1敲低细胞中，病毒诱导的IRF3磷酸化被显著抑制(图3C)。报道子测定表明，所有检查的参与BA生物合成途径的酶的敲低均显著抑制SeV以及转染的合成poly(I:C)和B-DNA诱导的IFN-β启动子的活化(图3I和J)，但对IFNγ诱导的IRF1启动子的活化没有明显的作用(图3K)。这些结果表明BA的生物合成在固有免疫应答中发挥重要作用。

接下来，本发明人确定了BA是否直接调节固有免疫应答。本发明人发现，LCA和CDCA强效诱导下游固有免疫基因包括IFNB1、CXCL10和ISG56的转录(图3D)。一致地，LCA和CDCA还诱导TBK1和IRF3的磷酸化，其是这些必需的固有免疫信号传导组分活化的标志(图3E)。时程实验表明，BA在早至2小时时诱导IFNB1基因的转录，并且在刺激之后4小时时达到峰值(图3L)。此外，外源BA也可以增强HSV-1或SeV诱导的IFNB1、CXCL10和ISG56基因的转录(图3F)以及IRF3的磷酸化(图3G)。此外，荧光显微镜实验和流式细胞术分析二者表明，用CDCA处理显著抑制了VSV-GFP复制(图3H和M)。这些结果表明，BA是固有免疫应答的有效诱导剂。

4.BA通过TGR5-GRK-β-抑制蛋白-SRC轴促进固有免疫应答

接下来，本发明人研究了BA诱导的固有免疫应答的机制。本发明人出乎意料地发现，在报道子测定中，TGR5而不是FXR的敲低显著抑制了SeV诱导的IFN-β启动子活化，而TGR5或FXR的敲低均对IFN-γ诱导的IRF1启动子活化没有明显作用(图4A)，表明TGR5而不是FXR在固有抗病毒免疫应答中发挥重要作用。一致地，响应于HSV-1、SeV或脑心肌炎病毒(EMCV)的感染，合成病毒DNA模拟物HSV120(代表HSV-1基因组的dsDNA(120聚体))或ISD45(IFN刺激DNA 45)、poly(I:C)或cGAMP的转染，TGR5缺陷小鼠巨噬细胞表达较低水平的Ifnb1和Cxcl10 mRNA(图4B和4L)。此外，HSV-1和SeV诱导的TBK1和IRF3的磷酸化在TGR5缺陷的巨噬细胞中也被抑制(图4C)。此外，选择性TGR5激动剂CDCA和INT-777(图4M)在Tgr5

TGR5是G蛋白偶联受体(GPCR)家族的成员，该家族活化不同的下游效应蛋白，包括G蛋白和β-抑制蛋白1/2。本发明人发现，在报道子测定中，同时而不是单独敲低β-抑制蛋白1或β-抑制蛋白2显著抑制了SeV诱导的IFN-β活化的转录(图4N)。在同一实验中，敲低多种G蛋白亚型，包括数种Gα(由GNAI1、GNAI2和GNAI3编码的抑制性G蛋白亚基α)和Gαs(由GNAS编码的刺激性G蛋白亚基α)对SeV诱导的IFN-β活化没有任何显著作用(图4N)。一致地，通过CRISPR/Cas9方法同时敲除ARRB1(编码β-抑制蛋白1)和ARRB2(编码β-抑制蛋白2)基因显著抑制THP-1细胞中HSV-1或SeV诱导的IFNB1和CXCL10基因的转录(图4E)。这些结果表明，β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2在固有抗病毒免疫应答中起着冗余作用。众所周知，将β-抑制蛋白募集至活化的GPCR需要GPCR相关激酶(GRK)(Premont et.al.,2007)。本发明人发现，敲低GRK2、GRK4或GRK6显著抑制了SeV诱导的IFN-β启动子的活化，而敲低GRK3或GRK5则具有最小的作用(图4F和4O)。作为对照，在报道子测定中，β-抑制蛋白或GRK的敲低对IFN-γ诱导的IRF1启动子的活化没有明显作用(图4P)。进一步的生化实验表明，SeV诱导的TBK1和IRF3磷酸化在β-抑制蛋白1/2、GRK2和GRK6缺陷细胞中被显著抑制(图4Q)。这些结果表明，TGR5-GRK-β-抑制蛋白轴介导BA诱导的固有免疫应答。

接下来，本发明人确定了细胞内BA是否响应于病毒感染经由TGR5-GRK-β-抑制蛋白轴活化SRC。生化实验表明，BA和INT-777处理以及病毒感染诱导的Y416处SRC的磷酸化，其是SRC活化的标志(Cooper et al.,1993)(图4G、4H和4R)，并且Tgr5缺陷或β-抑制蛋白1/2的敲低削弱了SeV诱导的SRC和IRF3的磷酸化(图4H)。内源免疫共沉淀实验表明，SeV感染在病毒感染之后3小时时诱导了β-抑制蛋白、GRK6和SRC向TGR5的募集(图4I)。进一步的实验表明，CRISPR/Cas9介导的SRC的敲除极大地抑制了SeV诱导的Ifnb1和Cxcl10基因的转录以及TBK1和IRF3的磷酸化(图4J和K)。这些结果表明，BA触发的和TGR5-GRK-β-抑制蛋白介导的SRC活化对于有效的固有免疫应答是必不可少的。

5.SRC介导固有免疫信号传导途径中多种关键组分的酪氨酸磷酸化和活化

本发明人进一步研究了SRC是否调节固有抗病毒免疫信号传导途径中的其他组分。瞬时转染和免疫共沉淀实验表明，SRC与RIG-I、VISA和MITA强烈相互作用，并且与TBK1和IRF3弱相互作用，但与cGAS没有相互作用(图5A)。内源免疫共沉淀实验表明，病毒感染之后，SRC与RIG-1、VISA/MAVS、TBK1和IRF3的缔合提高，而SRC持续与MITA/STING缔合(图5B)。此外，SRC的过表达引起RIG-1、VISA、MITA、TBK1和IRF3但不是cGAS的酪氨酸磷酸化(图5C)，而SRC缺陷削弱了SeV或HSV-1诱导的内源性RIG-I、VISA/MAVS、TBK1、IRF3和MITA/STING的酪氨酸磷酸化(图5D)。这些结果表明，SRC介导了固有免疫信号传导途径中多种蛋白质的病毒诱导的酪氨酸磷酸化。

接下来，本发明人研究了固有抗病毒免疫信号传导途径中关键组分的SRC介导的酪氨酸磷酸化的功能意义。通过GPS3.0程序鉴定了RIG-1(其负责信号传导下游活化)、VISA、MITA和IRF3的CARD结构域的多个潜在的SRC靶向酪氨酸残基(图5J)。生化分析表明，Y24、Y40和Y86同时突变为苯丙氨酸(F)(RIG-I-CARD-Y3F)完全消除了SRC介导的RIG-I-CARD的酪氨酸磷酸化(图5E)，表明这三个残基被SRC靶向。VISA的Y9、Y92、Y95、Y130、Y140和Y460同时突变为F(VISA-6YF)削弱了SRC介导的酪氨酸磷酸化(图5F)，表明这些残基被SRC靶向。MITA的Y245突变为F(MITA-Y/F)消除了MITA的SRC介导的酪氨酸磷酸化(图5G)，表明SRC在Y245处催化MITA磷酸化。IRF3的Y107突变为F(IRF3-Y/F)削弱了SRC介导的IRF3酪氨酸磷酸化(图5H)，表明SRC在Y107处催化IRF3磷酸化。报道子测定表明，在报道子测定中与其野生型对应物相比，这些突变体失去了活化ISRE的能力(图5I)。这些结果表明，固有抗病毒免疫应答途径中关键组分的SRC介导的酪氨酸磷酸化对其活化是重要的。

6.BA-TGR5途径对于宿主针对体内病毒感染的防御是重要的

最后，本发明人确定了BA-TGR5轴在体内固有抗病毒免疫中的重要性。ELISA实验表明，与其野生型同窝出生仔畜相比，Tgr5

因此，本发明人提出了用于阐明BA代谢和抗病毒固有免疫的微妙调节关系的工作模型(图6F)。简单地说，病毒感染触发立即早期NF-κB活化，其导致参与BA生物合成和吸收的数种关键蛋白质CYP7A1、CYP7B1、CYP27A1和OATP的迅速诱导，导致通过吸收和生物合成二者的细胞内BA的积聚。然后，积聚的BA活化TGR5-GRK-β-抑制蛋白-SRC途径，然后是抗病毒免疫信号传导中多种蛋白质(包括RIG-I、VSIA/MAVS、MITA/STING、TBK1和IRF3)的SRC介导的全局酪氨酸磷酸化，这对于其活化和能够进行抗病毒固有免疫应答是关键的。

讨论

近年来，解码细胞代谢与免疫之间相互调节的内在原理引起了广泛的关注，因为其可能为代谢疾病和免疫疾病二者的治疗带来一些新的方向。本研究结果发现，通过立即早期NF-κB活化的病毒感染触发的细胞内BA积聚能够使通过TGR5-GRK-β-抑制蛋白-SRC途径的抗病毒固有免疫应答在BA代谢与抗病毒固有免疫之间建立微妙的回路，其可能有益于寻找用于治疗代谢和免疫疾病的新方法。

由于许多肝外组织中参与经典BA生物合成途径的限速酶CYP7A1的水平极低，认为BA的生物合成仅限于肝。尽管胆汁酸生物合成的替代(酸性)途径中的限速酶CYP27A1和CYP7B1也在巨噬细胞和除肝以外的其他组织中表达，但没有强有力的证据表明BA是否也可以通过该途径在肝外组织中生物合成。在这项研究中，本发明人证明，由于诱导了参与BA生物合成的数种限速酶(包括CYP7A1、CYP7B1和CYP27A1)，病毒感染之后在许多类型的细胞中活化了BA的生物合成，这为BA代谢的基础知识提供了新的视角。此外，自从数十年前将BA鉴定为激素以来，深入的研究揭示了其激素功能，包括通过核胆汁酸受体FXR对肝和肠中葡萄糖和脂质代谢的直接代谢作用，以及通过另一种质膜结合的胆汁酸受体TGR5调节代谢、内分泌和神经过程。无一例外，所有这些报道的功能都由生物合成的、从肝分泌的或从肠道吸收的胞外BA来执行。本研究结果首次发现，通过生物合成和吸收二者的病毒感染诱导的细胞内BA的积聚通过活化细胞内TGR5-GRK-β-抑制蛋白-SRC途径促进了抗病毒固有免疫应答，揭示了许多细胞中BA代谢的普遍和固有的细胞功能。

在本研究中，本发明人利用一系列生化和和遗传实验和分析强烈证明，病毒感染触发的TBE基因(CYP7A1、CYP7B1、CYP27A1和OATP)的表达依赖于立即早期NF-κB活化。在病毒感染期间，数种机制可能参与NF-κB活化，例如病毒细胞膜融合、抗病毒固有免疫应答、病毒复制以及一些病毒特异性蛋白质的表达。根据本结果，本发明人提出病毒感染诱导的这些TBE基因的表达可能依赖于在固有免疫应答和病毒复制之前的病毒-细胞膜融合触发的信号级联反应。这促成了以下的本发明进一步发现并且与其一致：这些TBE基因的诱导对于活化抗病毒固有免疫应答至关重要。

通过探究BA的生物合成和吸收在病毒触发的信号传导中的功能，本发明人证明胞内BA的积聚是最佳抗病毒固有免疫应答所必需的。进一步的研究表明，TGR5而非FXR是负责BA介导的抗病毒固有免疫应答增强的主要受体。作为GPCR，TGR5主要在质膜上表达，并且通常介导细胞外BA触发的信号传导，以调节许多细胞内生物学过程，这可能部分解释了外源BA处理对I型IFN的诱导。然而，在本研究中，本发明人证明了TGR5还能够通过细胞内胆汁酸的积聚而被活化，这意味着TGR5可能除质膜外还分布在细胞内的细胞器上，这与TGR5也分布在内体和核酸膜上的先前报道一致(PMID:23578785,PMID:19582812)。TGR5的精确细胞内定位以及在病毒感染期间TGR5是否从质膜和细胞内细胞器移位需要进一步研究。

尽管已经充分确定了BA-TGR5-cAMP-PKA信号传导途径参与多种生物过程的调节，但本研究表明，细胞内BA的积聚活化了TGR5-GRK-β-抑制蛋白-SRC途径以增强抗病毒固有免疫应答，因为该途径中任何蛋白质的缺陷都会显著削弱病毒触发的I型IFN产生。此外，在病毒感染之后，检测到β-抑制蛋白、GRK6和SRC与TGR5的内源性缔合。在本实验中，本发明人注意到，TGR5缺陷完全阻断了Y416处SRC的HSV-1诱导的磷酸化，但仅部分削弱了SeV诱导的磷酸化，这暗示HSV-1诱导的SRC活化完全依赖于BA-TGR5途径，而SeV诱导的SRC活化仅部分依赖于BA-TGR5途径。利用抗病毒信号传导中多种蛋白质的SRC靶向磷酸化位点的突变显著削弱了其对IFN-β的活化的结果，本发明人提出抗病毒途径通过SRC的泛酪氨酸磷酸化对其活化至关重要，这与SRC缺陷显著削弱病毒触发的IFNB1和另一些抗病毒基因的诱导的结果一致，尽管通过SRC介导的泛酪氨酸磷酸化对抗病毒信号传导中的多种蛋白质进行调节的详细机制将来还需要进一步研究。

在本研究中，本发明人注意到，在病毒感染之前和之后，在Tgr5

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