用于治疗艰难梭菌的方法和组合物

本申请要求2018年6月7日提交的美国临时专利申请第62/681,774号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本技术一般涉及用于预防、改善或治疗艰难梭菌(Clostridium difficile)感染和/或降低与艰难梭菌感染相关的一种或多种风险因素、体征或症状的严重程度的组合物和方法。特别地，本技术涉及向患有艰难梭菌感染或处于艰难梭菌感染风险中的对象施用有效量的包含被鉴定为ART24、ART4和ART1的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)细菌菌株的组合物。

背景技术

提供以下描述以帮助读者理解。所提供的信息或所引用的参考文献均不认为是本文公开的组合物和方法的现有技术。

艰难梭菌是能够寄生于大肠的、形成孢子的革兰氏阳性厌氧杆菌。在特定的临床条件下(例如当天然微生物群已被破坏或耗尽时)，艰难梭菌可以过度生长并产生导致疾病病理的毒素。艰难梭菌感染(CDI)可以导致范围从轻度腹泻到威胁生命的假膜性结肠炎和中毒性巨结肠的症状。长期使用抗生素、尤其是广谱药剂，可以诱导肠道微生物群的组成和功能的变化，导致抗生素相关性腹泻 (AAD)。CDI或艰难梭菌相关性疾病(CDAD)用于描述由艰难梭菌杆菌产生的毒素A和毒素B引起的一系列疾病。

艰难梭菌是医院内感染性腹泻的最常见原因，并且正成为健康护理系统的增加的负担，导致美国每年大约29,000例死亡并且总计超过10亿美元。艰难梭菌的高毒力菌株的出现与疾病流行和严重程度的增加以及甲硝哒唑的较高治疗失败率有关。

当前的治疗方法包括终止用令人不快的一种或多种抗生素治疗以及开始用万古霉素或甲硝哒唑或非达霉素治疗。用标准护理(SOC)抗生素治疗感染艰难梭菌的患者降低发病率和死亡率。然而，对甲硝哒唑没有反应的患者的数量正在增加。抗生素治疗会破坏并能够抑制有益的内源性胃肠道(GIT)微生物群的重建，这使得有效治愈的患者处于疾病复发的风险中。尽管在感染的治疗方面有进展，但在最初的CDI病例之后约10％至35％的患者中以及在初次复发之后35％至65％的患者中观察到CDI复发。因此，需要用于CDI的更有效疗法，特别是保留内源性胃肠道微生物群的疗法。

发明内容

在一方面，本公开提供了选自由以下组成的组的细菌菌株：ART24(NCIMB 登记号43088)、ART4(NCIMB登记号43086)和ART12(NCIMB登记号43087)。在一方面，本公开提供了组合物，其包括选自由ART24(NCIMB登记号43088)、 ART4(NCIMB登记号43086)和ART12(NCIMB登记号43087)组成的组的一种或多种细菌菌株、以及保存剂。在一些实施方式中，细菌菌株是ART24(NCIMB 登记号43088)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART4(NCIMB登记号43086)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART12(NCIMB登记号43087)。

在一些实施方式中，细菌菌株是冻干的。在一些实施方式中，细菌菌株是呈孢子的形式。在一些实施方式中，所述保存剂选自由以下组成的组：蔗糖、海藻糖、抗坏血酸钠和谷胱甘肽。在一些实施方式中，保存剂是冷冻保护剂。在一些实施方式中，冷冻保护剂选自由以下组成的组：核苷酸、二糖、多元醇和多糖。在一些实施方式中，冷冻保护剂选自由以下组成的组：肌苷-5’-单磷酸 (IMP)、鸟苷-5’-单磷酸(GMP)、腺苷-5’-单磷酸(AMP)、尿苷(uranosine)-5’-单磷酸(UMP)、胞苷-5’-单磷酸(CMP)、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟苷、尿苷、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、乳清苷、胸苷、肌苷、海藻糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、糊精、菊粉、抗坏血酸钠、谷胱甘肽、脱脂乳和冷冻保护剂18。在一些实施方式中，冷冻保护剂包括海藻糖。

在一方面，本公开提供了药物组合物，其包含选自由ART24(NCIMB登记号43088)、ART4(NCIMB登记号43086)和ART12(NCIMB登记号43087)组成的组的一种或多种细菌菌株、以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括多糖、槐树豆胶、阴离子多糖、淀粉、蛋白质、抗坏血酸钠、谷胱甘肽、海藻糖、蔗糖或果胶。在一些实施方式中，多糖包括植物多糖、动物多糖、藻类多糖或微生物多糖。在一些实施方式中，多糖包括瓜尔胶、菊粉、直链淀粉、壳聚糖、硫酸软骨素、藻酸盐或葡聚糖。在一些实施方式中，淀粉包括大米淀粉。

在一些实施方式中，所述组合物还包含抗生素。在一些实施方式中，抗生素包括以下中的一者或多者：甲硝哒唑、万古霉素和硝唑尼特。

在一些实施方式中，所述组合物被配制用于肠内施用。在一些实施方式中，组合物被配制用于口服递送、用于舌下递送、用于直肠递送或用作益生菌。

在一方面，本公开提供了用于治疗或预防有需要的对象中的艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病(CDAD)的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种细菌菌株：ART24(NCIMB登记号43088)，ART4(NCIMB登记号43086)和 ART12(NCIMB登记号43087)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART24(NCIMB 登记号43088)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART4(NCIMB登记号43086)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART12(NCIMB登记号43087)。

在一些实施方式中，细菌菌株是冻干的。在一些实施方式中，细菌菌株呈孢子的形式。

在一些实施方式中，艰难梭菌感染或CDAD包括以下中的一者或多者：腹泻、体重减轻、食欲丧失、腹胀、流感样症状、发热、腹痛、恶心、脱水、结肠炎和伪膜性结肠炎。在一些实施方式中，CDAD包括抗生素相关性腹泻 (AAD)。

在一些实施方式中，肠内施用所述药物组合物。在一些实施方式中，所述方法还包括向所述对象分别、依次或同时施用一种或多种抗生素。在一些实施方式中，所述一种或多种抗生素包括以下中的一者或多者：甲硝哒唑、万古霉素和硝唑尼特。在一些实施方式中，所述方法还包括分别、依次或同时施用抗毒素B单克隆抗体。

在一方面，本公开提供了组合物在制备用于治疗或预防有需要的对象中的艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病(CDAD)的药物中的用途，其中，所述组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种细菌菌株：ART24(NCIMB登记号 43088)、ART4(NCIMB登记号43086)和ART12(NCIMB登记号43087)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART24(NCIMB登记号43088)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART4(NCIMB登记号43086)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART12(NCIMB登记号43087)。

在一些实施方式中，细菌菌株是冻干的。在一些实施方式中，细菌菌株呈孢子的形式。

在一些实施方式中，艰难梭菌感染或CDAD包括以下中的一者或多者：腹泻、体重减轻、食欲丧失、腹胀、流感样症状、发热、腹痛、恶心、脱水、结肠炎和伪膜性结肠炎。在一些实施方式中，所述CDAD包括抗生素相关性腹泻(AAD)。

在一些实施方式中，所述药物被配制成口服施用、舌下施用或直肠施用。在一些实施方式中，治疗或预防包括向所述对象分别、依次或同时施用一种或多种抗生素。在一些实施方式中，所述一种或多种抗生素包括以下中的一者或多者：甲硝哒唑、万古霉素和硝唑尼特。在一些实施方式中，治疗或预防包括分别、依次或同时施用抗毒素B单克隆抗体。

在一方面，本公开提供了用于治疗或预防有需要的对象中的产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)感染的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含选自由以下组成的组的细菌菌株： ART24(NCIMB登记号43088)、ART4(NCIMB登记号43086)和ART12(NCIMB 登记号43087)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART24(NCIMB登记号43088)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART4(NCIMB登记号43086)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART12(NCIMB登记号43087)。

在一些实施方式中，细菌菌株是冻干的。在一些实施方式中，所述细菌菌株呈孢子的形式。

在一些实施方式中，所述感染包括以下中的一者或多者：腹痛、胃痉挛、腹泻和恶心。在一些实施方式中，肠内施用所述药物组合物。在一些实施方式中，所述方法还包括向所述对象分别、依次或同时施用一种或多种抗生素。在一些实施方式中，所述一种或多种抗生素包括以下中的一者或多者：甲硝哒唑、万古霉素和硝唑尼特。

在一方面，本公开提供了组合物在制备用于治疗或预防有需要的对象中的产气荚膜梭菌感染的药物中的用途，其中，所述组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种细菌菌株：ART24(NCIMB登记号43088)、ART4(NCIMB登记号43086)和ART12(NCIMB登记号43087)。在一些实施方式中，细菌菌株是 ART24(NCIMB登记号43088)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART4(NCIMB 登记号43086)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART12(NCIMB登记号43087)。

在一些实施方式中，细菌菌株是冻干的。在一些实施方式中，所述细菌菌株呈孢子的形式。

在一些实施方式中，所述感染包括以下中的一者或多者：腹痛、胃痉挛、腹泻、和恶心。在一些实施方式中，肠内施用所述药物组合物。在一些实施方式中，所述用途还包括向所述对象分别、依次或同时施用一种或多种抗生素。在一些实施方式中，所述一种或多种抗生素包括以下中的一者或多者：甲硝哒唑、万古霉素和硝唑尼特。

在一方面，本公开内容提供了用于治疗或预防有需要的对象中的单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)感染的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种细菌菌株：ART24(NCIMB登记号43088)、ART4(NCIMB登记号43086) 和ART12(NCIMB登记号43087)。在一些实施方式中，细菌菌株是 ART24(NCIMB登记号43088)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART4(NCIMB 登记号43086)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART12(NCIMB登记号43087)。

在一些实施方式中，细菌菌株是冻干的。在一些实施方式中，所述细菌菌株呈孢子的形式。

在一些实施方式中，所述感染包括以下中的一者或多者：腹痛、流感样症状、胃痉挛、腹泻和恶心。在一些实施方式中，肠内施用所述药物组合物。在一些实施方式中，所述方法还包括向所述对象分别、依次或同时施用一种或多种抗生素。在一些实施方式中，所述一种或多种抗生素包括以下中的一者或多者：甲硝哒唑、万古霉素和硝唑尼特。

在一方面，本公开内容提供了组合物在制备用于治疗或预防有需要的对象中的单核细胞增多性李斯特菌感染的药物中的用途，其中，所述组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种细菌菌株：ART24(NCIMB登记号43088)、 ART4(NCIMB登记号43086)和ART12(NCIMB登记号43087)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART24(NCIMB登记号43088)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART4(NCIMB登记号43086)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART12(NCIMB 登记号43087)。

在一些实施方式中，细菌菌株是冻干的。在一些实施方式中，所述细菌菌株呈孢子的形式。

在一些实施方式中，所述感染包括以下中的一者或多种：腹痛、流感样症状、胃痉挛、腹泻和恶心。在一些实施方式中，肠内施用所述药物组合物。在一些实施方式中，所述用途还包括向所述对象分别、依次或同时施用一种或多种抗生素。在一些实施方式中，所述一种或多种抗生素包括以下中的一者或多者：甲硝哒唑、万古霉素和硝唑尼特。

在一方面，本公开提供了用于治疗或预防有需要的对象中的副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种细菌菌株：ART24(NCIMB登记号43088)、ART4(NCIMB登记号43086)和 ART12(NCIMB登记号43087)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART24(NCIMB 登记号43088)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART4(NCIMB登记号43086)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART12(NCIMB登记号43087)。

在一些实施方式中，细菌菌株是冻干的。在一些实施方式中，所述细菌菌株呈孢子的形式。

在一些实施方式中，对象是鱼或甲壳动物。在一些实施方式中，所述鱼或甲壳动物在水产养殖环境中。在一些实施方式中，所述施用包括向所述水产养殖环境提供所述组合物。在一些实施方式中，所述组合物被配制为鱼饲料或鱼饲料添加剂。在一些实施方式中，所述组合物被配制为浴处理剂。在一些实施方式中，肠内施用所述药物组合物。

在一些实施方式中，所述方法还包括向所述对象分别、依次或同时施用一种或多种抗生素。在一些实施方式中，所述一种或多种抗生素包括以下中的一者或多者：甲硝哒唑、万古霉素和硝唑尼特。

在一方面，本公开提供了组合物在制备用于治疗或预防有需要的对象中的副溶血性弧菌感染的药物中的用途，其中，所述组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种细菌菌株：ART24(NCIMB登记号43088)、ART4(NCIMB登记号43086)和ART12(NCIMB登记号43087)。在一些实施方式中，细菌菌株是 ART24(NCIMB登记号43088)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART4(NCIMB 登记号43086)。在一些实施方式中，细菌菌株是ART12(NCIMB登记号43087)。

在一些实施方式中，细菌菌株是冻干的。在一些实施方式中，所述细菌菌株呈孢子的形式。

在一些实施方式中，所述对象是鱼或甲壳动物。在一些实施方式中，所述鱼或甲壳动物在水产养殖环境中。在一些实施方式中，所述施用包括向所述水产养殖环境提供所述组合物。在一些实施方式中，所述组合物被配制为鱼饲料或鱼饲料添加剂。在一些实施方式中，所述组合物被配制为浴处理剂。

在一些实施方式中，肠内施用所述药物组合物。在一些实施方式中，所述用途还包括向所述对象分别、依次或同时施用一种或多种抗生素。在一些实施方式中，所述一种或多种抗生素包括以下中的一者或多者：甲硝哒唑、万古霉素和硝唑尼特。

附图说明

图1A至图1B是显示解淀粉芽孢杆菌菌株ART12、ART24和ART4的培养物上清液的直接抗艰难梭菌特性的照片。图1A所示的孔扩散试验显示了来自菌株ART12、ART24和ART4的每个培养物上清液的大的抗艰难梭菌活性的区域。图1B显示了来自菌株ART4、ART12和ART24的24小时、48小时和72 小时培养物上清液的抗艰难梭菌活性的区域。

图2A至图2B显示了孔扩散试验，证明了本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株对消化蛋白酶具有抗性。图2A显示了ART24上清液的抗艰难梭菌活性对胃蛋白酶和胰蛋白酶引起的失活具有抗性。图2B显示了ART4上清液的抗艰难梭菌活性对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K引起的失活具有抗性。

图3A至图3C是培养物ART24(图3A)、ART4(图3B)和DSM7

图4A显示了使用艰难梭菌作为指示剂的孔扩散试验，其中将蛋白酶 -K(Prok)直接(中心孔)或邻近(右手孔)加入到含有ART24培养物上清液的孔中。图4B是一组MALDI-TOFMS色谱图，显示了即使在Prok存在下失去环状细菌素峰时也保持了ART24抗艰难梭菌活性。

图5A是显示ART24和艰难梭菌共培养24小时的结果的图。在暴露于 ART24时，艰难梭菌生长下降大于2log。图5B是显示在T3h和T6h将10×ART24 接种到正在进行的艰难梭菌培养物中24小时导致每个OD读数的艰难梭菌生长减少的图。

图6A显示了孔扩散试验，证明了ART4、ART12和ART24菌株的培养物上清液针对几种不同的艰难梭菌临床分离物的活性。图6B显示了孔扩散试验，证明了ART24的培养物上清液针对28种同时期的艰难梭菌临床分离物的抗艰难梭菌活性。

图7A显示了(从左至右的上图)：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)；以及(从左至右的下图)：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和艰难梭菌的孔扩散试验，比较了ART4(“A4”)、ART12(“12Aer 1”)和ART24(“024(2)”)针对每种的活性。该试验显示了24h和48h的ART4、ART12和ART24培养物上清液的比较。图7B是显示qPCR分析的图。加入到体外人结肠微生物群样品中的新鲜 ART 24菌株保留了所研究的人结肠门，即变形菌门、后壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门和乳杆菌属(Lactobaccilus)。

图8A显示了用于评估本技术的解淀粉芽孢杆菌(B.amy)菌株的体内功效的说明性设计。图8B是显示用重悬浮于PBS中的ART24营养细胞(“B amy PBS”)、重悬浮于用过的培养基中的ART24营养细胞(“B amy QD”)、万古霉素或PBS(“媒介物”)每日处理之后表现出异常临床体征的艰难梭菌感染小鼠的百分比的图。图 8C是显示每个处理组从第0天开始的重量变化百分比的图。图8D是显示从“B. amy PBS”组的第0天开始的重量变化百分比和每天统计分析的图。*p<0.05； **p<0.01；多重比较的双向方差分析。图8E是Kaplan-Meier存活率曲线，显示了每个处理组中艰难梭菌感染后的存活率百分比。

图9A显示了孔扩散试验，证明了ART12、ART24和ART4对产气荚膜梭菌的7种临床分离物的抑制作用。

图9B至图9E是培养物DSM7

图9F显示了抗单核细胞增多性李斯特菌孔扩散试验，证明了ART4、ART12和ART24针对单核细胞增多性李斯特菌的单一菌株的抑制作用。

图10A是显示模拟胃液(pH3)对解淀粉芽孢杆菌孢子的影响的图。

图10B是显示在冷冻干燥前和后(冻干前和后)的ART4、ART12和ART24 孢子的稳定性的图。

图11A是显示通过复溶冻干的ART24(批号CO-33-8A1)切割检测艰难梭菌毒素A的蛋白质印迹。

图11B是显示通过复溶冻干的ART24(批号CO-33-8A1)切割检测艰难梭菌毒素B的蛋白质印迹。

图11C是显示1x10

图12是孔扩散试验，其显示来自菌株ART4、ART12和ART24的每个培养物上清液的抗副溶血性弧菌活性的区域。

具体实施方式

应理解，本技术的某些方面、模式、实施方式、变化和特征将在下面以各种水平的细节进行描述，以便提供对本技术的实质理解。下面提供了本说明书中使用的某些术语的定义。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

I.定义

在本文中使用以下术语，其定义被提供用于指导。

如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”表示单数和复数，除非明确地陈述仅表示单数。

术语“约”和范围的使用(无论是否被术语“约”限定)通常意指所包括的数值不限于本文阐述的确切数值，并且旨在是指基本上在所引用的范围内的范围，而不脱离本发明的范围。如本文所用，“约”将被本领域普通技术人员理解，并且将根据其使用的上下文在某种程度上变化。如果在给定使用上下文的情况下存在对本领域普通技术人员而言不清楚的术语的使用，则“约”将意指特定术语的至多加或减10％。

如本文所用，将本技术的药剂、药物、细菌菌株或其孢子、或组合物“施用”至对象包括向对象引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径进行施用，包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹腔内或皮下)、局部或通过吸入。在一些实施方式中，本技术的组合物被配制用于肠内施用。在一些实施方式中，所述组合物被配制用于口服递送、舌下递送或直肠递送。在一些实施方式中，所述组合物被配制用作益生菌。在一些实施方式中，所述组合物被配制成用作活的生物治疗剂。如本文所用，施用包括自我施用和通过另一个人施用。

如本文所用，“ART24”或“ART024(2)”或“024(2)”是指以NCIMB登记号 43088保藏的细菌菌株或其孢子、或者包含所述菌株的组合物。

如本文所用，“ART4”或“A4”是指以NCIMB登记号43086保藏的细菌菌株或其孢子、或者包含所述菌株的组合物。

如本文所用，“ART12”或“12Aer 1”是指以NCIMB登记号43087保藏的细菌菌株或其孢子、或者包含所述菌株的组合物。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”和“药学有效量”是指足以实现期望的治疗效果和/或预防效果的量，例如，导致预防疾病、病况和/或其一种或多种症状的量。在治疗应用或预防应用的上下文中，施用至对象的组合物的量将取决于疾病的类型和严重程度以及对象的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对组合物药物的耐受性。它还将取决于疾病或病况的程度、严重程度和类型。本领域技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当的剂量。在一些实施方式中，施用多剂量。另外地或替选地，在一些实施方式中，施用多种治疗组合物或化合物(例如，包含单独的多种细菌菌株或与另外的活性剂(里如抗生素或抗毒素B单克隆抗体)组合的药物组合物)。在本文所述的方法中，可以将包含本技术的细菌菌株或其孢子的组合物施用至具有艰难梭菌感染(CDI)或艰难梭菌相关性疾病(CDAD)的一种或多种体征、症状或风险因素(包括但不限于腹泻、体重减轻、食欲丧失、腹胀、流感样症状、发热、腹痛、恶心、脱水、结肠炎和伪膜性结肠炎)的对象。例如，本技术的组合物的“治疗有效量”包括CDI 或CDAD的一种或多种体征、症状或风险因素的存在、频率或严重程度至少得到改善的水平。在一些实施方式中，治疗有效量降低或改善CDI或CDAD的生理作用，和/或CDI或CDAD的风险因素，和/或发展CDI或CDAD的可能性。在一些实施方式中，通过多次施用实现治疗有效量。在一些实施方式中，通过单次施用实现治疗有效量。

如本文所用，术语“冷冻干燥的”或“冷冻干燥”和“冻干的”或“冻干”可互换使用，并且是指在产品冷冻并放置在真空下之后从产品中去除水以及由其生产产品的方法。

如本文所用，“药学上可接受的载体和/或稀释剂”或“药学上可接受的赋形剂”包括但不限于溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括多糖、槐树豆胶、阴离子多糖、淀粉、蛋白质、抗坏血酸钠、谷胱甘肽、海藻糖、蔗糖或果胶。在一些实施方式中，所述多糖包括植物多糖、动物多糖、藻类多糖或微生物多糖。在一些实施方式中，所述多糖包括瓜尔胶、菊粉、直链淀粉、壳聚糖、硫酸软骨素、藻酸盐或葡聚糖。在一些实施方式中，淀粉包括大米淀粉。这种介质和试剂用于生物活性物质的用途在本领域是众所周知的。下面提供了赋形剂的进一步细节。补充的活性成分(诸如抗微生物剂，例如抗真菌剂)也可以掺入到组合物中。

如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”是指当施用于动物或人时不产生不利的、变应性的或其它不良反应的物质和组合物。如本文所用，该术语包括不与本发明的治疗物质以不适当的负面方式反应的所有惰性的无毒液体或固体填充剂或稀释剂，溶剂，分散介质，包衣，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂，保存剂等，例如液体药物载体，例如无菌水、盐水、糖溶液、Tris缓冲液、乙醇和/或某些油。

如本文所用，“益生菌”是指以下细菌：其包含施用以赋予对象有益的预防和/或治疗效果的所述对象的瞬时或内源性菌群的组分。本领域技术人员通常已知益生菌是安全的。尽管不希望受任何特定机制的束缚，但本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株的预防和/或治疗效果可能是由于产生了具有抗微生物活性的细胞外产物而导致致病性细菌生长的抑制。在一些实施方式中，“益生菌”包括“活的生物治疗产品”。

如本文所用，病症或病况的“预防(prevention)”、“预防(prevent)”或“预防(preventing)”是指，在统计样品中，相对于未处理的对照，处理的对象/样品中病症或病况的发生或复发的减少，或者相对于未处理的对照，延迟病症或病状的一种或多种症状的发作。

如本文所用，“对象”和“患者”可互换使用。在一些实施方式中，对象是动物对象。在一些实施方式中，动物对象是哺乳动物。在一些实施方式中，哺乳动物对象是人。在一些实施方式中，动物对象是鱼或甲壳动物。在一些实施方式中，鱼或甲壳动物在水产养殖环境中。

如本文所用，术语“同时”施用是指通过相同途径并且同时或基本上同时施用至少两种药剂。

如本文所用，术语“分开”施用是指通过不同途径同时或基本上同时施用至少两种药剂。

如本文所用，术语“依次”施用是指在不同时间施用至少两种药剂，施用途径是相同或不同的。更具体地，依次使用是指在开始施用一种药剂之前，整体施用另一种或多种药剂。因此，可以在施用一种药剂之前几分钟、几小时或几天内施用另一种药剂。

“协同治疗效果”是指大于累加的治疗效果，其由至少两种治疗剂的组合产生并且超过由药剂的单独施用产生的治疗效果。例如，将本技术的细菌菌株与用于治疗CDI或CDAD的其它药剂结合使用可导致大于累加的治疗效果。在一些实施方式中，协同作用可以允许使用比各自单独使用时所需的更低剂量的本技术的细菌菌株和/或其它试剂。

疾病或病症的“治疗(treating)”、“治疗(treat)”、“治疗(treated)”或“治疗(treatment)”包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发展；(ii)减轻疾病或病症，即，引起其消退；(iii)减缓所述病症的进展；和/或(iv)抑制、减轻或减缓所述疾病或病症的一种或多种症状的进展。

应理解，治疗或预防所述医学疾病和病况的各种模式旨在意指“实质的”，其不仅包括全部，而且也少于全部的治疗或预防，并且其中获得了一些生物学或医学上相关的结果。

II.艰难梭菌感染(CDI)

艰难梭菌感染(CDI)或艰难梭菌相关性疾病(CDAD)是由厌氧的形成孢子的革兰氏阳性细菌(艰难梭菌)引起的症状感染。CDI的症状包括水样腹泻、发热、恶心和腹痛。CDI占抗生素相关性腹泻(AAD)病例的约20％。CDI的并发症可以包括假膜性结肠炎、中毒性巨结肠、结肠穿孔以及败血症和死亡。

CDI通过细菌孢子传播。孢子对多种类型的消毒剂具有抗性，并且可以在污染的表面(包括食品表面)上持续数月。CDI的风险因素包括抗生素或质子泵抑制剂的使用、住院治疗和高龄。在健康个体中，艰难梭菌的生长通过胃肠道中存在的正常微生物群来限制。使用降低胃酸度的广谱抗生素和药物(例如质子泵抑制剂)，可以允许艰难梭菌增殖以及促进感染。在结肠中，艰难梭菌产生肠毒素(毒素A)和细胞毒素(毒素B)。毒素刺激炎性介质的产生，所述炎性介质增加肠壁渗透性，导致腹泻，并引起结肠上皮细胞的降解。CDI的诊断通过粪便培养或者检测细菌DNA或毒素的存在。

在一些实施方式中，本技术提供了用于治疗或预防艰难梭菌感染的方法和组合物，其包括降低与艰难梭菌感染相关的一种或多种风险因素、体征或症状的严重程度。在一些实施方式中，所述组合物包含新的解淀粉芽孢杆菌菌株 ART24、ART4和ART1或其孢子。

III.产气荚膜梭菌感染

产气荚膜梭菌是一种经常存在于自然界中的革兰氏阳性的、厌氧的、形成孢子的致病细菌，并且存在于土壤、腐烂的植被、海洋沉积物和人胃肠道中。产气荚膜梭菌是美国食源性疾病最常见的原因之一。产气荚膜梭菌感染的症状可以包括腹痛、胃痉挛、腹泻和恶心。c型产气荚膜梭菌中毒可以导致坏死性肠炎(也称为pigbel综合征)。这种综合征可以导致肠细胞的死亡，并且通常是致命的。

在一些实施方式中，本技术提供了用于治疗或预防产气荚膜梭菌感染的方法和组合物，其包括降低与产气荚膜梭菌感染相关的一种或多种风险因素、体征或症状的严重程度。在一些实施方式中，所述组合物包含新的解淀粉芽孢杆菌菌株ART24、ART4和ART12或其孢子。

IV.单核细胞增多性李斯特菌感染(李氏杆菌病)

单核细胞增多性李斯特菌是在宿主细胞中生长和繁殖的革兰氏阳性兼性厌氧致病细菌。单核细胞增多性李斯特菌的侵袭性感染引起李氏杆菌病，通过摄入污染的食品(例如未经高温消毒的乳制品或生食)来传播。李斯特菌由于其在低至0℃的冷藏温度下繁殖和生长的能力而可以避开人类食品中的控制，并且是最具毒性的食源性致病菌之一。在美国每年有估计1600人发展李氏杆菌病，并且约260人死于感染。感染最可能使孕妇和她们的新生儿、65岁以上的成年人以及免疫系统减弱的人患病。在高危个体中，感染在20％至30％的病例中是致命的。感染可限于胃肠道或可侵入脑、脊柱膜或血流。在孕妇中，感染可以导致流产、死产、威胁生命的感染的新生儿的早产。

在一些实施方式中，本技术提供了用于治疗或预防单核细胞增多性李斯特菌感染的方法和组合物，其包括降低与单核细胞增多性李斯特菌感染相关的一种或多种风险因素、体征或症状的严重程度。在一些实施方式中，所述组合物包含新的解淀粉芽孢杆菌菌株ART24、ART4和ART12或其孢子。

V.副溶血性弧菌感染(弧菌病)

副溶血性弧菌是一种能够威胁人和水产养殖动物健康的水生人畜共患剂。副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐细菌，其分布广，并且天然存在于海洋和河口环境中。环境因子影响其生长，当水温暖时，其数量最多。通过摄入污染的海鲜或通过暴露于海水中的开放伤口来获得人的副溶血性弧菌感染。副溶血性弧菌与散发的感染和肠胃炎的爆发有关。副溶血性弧菌是在食用未加工的、未煮熟的或错误处理的海产品后的人急性肠胃炎的主要致病因子。最常与副溶血性弧菌感染相关的临床特征包括水样腹泻、腹部绞痛、恶心和呕吐；伤口感染和败血症的发生较少见。通过从临床样本(包括血液、粪便和伤口样品)中分离有机体进行实验室诊断。几乎所有食源性副溶血性弧菌感染的病例都与最近的海鲜食用史相关。副溶血性弧菌在人类疾病中产生几种毒素，例如耐热直接溶血素(TDH)、TDH相关溶血素(TRH)和热不稳定溶血素(TLH)。

水产养殖动物中的副溶血性弧菌感染可以导致重大的经济损失。在其中弧菌病可以导致急性肝胰腺坏死病(AHPND)或早期死亡综合征(EMS)的虾培养物中、以及在其中感染可以导致鳍、眼睛和腹面出血并且具有非常高的死亡率的鲑鱼培养物中，感染是特别有害的。由PirA^vp和PirB^vp 组成的Photorabdus昆虫相关(Pir)毒素是与虾中的AHPND相关的毒素。抗生素抗性使得使用抗生素治疗副溶血性弧菌感染成为挑战，并且需要开发替代疗法来控制水产养殖中的副溶血性弧菌感染。

在一些实施方式中，本技术提供了用于治疗或预防副溶血性弧菌感染的方法和组合物，其包括降低与副溶血性弧菌感染相关的一种或多种风险因素、体征或症状的严重程度。在一些实施方式中，所述组合物包含新的解淀粉芽孢杆菌菌株ART24、ART4和ART12或其孢子。在一些实施方式中，本技术提供了用于预防或治疗水产养殖中的副溶血性弧菌感染的包含新的解淀粉芽孢杆菌菌株ART24、ART4和ART12或其孢子的浴(浸入)处理剂。在一些实施方式中，本技术提供了用于预防或治疗水产养殖中的副溶血性弧菌感染的包含新的解淀粉芽孢杆菌菌株ART24、ART4和ART12或其孢子的鱼饲料或鱼饲料添加剂。 VI.本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株

本公开的技术涉及发现有效地治疗或预防艰难梭菌感染的几种解淀粉芽孢杆菌细菌菌株或其孢子。从人粪便样品中分离细菌菌株并分析其抗艰难梭菌活性。针对蛋白水解活性进行初级筛选，以及针对抗艰难梭菌活性进行二级筛选。纯化对艰难梭菌菌株显示出抗微生物活性的菌落并将其命名为“ART24”(或“ART024(2)”或“024(2)”)、“ART4”(或“A4”)和ART12(或“12Aer 1”)。ART24是指以NCIMB登记号43088为特征的细菌菌株或其孢子、或者包含该菌株的组合物。ART4是指以NCIMB登记号43086为特征的细菌菌株或其孢子、或者包含该菌株的组合物。ART12是指以NCIMB登记号43087为特征的细菌菌株或其孢子、或者包含该菌株的组合物。

在一些实施方式中，本技术的细菌菌株或其孢子用于治疗或预防艰难梭菌、产气荚膜梭菌或单核细胞增多性李斯特菌感染的方法和组合物中。在一些实施方式中，细菌菌株包含用于预防或控制艰难梭菌、产气荚膜梭菌或单核细胞增多性李斯特菌感染的益生菌。在一些实施方式中，本技术的组合物包含营养细菌细胞。在一些实施方式中，本技术的组合物包含细菌孢子。在一些实施方式中，本技术的组合物包含营养细菌细胞和细菌孢子的组合。

VII.治疗方法和预防方法

下面的讨论仅以示例的方式呈现，而不旨在是限制的。

本技术的一个方面包括治疗或预防被诊断患有、疑似患有或处于患有艰难梭菌感染(CDI)风险的对象中的CDI的方法。在治疗应用中，将包含选自由 ART24、ART4、ART12及其组合组成的组中的细菌菌株或其孢子的组合物或药物以足以治愈、或至少部分停止疾病的症状(包括其并发症和疾病发展中的中间病理表型)的量施用至疑似患有或已经患有这种疾病的对象(诸如，例如，表现出腹泻、体重减轻、食欲丧失、腹胀、流感样症状、发热、腹痛、恶心、脱水、结肠炎或伪膜性结肠炎的对象)。

患有CDI的对象可以通过本领域已知的任何诊断或预后测定或其组合来鉴定。例如，CDI的典型症状包括但不限于腹泻、体重减轻、食欲丧失、腹胀、流感样症状、发热、腹痛、恶心、脱水、结肠炎或伪膜性结肠炎。

在一些实施方式中，用本技术的细菌菌株或其孢子治疗的CDI对象将显示出以下症状中的一者或多者的改善或消除：腹泻、体重减轻、食欲丧失、腹胀、流感样症状、发热、腹痛、恶心、脱水、结肠炎或伪膜性结肠炎。

在一方面，本技术提供了用于预防或延迟处于患有CDI风险的对象中CDI 或CDI症状的发作的方法。在一些实施方式中，本技术的细菌菌株被配制为益生菌，其可用作食品补充剂并且用于在肠道中重建有益细菌。在一些实施方式中，本技术的细菌菌株被配制为可用于药物应用的活的生物治疗产品。

本技术的一个方面包括治疗或预防被诊断患有、疑似患有或处于患有产气荚膜梭菌感染风险的对象中的产气荚膜梭菌感染的方法。在治疗应用中，将包含选自由ART24、ART4和ART12组成的组中的细菌菌株或其孢子的组合物或药物以足以治愈、或至少部分停止疾病的症状(包括其并发症和疾病发展中的中间病理表型)的量施用至疑似患有或已经患有这种疾病的对象(诸如，例如，表现出腹泻、体重减轻、食欲丧失、腹胀、流感样症状、发热、腹痛、恶心、脱水、结肠炎或伪膜性结肠炎的对象)。

患有产气荚膜梭菌感染的对象可以通过本领域已知的任何诊断或预后测定或其组合来鉴定。例如，产气荚膜梭菌感染的典型症状包括但不限于腹泻、体重减轻、食欲丧失、腹胀、流感样症状、发热、腹痛、恶心、脱水、结肠炎或伪膜性结肠炎。

在一些实施方式中，用本技术的细菌菌株或其孢子治疗产气荚膜梭菌感染，其中对象显示出以下症状中的一者或多者的改善或消除：腹泻、体重减轻、食欲丧失、腹胀、流感样症状、发热、腹痛、恶心、脱水、结肠炎或伪膜性结肠炎。

在一方面，本技术提供了用于预防或延迟处于患有产气荚膜梭菌感染风险的对象中产气荚膜梭菌感染或产气荚膜梭菌感染症状的发作的方法。在一些实施方式中，本技术的细菌菌株被配制为益生菌，其可用作食品补充剂并且用于在肠道中重建有益细菌。在一些实施方式中，本技术的细菌菌株被配制为可用于药物应用的活的生物治疗产品。

本技术的一个方面包括治疗或预防被诊断患有、疑似患有或处于患有单核细胞增多性李斯特菌感染风险的对象中的单核细胞增多性李斯特菌感染的方法。在治疗应用中，将包含选自由ART24、ART4和ART12组成的组中的细菌菌株或其孢子的组合物或药物以足以治愈、或至少部分停止疾病的症状(包括其并发症和疾病发展中的中间病理表型)的量施用至疑似患有或已经患有这种疾病的对象(诸如，例如，表现出腹泻、体重减轻、食欲丧失、腹胀、流感样症状、发热、腹痛、恶心、脱水、结肠炎或伪膜性结肠炎的对象)。

患有单核细胞增多性李斯特菌感染的对象可以通过本领域已知的任何诊断或预后测定或其组合来鉴定。例如，单核细胞增多性李斯特菌的典型症状包括但不限于腹泻、体重减轻、食欲丧失、腹胀、流感样症状、发热、腹痛、恶心、脱水、结肠炎或伪膜性结肠炎。

在一些实施方式中，用本技术的细菌菌株或其孢子治疗单核细胞增多性李斯特菌感染，其中对象显示出以下症状中的一者或多者的改善或消除：腹泻、体重减轻、食欲丧失、腹胀、流感样症状、发热、腹痛、恶心、脱水、结肠炎或伪膜性结肠炎。

在一方面，本技术提供了用于预防或延迟处于患有产气荚膜梭菌感染风险的对象中产气荚膜梭菌感染或产气荚膜梭菌感染症状的发作的方法。在一些实施方式中，本技术的细菌菌株被配制为益生菌，其可用作食品补充剂并且用于在肠道中重建有益细菌。在一些实施方式中，本技术的细菌菌株被配制为可用于药物应用的活的生物治疗产品。

本技术的一个方面包括治疗或预防被诊断患有、疑似患有或处于患有副溶血性弧菌感染风险的对象中的副溶血性弧菌感染的方法。在治疗应用中，将包含选自由ART24、ART4和ART12组成的组中的细菌菌株或其孢子的组合物或药物以足以治愈、或至少部分停止疾病的症状(包括其并发症和疾病发展中的中间病理表型)的量施用至疑似患有或已经患有这种疾病的对象(诸如，例如，表现出肠胃炎、腹泻、腹部绞痛、恶心、呕吐或伤口感染的人对象；表现出急性肝胰腺坏死病(AHPND)或早期死亡综合征(EMS)的虾；或者表现出鳍、眼睛和腹面出血的鲑鱼)。

患有副溶血性弧菌感染的对象可以通过本领域已知的任何诊断或预后测定或其组合来鉴定。例如，副溶血性弧菌的典型症状包括但不限于在与污染的海鲜(例如污染的虾或鲑鱼)接触之后的水样腹泻、腹部绞痛、恶心、呕吐或伤口感染。

在一些实施方式中，用本技术的细菌菌株或其孢子治疗副溶血性弧菌感染，其中对象显示出与副溶血性弧菌感染相关的症状中的一者或多者的改善或消除。 VIII.施用模式和有效剂量

用于预防、改善或治疗艰难梭菌、产气荚膜梭菌、单核细胞增多性李斯特菌或副溶血性弧菌感染和/或降低与感染相关的一种或多种风险因素、体征或症状的严重程度的本技术的组合物包括以营养细胞和/或孢子的形式提供的根据本技术的活的益生菌解淀粉芽孢杆菌细菌。在一些实施方式中，细菌菌株是冻干的。本技术的组合物以有效量(即具有期望治疗效果的量)施用至对象。剂量和给药方案将取决于对象中的感染程度、所使用的特定解淀粉芽孢杆菌菌株的特征 (例如其治疗指数、对象和对象的病史)。可以在临床试验前和临床试验期间通过医师和临床医生熟悉的方法来确定有效量。

本技术的组合物可以被配制用于添加到食品中，或者直接用作食品补充剂。所述制剂还可以包括用于促进孢子萌发和/或细菌生长的其它益生菌剂或营养素。

本技术的组合物的其它组分可以包括选自由以下组成的组的保存剂：蔗糖、抗坏血酸钠和谷胱甘肽。在一些实施方式中，所述保存剂是选自由以下组成的组的冷冻保护剂：核苷酸、二糖、多元醇和多糖。在一些实施方式中，所述冷冻保护剂选自由以下组成的组：肌苷-5’-单磷酸(IMP)、鸟苷-5’-单磷酸(GMP)、腺苷-5’-单磷酸(AMP)、尿苷(uranosine)-5’-单磷酸(UMP)、胞苷-5’-单磷酸(CMP)、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟苷、尿苷、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、乳清苷、胸苷、肌苷、海藻糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、糊精、菊粉、抗坏血酸钠、谷胱甘肽、脱脂乳和冷冻保护剂18。

本文所述的解淀粉芽孢杆菌细菌菌株(即，ART24、ART4和ART12)可以掺入药物组合物中用于单独或组合施用，并给予对象以治疗或预防本文所述的病症。这种组合物通常包括活性剂和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。补充的活性化合物也可以掺入到组合物中。载体可以是用于粉末形式的制剂的基于固体的干燥材料，并且可以是用于液体或凝胶形式的制剂的基于液体或凝胶的材料，其形式部分取决于施用途径或模式。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括多糖、槐树豆胶、阴离子多糖、淀粉、蛋白、抗坏血酸钠、谷胱甘肽、海藻糖、蔗糖或果胶。在一些实施方式中，多糖包括植物多糖、动物多糖、藻类多糖或微生物多糖。在一些实施方式中，多糖包括瓜尔胶、菊粉、直链淀粉、壳聚糖、硫酸软骨素、藻酸盐或葡聚糖。在一些实施方式中，淀粉包括大米淀粉。

通常将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠内(例如，口服、舌下、直肠)施用。可以将治疗组合物配制成适于以多种方式口服施用：例如在液体、粉状食品补充剂、固体食品、包装食品、薄片、片剂、锭剂或胶囊(例如明胶胶囊)等。在一些实施方式中，本技术的治疗组合物包含冻干的ART4、ART12和/或ART24。在一些实施方式中，封装冻干的ART4、ART12 和/或ART24。可以将治疗组合物配制成适于以多种方式直肠施用：例如在栓剂、液体灌肠剂或泡沫中。其它制剂对于本领域技术人员将是明显的。可以用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节pH。

对于水产养殖应用，本技术的药物组合物可以配制成鱼饲料或鱼饲料添加剂或者浴(浸入)处理剂。

任何治疗剂的剂量、毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定。从细胞培养物测定和动物研究获得的数据可以用于配制一系列用于人的剂量。这种化合物的剂量可以在包括ED50的循环浓度范围内而具有很少毒性或没有毒性。剂量可以在该范围内变化，这取决于使用的剂型和使用的施用途径。对于方法中使用的任何化合物，可以最初由细胞培养物测定来估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以实现循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养物中测定的IC50(即，实现症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)。这种信息可以用于准确地确定人中的有用剂量。

在一些实施方式中，本技术的组合物在1克剂量制剂中含有10

示例性的治疗方案需要每天一次或每周一次施用。在治疗应用中，有时需要以相对短的间隔使用相对高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，或者直到对象显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向对象施用预防方案。在一些实施方式中，将本技术的组合物每天一次、两次或三次施用至对象，持续10 天至14天，或者直到认为治愈对象的原发性疾病，不会处于复发原发性疾病的风险中，或者不会处于感染疾病的风险中。在一些实施方式中，施用与本领域已知的用于治疗CDI的试剂(例如抗生素，包括但不限于万古霉素、甲硝哒唑或非达霉素)的缩短暴露配对，随后每日给药一次、两次或三次，持续10天至14 天，或者直到认为治愈患者的原发疾病，或不会处于疾病复发的风险中。在一些实施方式中，预防方法包括每日一次、两次或三次施用本技术的组合物，持续10天至14天，或者在已知患者处于CDI风险中(例如PPI使用或免疫抑制) 的情况下，直到认为患者不会处于感染所述疾病的风险中。

本领域技术人员将理解，某些因素可影响有效治疗对象所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、对象的一般健康状况和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的本文所述的治疗组合物治疗对象可以包括单次治疗或一系列治疗。

IX.用本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株的组合疗法

在一些实施方式中，本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株或其孢子可以与一种或多种另外的疗法组合用于预防或治疗CDI。另外的治疗剂包括但不限于选自由以下组成的组的一种或多种另外的治疗剂：甲硝哒唑、非达霉素、万古霉素、硝唑尼特、排泄物微生物群移植和抗毒素B单克隆抗体。

在一些实施方式中，将另外的治疗剂与本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株或其孢子组合施用至对象，从而产生协同治疗效果。例如，将ART24、ART4和/或 ART12与用于预防或治疗CDI的一种或多种另外的治疗剂一起施用将在疾病的预防或治疗中具有大于累加的效果。

在任何情况下，多种治疗剂可以以任何顺序或甚至同时施用。如果同时使用，则多种治疗剂可以以单一、统一的形式或以多种形式(仅作为实例，作为单个丸剂或作为两个单独的丸剂)提供。治疗剂中的一者可以以多剂量给予，或者两者可以以多剂量给予。此外，组合方法、组合物和制剂不限于仅使用两种药剂

实施例

以下实施例仅以说明的方式提供，而不是以限制的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本上相同或相似的结果。实施例决不应被解释为限制本技术的范围，如由所附权利要求限定的。对于以下实施例中的每一者，可以使用本文所述的任何细菌菌株。作为实例，以下实施例中使用的细菌菌株可以是ART24、ART4、ART12或其组合。

人粪便样品。从以下年龄范围内的男性和女性对象(N＝22人)收集粪便样品：20至39岁(N＝14人)；40至59岁(N＝3人)；60至79岁(N＝4人)以及80 至99岁(N＝1人)。在实验室中接收粪便样品并在排泄物排空后8至12h内新鲜处理。在分析当天，使用最大修复稀释液(MRD)(CM0733，Oxoid)制备浆料。将这些浆料与等体积的乙醇混合2小时，之后将样品在MRD中连续稀释并铺板到脑心浸液(BHI)(1.10493.0500，Merck)琼脂板的表面上。然后将这些板有氧孵育 24h。

抗艰难梭菌菌株的鉴定(孔扩散试验(WDA))。从样品中分离细菌菌株并分析其抗艰难梭菌活性。然后用已经用艰难梭菌接种的强化梭菌培养基(RCM)(1.015410.0500Merck)稀琼脂(sloppy agar)覆盖具有来自粪便样品的连续稀释的细菌菌落的BHI琼脂平板。潜在的抗艰难梭菌菌落通过存在围绕细菌菌落的抑制区域来鉴定。将艰难梭菌以1％(v/v)接种到RCM琼脂中，并使平板变硬。使用无菌巴斯德移液管在硬化的琼脂板中制作孔。从覆盖板中分离潜在的抗艰难梭菌细菌菌株并重新划线以确保纯菌落。将潜在的抗艰难梭菌细菌菌株在BHI 肉汤中在200rpm振荡下有氧生长，并在37℃下孵育。将细菌菌株的过夜培养物离心，中和上清液pH，并用0.22μm过滤器过滤灭菌，以确保无细胞上清液 (CFS)。将50微升的细菌CFS厌氧地分配到RCM板的孔中，并使板孵育24h。通过检查是否存在围绕孔的抑制区域来评估抗艰难梭菌活性。将针对覆盖的艰难梭菌菌株显示出抗微生物活性的菌落纯化，储存在-80°并命名为ART24、ART4 和ART12(在本文中也分别命名为“ART024(2)”、“ART04-A4”和“ART012-Aer1”)。

在37℃下，使分离的菌株在脑心浸液(BHI)肉汤上(以200rpm振荡)和/或在琼脂上静止而有氧生长24h。

使用通用的16S rRNA引物的物种水平的基因型表征和鉴定。基于16S rRNA基因测序的结果，ART24、ART4和ART12各自被鉴定为解淀粉芽孢杆菌种的成员。使用从每个菌株的全基因组序列中鉴定的DNA促旋酶亚基A(gyrA) 的DNA序列，ART24、ART4和ART12被进一步鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)/解淀粉芽孢杆菌植物亚种和可操作组解淀粉芽孢杆菌成员。

将菌株的甘油(G5516，Sigma)储备液储存在-80℃(将在BHI肉汤中生长的 800μL培养物加入到200μL 100％甘油中)。

本实施例证明了本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株表现出有效的抗艰难梭菌活性(图1A和图1B)。

细菌菌株。使用上述的孔扩散试验(WDA)方法，针对艰难梭菌的临床分离物测试三个候选物ART24、ART4、ART12中的每一者的制备的上清液。图1A 和图1B显示了针对该菌株获得的大的活性区域。

因此，这些结果显示本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株可用于抑制艰难梭菌生长的方法中。

本实施例证明了本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株对消化蛋白酶(例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶-K)不敏感。

为了测试ART24上清液对胃蛋白酶和胰蛋白酶的敏感性(不敏感性)，针对艰难梭菌进行WDA，由此将每种蛋白酶的制备物单独地直接加入到上清液中或邻近上清液，并在37℃下厌氧孵育24小时。如图2A所示，与未处理的对照相比，区域大小没有降低，因此，总的来说，来自ART24培养物的上清液表现出的抗艰难梭菌生物活性对蛋白酶不敏感。

为了测试ART4上清液对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K的敏感性(不敏感性)，针对艰难梭菌进行WDA，由此将每种蛋白酶的制备物单独地加入到邻近上清液，并在37℃下厌氧孵育24小时。如图2B所示，与未处理的对照相比，区域大小没有降低，因此，总的来说，来自ART4培养物的上清液表现出的抗艰难梭菌生物活性对蛋白酶不敏感。

如图2A和图2B所示，所测试的消化酶对来自ART24或ART4的上清液均没有抑制作用。因此，这些结果显示包含本技术的细菌菌株的药物组合物在口服施用后将保持它们的抗艰难梭菌活性。

本实施例证明了本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株产生了环状细菌素(对革兰氏阳性细菌(例如艰难梭菌)具有作用的细菌素)。

如图3A和图3B所示，对ART24和ART4的培养物上清液的质谱(MS)分析显示分别在m/z 6,382.17和6,381.34处存在环状细菌素。然而，在DSM7

简而言之，将150mL培养物上清液离心，将细胞与70％丙-2-醇0.1％ TFA(IPA)混合，将上清液应用到含有30g XAD的柱上，用250mL 30％乙醇洗涤并用IPA洗脱抗微生物活性。使细胞和SN XAD样品通过用甲醇和水预平衡的 5g、20mL C18 SPE柱。用15％乙醇洗涤柱并在70％2-丙-2-醇0.1％TFA中洗脱抗微生物活性。将IPA洗脱液浓缩，并将1mL(3mL中的)应用到运行27.5％至 85％乙腈0.1％TFA梯度的半制备型C12 Proteo Jupiter(10x250mm，4μ，

然后在WDA中针对艰难梭菌测试在HPLC运行期间产生的级分，以鉴定抗艰难梭菌活性的区域。然后在MALDI-TOF质谱仪上分析WDA中可见的活性级分以鉴定活性组分。ART24和ART4的上清液的质谱表明，环状细菌素和制磷脂菌素是上清液中潜在的抗艰难梭菌组分(图3A；图3B；图9C；图9E)。

因此，这些结果显示本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株产生了具有抗艰难梭菌效果的环状细菌素，如图3A和图3B的孔扩散试验(WDA)所示。

本实施例证明了本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株的无细胞上清液对降解环状细菌素的蛋白酶-K(Prok)不敏感。

如图4A所示，从ART24培养物收集的上清液在Prok存在下具有活性，表明环状细菌素不是该菌株产生的唯一抗艰难梭菌微生物剂。

简而言之，使用艰难梭菌作为指示剂进行WDA，由此当与未处理的对照相比时，将蛋白酶K直接加入或加入到邻近的孔中而没有任何区域尺寸的降低或抑制。质谱分析显示当在蛋白酶K存在下失去环状细菌素峰时，保持了抗艰难梭菌活性(图4B)。

如表1所示，基于在抗SMASH(antibiotics&Secondary Metabolite AnalysisShell)数据库中进行的搜索，本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株(ART4、ART12和 ART24)的基因组序列预测了相对于抗艰难梭菌阴性菌株DSM7

将ART4、ART12和ART24的全基因组序列的GenBank文件上传到具有选择的默认特征的抗SMASH数据库中，然后将芽孢杆菌(Bacillus)基因组中的抗微生物区域与已知的抗微生物簇进行比较。

因此，这些结果显示本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株具有不同范围的抗微生物活性。

如图5A所示，以相同水平接种的ART24和艰难梭菌共培养24小时导致艰难梭菌计数减少4.1log。

简而言之，将解淀粉芽孢杆菌ART24和艰难梭菌的18小时培养物的100μL 等分试样共接种，分别接种到预处理的10mL BHI肉汤中，并在37℃下厌氧孵育24小时。艰难梭菌计数通过在Brazier CCEY琼脂(LAB160，Lab M)上铺板实现，并允许在37℃下厌氧孵育48小时。当比较在24小时单独接种的艰难梭菌的计数和与解淀粉芽孢杆菌ART24共培养24小时所实现的计数时，观察到减少4.1log。如果表示为在T0时的艰难梭菌数量的减少，则与解淀粉芽孢杆菌 ART24的共培养刚好减少小于2log。

如图5B所示，将10x ART24接种到正在进行的艰难梭菌(在T3h和T6h 的培养物)中24小时，导致每个OD读数的艰难梭菌生长减少。

细菌菌株。使用上述厌氧共培养方法，与未暴露的对照培养物相比，将10:1 比率的ART024加入到进入对数期的艰难梭菌培养物中(初始艰难梭菌接种后 T3h)导致艰难梭菌生长抑制。

细菌菌株。使用上述厌氧共培养方法，与未暴露的对照培养物相比，将10:1 比率的ART024加入到进入对数期的艰难梭菌培养物中(艰难梭菌接种后T6h)导致艰难梭菌生长抑制。

因此，这些结果显示包含本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株的组合物可用于治疗或预防艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病(CDAD)的方法中。

如图6A和图6B所示，ART4、ART12和ART24的上清液针对具有一系列核糖体分型(DPC 6219、DPC 6220和DPC 6350(图6A)的一组几种不同的临床艰难梭菌分离物、以及ART24针对28种其它同时期的临床分离物(图6B；表2))显示出抗艰难梭菌活性。也证明了ART4、ART12和ART24针对艰难梭菌分离物EM304和APC43的活性(数据未示出)。

表2.艰难梭菌组(panel)

简而言之，孔扩散试验(WDA)用于检查解淀粉芽孢杆菌上清液(来自菌株和来自不同时间点)对临床艰难梭菌分离物的作用。将50微升上清液加入到包含用每种临床分离物接种的RCM琼脂(1％v/v)的孔中。

这些结果证明了包含本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株的组合物可用于治疗或预防艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病(CDAD)的方法中。

为了鉴定上清液的活性谱，将一组共生有机体(罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、头状葡萄球菌)和苏云金芽孢杆菌与艰难梭菌进行比较。孔扩散试验(WDA) 用于比较来自3种菌株以及来自各自的24h、48h培养物的上清液。将乳酸菌菌株接种到de Mann RogosaSharpe(MRS)(288130，Difco)琼脂中；将头状葡萄球菌和苏云金芽孢杆菌接种到BHI琼脂中；以及将艰难梭菌接种到RCM琼脂中，所有菌株以1％(v/v)接种。没有鉴定出针对罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和头状葡萄球菌的抑制区域。鉴定了所有菌株的抑制区域以及针对苏云金芽孢杆菌和艰难梭菌的培养时间点。

如图7A所示，来自ART4(“A4”)、ART12(“12Aer 1”)和ART24(“024(2)”) 菌株的上清液针对艰难梭菌和苏云金芽孢杆菌具有选择性活性，而针对测试的人共生体没有选择性活性。

如图7B所示，加入到体外人结肠微生物群样品中的新鲜ART24(“024(2)”) 菌株保留了所研究的主要的人结肠菌门，即变形菌门、后壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门和乳酸菌。

这些结果证明了包含本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株的组合物可用于选择性治疗或预防艰难梭菌感染或CDAD的方法中，而不耗损共生细菌群体。

如表3所示，本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株(例如ART4、ART12和ART24 菌株)在欧洲食品安全局(EFSA)指南内。所列抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC) 以μg/mL表示。在冻干的ART24批次CO-33-10A2和CO-33-12A2以及研究和主细胞库(Research and Master CellBanks)CO-33-ART24 BHI和CO-33-ART24 SYD上进行了按照EFSA测试推荐的另外的研究，这些结果示于表4中。

表3.解淀粉芽孢杆菌菌株在EFSA抗生素敏感性指南内

来自N＝6的平均结果。*在板中最低浓度的情况下无生长。

表4.解淀粉芽孢杆菌菌株(ART24)在EFSA抗生素敏感性指南内

简而言之，选择来自解淀粉芽孢杆菌的3至5个菌落的材料，并将其悬浮在4mL的MRD中以获得约1×10

在本技术的菌株中不存在抗生素抗性排除了抗生素抗性水平转移的风险。

此外，用KEGG，RAST SEED Viewer，IslandViewer 4以及与产生毒素的已知芽孢杆菌物种的ACT比较等进行的搜索没有显示出本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株的基因组中的任何毒力因子或致病岛。因此，这些结果证明了菌株的益生菌安全性，因为它们缺乏赋予对共生体和/或致病菌抗性的倾向。

本实施例证明了，如表5所示，本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株对高水平的甲硝哒唑(Met)具有抗性，但对非达霉素(FDX)完全敏感。

表5.解淀粉芽孢杆菌菌株对甲硝哒唑(Met)和非达霉素(FDX)的易感性

CLSI标准方法；均一式三份。FDX对抗临床分离的艰难梭菌的MIC(0.004μg/mL 至8μg/mL)。Met针对临床分离的艰难梭菌的MIC(0.02μg/mL至4μg/mL)。

简而言之，使用96孔板(Sarstedt)以一式三份进行最小抑制浓度测定。在 BHI肉汤(Merck)中，从每种抗生素的512μg/mL的初始浓度进行了两倍连续稀释。将过夜的靶标菌株传代培养并孵育至OD600nm为0.5，然后稀释，以得到 200μL的10

这些结果证明了包含单独的本技术的菌株或与抗生素(例如甲硝哒唑)组合的本技术的菌株的药物组合物可用于治疗或预防艰难梭菌感染或CDAD的方法中。

本实施例证明了本技术的菌株可用于组合物和方法中，其中，菌株是冷冻干燥的(或冻干的)。

2xSG孢子形成培养基：Difco营养肉汤16.0g/L；KCl，2.0g/L；MgSO

孢子制备方法：用来自解淀粉芽孢杆菌的新鲜菌落的细胞接种50ml BHI(1.10493.0500，Merck)培养基。在37℃下于烧瓶中有氧生长24小时，同时以 200rpm振荡(轨道平台摇床)。将1/200稀释到适当容器中的1L 2xSG培养基中，并在37℃下生长，同时以200rpm振荡。使用光学显微镜每天检查样品中的孢子。相衬显微术是理想的。在2至3天之后，大于90％的群体应已形成孢子。如果可能的话，在离心机中以9000rpm沉淀细胞20分钟，保持低温，另外对于少量，台式离心机就足够了。用冰冷的水洗涤并离心孢子2至3次以去除残留营养物并裂解剩余的营养细胞。将孢子沉淀重悬浮于10mg/ml溶菌酶溶液中，并在37℃下振荡孵育1小时。用冰冷的水洗涤并离心孢子4至6次以去除残留营养物并裂解剩余的营养细胞。在VirTis Advantage Wizard冷冻干燥器中历经 24小时冷冻干燥3ml孢子的等分试样，并在室温下储存在密封的冷冻干燥小瓶中以用于长期储存。

基于Infogest COST作用所概述的SGF制备模拟胃液，所述SGF含有 37.3g/L KCl、68g/L KH

如图10B和表6所示，本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株(例如，ART4、ART12 和ART24)的孢子在冷冻干燥和重悬浮之后达到100％的存活率。

为了测试细胞的稳健性，将菌株冷冻干燥。简而言之，根据本领域已知的方法使ART24、ART4和ART12的过夜培养物生长，并重悬浮于15％w/v海藻糖溶液中。进行细胞计数。

将培养物冷冻干燥22小时，之后将其重悬浮于等量体积的水中。进行细胞计数。表6显示了存活率结果。

表6.在冷冻干燥(冻干)之后解淀粉芽孢杆菌菌株的存活率

因此，这些结果证明了本技术的菌株可用于组合物和方法中，其中菌株是冷冻干燥的(或冻干的)。

本实施例将证明解淀粉芽孢杆菌菌株ART24在用于治疗和预防艰难梭菌感染或CDAD的方法中的体内功效。

图8A提供了用于评估本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株的体内功效的说明性设计。表7提供了在以下所述的研究中使用的组的描述。

表7.体内研究的一般设计

*将解淀粉芽孢杆菌培养物离心并重悬浮于用过的培养基中

#离心解淀粉芽孢杆菌培养物，除去尽可能多的上清液，重悬

浮于PBS中

解淀粉芽孢杆菌每天新鲜生长

艰难梭菌小鼠模型。如别处描述地制备艰难梭菌感染的小鼠模型(Chen,X 等人,Gastroenterology 135:1984-1992(2008))。

将小鼠(C57BL/6J雌性)前瞻性地分成4个处理组，每组15只动物(表7)，并且每笼饲养5只动物。

在艰难梭菌感染(研究第0天)前13天开始，小鼠在其饮用水中连续八天接受抗生素混合物。每3天更换一次抗生素混合物，提供新鲜制备的抗生素。抗生素混合物由1％葡萄糖、卡那霉素(0.5mg/mL)、庆大霉素(0.044mg/mL)、粘菌素(1062.5U/mL)、甲硝哒唑(0.269mg/mL)、环丙沙星(0.156mg/mL)、氨苄青霉素(0.1mg/mL)和万古霉素(0.056mg/mL)组成。在艰难梭菌感染前5天，去除抗菌水。将动物放置在干净的笼中并向小鼠提供无菌饮用水。在感染前3天，通过口服灌胃以10mL/kg的体积向小鼠施用10mg/kg克林霉素。

测试物品制备。将解淀粉芽孢杆菌在体外培养以准备体内测试并以-80℃甘油储备液储存。

将菌株从冷冻储备液(给药前3天)应用到TSA琼脂板上，并在37℃下培养过夜。将来自过夜平板培养物中的菌落重悬浮于50mL的BHI肉汤中，在37℃下孵育过夜，同时振荡。将过夜培养物在新鲜BHI肉汤(100mL)中以1:100稀释，在37℃下孵育16小时，同时振荡。然后将培养物以2,500RPM离心20分钟。去除上清液，并将沉淀重悬浮于总共10mL的用过的培养基中或总共10mL的无菌PBS中。给药的每天在TSA琼脂上进行制备的悬浮液的连续稀释和铺板以确认接种物浓度。

艰难梭菌制备。在感染前4天，从应用于TSA-II板的冷冻储备液培养艰难梭菌ATCC43255，并在37℃下厌氧孵育48小时。在48小时之后，将来自板的菌落重悬浮于SMB(孢子形成培养基肉汤)中，并将OD调节至在600nm波长下的0.2。将调节的细菌悬浮液以1:10稀释到新鲜的SM肉汤中，并在37℃下厌氧孵育48小时。在孵育48小时之后，将细菌悬浮液调节至OD为0.2，随后在盐水中稀释100倍以产生感染接种物。进行接种物的连续稀释以确定实际CFU输入。还进行接种物的孢子制备以确定接种物中孢子与营养细胞的比率。

感染建立。通过口服施用0.20mL制备的艰难梭菌细菌悬浮液感染所有60 只小鼠。在感染之后将动物放回其笼中。在研究的第0天(在动物接受第0天的解淀粉芽孢杆菌处理之后大约4小时)将接种物递送至动物。

测试物品(解淀粉芽孢杆菌)处理。在感染前一天，动物开始接受重悬浮于用过的培养基(“B amy QD”)或重悬浮于PBS(“B amy PBS”)的解淀粉芽孢杆菌细胞的处理。所有动物通过口服灌胃以0.2mL/小鼠的体积给药。对照小鼠接受 50mg/kg的万古霉素，给药速率为10mL/kg。如以上在测试材料制备中描述地每天新鲜制备给药材料。

观察。在整个研究过程中每天观察小鼠。从第-1天开始收集体重并持续直至研究终止(第10天)。还进行临床观察，在适当时记录不良观察。观察包括是否存在腹泻(湿尾)、嗜睡、驼背姿势、异常温度(触摸冷)、毛皮状况、脱水和死亡。

结果。如图8B所示，与“媒介物”(PBS)给药组相比，用重悬浮于PBS中的ART24细胞(“B amy PBS”)每天一次给药的小鼠表现出低得多的异常临床体征百分比。这是与万古霉素处理组相似的百分比。

如图8C所示，与媒介物处理组相比，用重悬浮于PBS(“B.amy PBS”)而非用过的培养基(“B.amy QD”)中的ART24细胞处理艰难梭菌感染的小鼠减少了艰难梭菌感染诱导的体重减轻。

图8D显示了B.amy PBS给药组中动物的平均重量和每天统计分析。 *p<0.05；**p<0.01；多重比较的双向方差分析。

如图8E所示，在B amy PBS给药组(14/15)和万古霉素处理组(15/15)中存活的动物比媒介物处理的组(11/15)或用重悬浮于用过的培养基中的解淀粉芽孢杆菌给药的组(“B amy QD”；12/15)中存活的动物多。

因此，这些结果证明了本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株可用于治疗和预防艰难梭菌感染或CDAD的方法中。

本实施例证明了本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株表现出抗产气荚膜梭菌和抗单核细胞增多性李斯特菌的活性。

将ART4、ART12和ART24菌株在BHI肉汤中、在200rpm振荡下有氧生长，并在37℃下孵育。将细菌菌株的过夜培养物离心，中和上清液pH，并用 0.22μm过滤器过滤灭菌，以确保无细胞的上清液(CFS)。将50微升的细菌CFS 厌氧地分配到RCM板的孔中，并使板孵育24h。通过检查是否存在围绕孔的抑制区域来评估抗产气荚膜梭菌和抗单核细胞增多性李斯特菌活性。

使用上述WDA方法，针对产气荚膜梭菌的7种临床分离物测试三个候选物ART24、ART4、ART12中每一者的制备的上清液。图9A显示了针对产气荚膜梭菌所获得的活性区域。

如图9B至图9E中所示，DSM7

如图9F所示，抗单核细胞增多性李斯特菌的孔扩散试验证明了ART4、 ART12和ART24针对单核细胞增多性李斯特菌的单一菌株的抑制作用。

因此，这些结果显示了本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株可用于抑制产气荚膜梭菌和单核细胞增多性李斯特菌生长的方法中，以及可用于治疗和预防产气荚膜梭菌感染和单核细胞增多性李斯特菌感染的方法中。

针对毒素A和B的活性

检查在脑心浸液(BHI)培养基中新鲜生长的ART24以及制备成异丙醇 (IPA)提取的上清液级分的沉淀细胞部分和在PBS中重构的ART24冻干粉(药物物质批号CO-33-8A1)针对艰难梭菌毒素A和B切割活性。使用标准化毒素A 和B抗体进行蛋白质印迹分析。

观察到来自新鲜生长的ART24和重构冻干的ART24制备物的pH中和的、 IPA提取的上清液引起艰难梭菌毒素A(图11A)和毒素B(图11B)的完全切割。毒素切割的量取决于重构的冻干的ART24 CFU的量。

液体共培养测定

将冻干的ART24的制备物加入到包含艰难梭菌营养细胞或艰难梭菌孢子的混合物的液体培养物中，并在补充有牛磺胆酸钠作为液体共培养物的BHI培养基中孵育24小时。ART24以1×10

如图11C所示，与培养开始时的计数相比，在24小时之后，在不存在ART24 的情况下培养的艰难梭菌样品显示出艰难梭菌CFU/mL增加>4log。相比之下，用ART24接种的培养物显示艰难梭菌计数下降>2log，低于测定的检测极限。艰难梭菌营养细胞和孢子计数在含有ART24的样品中无法定量/检测到。

总的来说，这些结果证明了本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株即使在加工(例如，洗涤、离心、与海藻糖/冷冻保护剂混合)和冻干之后仍保持其抗艰难梭菌活性。这些结果还证明了在冻干材料再水合之后存在抗艰难梭菌活性。因此，这些结果证明了本技术的冻干的解淀粉芽孢杆菌菌株可用于治疗或预防艰难梭菌感染或CDAD的方法中。

本实施例证明了本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株表现出抗副溶血性弧菌活性(图12)。

测试了ART4、ART12和ART24针对副溶血性弧菌DSM 10027(ATCC 17802、CIP 75.2、NCMB 1902、NCTC 10903、WDCM 00037)的抗微生物活性。在37℃下，将副溶血性弧菌在烧瓶中的LB+3％盐液体培养基中在170rpm振荡下生长过夜，然后以1％接种物加入到调温的(tempered)LB+3％盐琼脂中。使 LB+3％琼脂的板冷却，一旦冷却，使用移液管在琼脂中制作孔。将ART4、ART12 和ART24的时间24小时(T24)和时间48小时(T48)的无细胞上清液加入到孔中，将板在37℃孵育，然后检查区域形成。

图12示出的孔扩散试验显示出来自菌株ART4、ART12和ART24的每个培养物上清液的抗副溶血性弧菌活性的区域

因此，这些结果显示了本技术的解淀粉芽孢杆菌菌株可用于抑制副溶血性弧菌生长的方法中，以及可用于治疗副溶血性弧菌感染的方法中。