一种不会引起心率过缓的核苷酸类化合物

技术领域

本发明涉及基于核苷酸结构的化合物，还涉及该基于核苷酸结构的化合物在抑制RNA病毒复制中的用途。

背景技术

病毒感染是目前世界上主要的传染性疾病，占传染性疾病病种的四分之三以上，严重威胁着人类的健康和生命。

在目前己上市的抗病毒药物中，核苷类化合物占半数以上，在抗病毒治疗中具有相当重要的地位。核苷类药物作为病毒聚合酶或逆转录酶抑制剂，在进入细胞后，经逐步磷酸化转变为三磷酸核苷类似物发挥抗病毒作用。然而由于核苷类药物普遍具有毒性大、体内半衰期短、易诱发耐药株等缺陷，其临床应用受到很大限制。

胺碘酮(amiodarone)用作抗心律失常药物已30余年,占抗心律失常药物处方的1/3,已成为抗心律失常药物治疗中不可缺少的成员。胺碘酮药代动力学的最大特点是吸收慢,半衰期长，长期口服治疗后清除半衰期可长达60余天。

美国FDA更新了丙肝抗病毒药物ledipasvir/sofosbuvir(Harvoni)sofosbuvir(Sovaldi)(均为核苷类化合物)的说明书信息，因有多起临床报告称患者在联用该类药物与胺碘酮后发生心动过缓导致死亡事件。

尤其需要注意的是，胺碘酮的半衰期很长，很多患者或者医护人员在进行抗病毒治疗时很可能因为忽略胺碘酮的存在而导致心率过缓。

由于生物体内手征性环境的存在,同种药物分子的不同光学异构体进入人体,将由体内手性受体、酶、载体等作为完全不同的分子处理,因此所起的药效也往往存在显著的差异。例如，沙立度胺R型异构体具有镇静作用，但其S型异构体及代谢产物却有强的胚胎有毒素和致畸作用,曾一度造成数千例短肢畸胎惨剧的发生。氯胺酮是一种常用的巴比妥类静脉麻醉药,该药虽然无抑制呼吸作用,但有不良反应。目前仍以外消旋没体给药,但副作用较大,术后病产生幻觉、情绪不稳定、心里失调。研究证明起醉作用的主要是右旋体,而副作用主要是左旋体引起的。

发明内容

本发明一方面提供了基于核苷酸结构的化合物，所述基于核苷酸结构的化合物和抗心律失常药物胺碘酮共用时不会引起心律过缓的副作用。

本发明的方案如下：

一种基于核苷酸结构的化合物，其特征在于，所述化合物的结构如式I所示或式I在药学上可接受的盐或酯：

其中：

R

R

连接R

作为上述技术方案的进一步改进，R

作为上述技术方案的进一步改进，所述化合物选自以下结构中所示化合物中的至少一种：

另一方面，本发明还提供了所述化合物或其在药学上可接受的盐或酯在制备治疗和/或预防RNA病毒的药物中的用途。

作为上述技术方案的进一步改进，其中所述RNA病毒为COVID-19。

作为上述技术方案的进一步改进，其中所述RNA病毒为流感病毒。

作为上述技术方案的进一步改进，其中所述流感病毒为H1N1。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明所述的化合物或其在药上可接受的盐或酯与抗心律失常药物胺碘酮共用时不会引起心律过缓的副作用，索非布韦等抗病毒药物与胺碘酮共用会引起心率过缓的副作用。

2.本发明核苷酸类似物具有阻断作用的磷酸基团，还在特定部位进行了取代，具有良好的细胞渗透性，使其能够进入受感染的真核细胞，其是一种前药，通过细胞酶转化为活性三磷酸形式，激活后的药物结合在RNA聚合酶(RdRP)的活性部位，之后被整合到RNA中，由于在2’位的修饰，可抑制RNA链的进一步延伸并终止RNA的复制，它作为RNA聚合酶抑制剂可与天然核糖核苷酸竞争。本发明所述的化合物或其在药学上可接受的盐或酯对于新冠病毒、流感具有良好的抑制作用。

附图说明

图1显示不同构型化合物和胺碘酮共有时对于心率的影响。

具体实施方式

为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。

实施例1：化合物1与胺碘酮合用

1.IPS诱导生成心肌细胞，将心肌细胞均匀铺在24孔板爬片上。

2.采用Patchmaste软件和HEKA EPC-10放大器、全细胞记录模式、10kHz的采样频率记录心肌细胞自发动作电位。

3.将重力灌流系统流速调节至5mL/min，并调节温控装置可持续保持记录槽内温度为35-36℃。

4.取爬片于载物台上覆盖满细胞外液的记录槽内，拉制入水电阻值为6-8MΩ的电极并灌入1-2cm高度的电极内液，将电极固定在微距操作器上，显微镜下找到细胞轮廓较为清晰的细胞，使用微距操作器移动电极，使电极慢慢靠近细胞，电极靠近细胞后，下压0.2MΩ并给予负压封接，封接电阻约等于或大于1GΩ时，再次给予短促强力的负压，待封接峰形变化为破膜峰形，等待阻值稳定在GΩ3-5min后，Setup去掉所有补偿，选择记录模式为C-clamp，去掉刺激电流(I＝0pA)，灌流给药记录心肌细胞自发动作电位。细胞灌流给药前先灌流含0.1％DMSO的细胞外液并持续5min，保证灌流给药过程中动作电位发放频率稳定后，再分别灌流给予细胞外液配置的终浓度为3μM化合物1或化合物1*、0.3μM Amiodarone(胺碘酮)的药物，记录给药前后细胞的动作电位变化情况。

细胞外液如下表1所示(外液用NaOH、HCl调节PH至7.4左右)。

细胞内液如下表2所示(内液用KOH、HCl调节PH至7.4左右).

表1

表2

化合物1的结构式如下:

化合物1*的结构式如下，其与化合物1的区别在于，氰基连接的C原子的构型不同，其为R构型，而化合物1位S构型。

测试结果如图1所示，通过分析各组心肌细胞动作电位，在单独灌流化合物1和化合物1*后，心肌细胞的动作电位无明显变化。但是在共用化合物1*和胺碘酮之后，心肌细胞的动作电位发生了明显的动作时程延长，而在共用化合物1和胺碘酮之后，心肌细胞的动作电位并无明显变化。由此可知，与R构型相比，本发明所述S型核苷酸类化合物与抗心律失常药物胺碘酮共用时不会引起心律过缓的副作用。

实施例2：化合物1～3对新冠病毒抑制效果

以下实验由广州海关技术中心BSL-3级实验室进行。

Day 0细胞铺板

Vero E6细胞进行96孔细胞板铺板，1.6×10

Day 1抗病毒实验

1.药物稀释：药物储存浓度为10mM，用DMEM培养基将其分别稀释至10μM、5μM、1μM作用浓度组和20μM、10μM、2μM作用浓度组。

2.预处理：实验分别设置细胞对照组、病毒感染组、药物病毒作用组、药物对照组共计4组实验，每种药物3个复孔。在Vero E6细胞感染病毒前吸弃细胞培养上清，在药物病毒作用组及药物对照组中加入相应10μM、5μM、1μM作用浓度培养液，100μL/well。37℃、5％CO

3.抗病毒作用：预处理之后在BSL-3实验室中，吸弃所有细胞板内上清，用D2培养基稀释2019-nCoV(COVID-19)病毒，使其MOI＝0.05，体积为25μL/well。将稀释好的病毒25μL/well与药物20μM、10μM、2μM作用浓度组(25μL/well)混合，形成药物病毒作用组50μL/well。其余的组用相应的D2培养基来代替药物或病毒进行混合。将混合后的培养基孵育细胞，37℃、5％CO

4.细胞培养：混合孵育后的细胞吸弃上清，分别药物病毒作用组内加入10μM、5μM、1μM药物培养基(D2作为稀释液)100μL/well。在其他组内加入相应的D2或药物培养基100μL/well，37℃、5％CO

Day 2IFA检测

1.细胞板固定：在BSL-3级实验室，细胞板内弃去培养上清，加入4％PFA 200μL/well，室温固定大于3h。

2.IFA检测：Triton打孔破膜封闭后，SARS-N兔单抗作为一抗作用1h，A488anti-Rabbit IgG为二抗作用1h，洗板，荧光观察。

实验结果如下表3所示：

表3

由对新冠病毒的抑制实验可知，本发明所述化合物1～3还可有效抑制新冠病毒，本发明所述的化合物或其在药学上可接受的盐或酯可用于制备治疗新冠病毒感染的药物。

实施例2

化合物1～3对流感病毒抑制效果

病毒感染性测定(TCID50的测定)

取出病毒液溶解后，用无血清无双抗培养基进行连续10倍的梯度稀释，可稀释为10

细胞出现病变(CPE)程度按6级标准记录：

-：细胞生长正常，无病变出现；

±：细胞病变少于整个单层细胞的10％；

+：细胞病变少于整个单层细胞的25％；

++：细胞病变少于整个单层细胞的50％；

+++：细胞病变少于整个单层细胞的75％；

++++：细胞病变占整个单层细胞的75％以上。

结果判定及计算方法：

根据Reed-Muench法，计算病毒的半数感染量TCID50。

比例距离(PD)＝(病变高于50％的百分数-50％)/(病变高于50％的百分数-病变低于50％的百分数)

其中细胞病变率达50％及以上的培养孔计为病变孔，细胞病变率小于50％者计为非病变孔。

体外抗病毒试验

(1)实验方法

待96孔板细胞长成单层后进行体外抗病毒试验。病毒攻击量为10～100TCID50。病毒吸附单层细胞1-2h后，洗去病毒液，各孔分别加入100μL药液和100μL维持液，同时设病毒对照，空白细胞对照。置于相应温度的CO

(2)计算方法：

根据Reed-Muench法，计算药物50％有效浓度(IC50)和治疗指数(TI)。

病毒抑制率＝(药物组OD450-病毒对照组OD450)/(正常细胞对照组OD450-病毒对照组OD450)。

TI＝TC50/IC50。

实验结果如下表4所示：

表4

由对流感病毒的抑制实验可知，本发明所述化合物1～3可有效抑制H1N1病毒，本发明所述的化合物或其在药学上可接受的盐或酯可用于制备治疗流感病毒感染的药物。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。