使用先天淋巴样细胞抑制小胶质细胞激活

本申请要求2018年7月16日提交的美国临时专利申请62/698545号的优先权，该申请的公开内容全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及抑制小胶质细胞激活的方法和组合物。具体地讲，本发明涉及通过施用II型先天淋巴样细胞或增加II型先天淋巴样细胞的数量或活性的药剂来抑制小胶质细胞激活或血脑屏障破坏的组合物和方法。

背景技术

顾名思义，先天淋巴样细胞(ILC)显示出先天性免疫和适应性免疫的特征。虽然ILC由共同的淋巴样前体产生并分化成类似于T辅助细胞的亚群，但是ILC不经历构成适应性免疫的受体多样性象征的基础的体细胞重组。因此，与常规T细胞不同，ILC2不是抗原特异性的，并且它们也缺乏鉴定其他淋巴细胞(包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞)的特异性谱系标记。基于ILC产生的细胞因子和调控ILC发育和功能的转录因子，ILC可分为三种类型(ILC1、ILC2、ILC3)(Spits等人,2013,Nat Rev Immunol.13(2):145-9)。

ILC2主要产生2型细胞因子，诸如白介素4(IL-4)、IL-5、IL-9和IL-13。作为先天细胞，它们主要响应于警报素(alarmin)—内源性损伤相关分子模式(DAMP)，诸如IL-25和IL-33(Neill等人,2010,Nature 464(7293):1367–1370)。激活的ILC2的亚群还可产生IL-10，这是一种抗炎性细胞因子(Seehus等人,2017,Nat Commun.12月1日；8(1):1900)。这一证据表明ILC2在免疫应答中具有不同的作用。小鼠哮喘模型已显示ILC2有助于嗜酸性炎症和高反应性，并且人类研究已揭示患有哮喘、变应性鼻炎、嗜酸性食管炎和特应性皮炎的患者中ILC2计数的增加(Doherty等人,J Allergy Clin Immunol.2017；139(5):1465–1467)。

ILC2是组织驻留的，并且最初显示被富集在粘膜、屏障和脂肪组织中。然而，最近才出乎意料地在外周和中枢神经系统(CNS、PNS)环境中检测到ILC2(Gadani等人,2017,JExp Med.214(2):285-296)。在CNS中，已经仅在病理学上检查了ILC，其中显示ILC2在脊髓损伤后作出应答，并且ILC3被揭示为脑膜的正常驻留者并且在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中表现出疾病诱导的积聚和激活(Hatfield和Brown,2015,Cell Immunol.297(2):69-79)。

CNS中的炎症据信在多种神经退行性疾病(包括例如帕金森病、阿尔茨海默病、朊病毒病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、亨廷顿病和HIV痴呆)中在导致神经元细胞死亡的途径中起着重要作用。炎症应答由激活的小胶质细胞介导，小胶质细胞是CNS的驻留免疫细胞，其通常对神经元损伤作出应答并通过吞噬作用去除受损的细胞。

神经炎症应答可有益于或有害于运动神经元存活。激活的小胶质细胞可释放神经毒性分子，诸如促炎性细胞因子(例如，肿瘤坏死因子α，TNFα)、一氧化氮和过氧化物(Chao等人,1992,J Immunol.149(8):2736-41)。这些神经毒性分子可损伤或杀死神经元，这可先于或加剧某些神经疾病。在许多研究中，已发现激活的小胶质细胞是脑病理学的标志。

影响CNS的许多疾病和生理学应激物也改变血脑屏障(BBB)的功能完整性。它们影响屏障选择性地限制物质从血液到脑的通道的能力。BBB破坏可导致疾病诸如抑郁症、焦虑症、脑雾和自身免疫性脑问题。

抑制小胶质细胞激活为减少与神经退行性疾病相关的炎症、预防或治疗与BBB破坏相关的疾病提供了有前景的治疗途径。已经提出了利用化合物来调节小胶质细胞激活的某些疗法(US 2011021413、WO 9945950、US 20120237482)；然而，已知这些化合物具有脱靶效应。另外，已提出干细胞疗法具有改变小胶质细胞激活的潜力(Giunti等人,2012,StemCells.30(9):2044-53；WO 2011106476)。这些疗法的长期效果尚不清楚，因为间充质干细胞的存活仅在体内几个月(Volkman和Offen,2017,Stem Cells,35(8):1867-1880)。

因此，仍然需要可治疗与激活的小胶质细胞相关的疾病诸如神经退行性疾病的有效治疗剂。

发明内容

本发明通过提供用于抑制有需要的受试者中的小胶质细胞激活的方法满足了这一需要。这些方法包括增加受试者中激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的数量和/或活性。

本发明人出乎意料地发现，增加脑膜ILC2的数量抑制小胶质细胞激活。本发明人还出乎意料地发现，可激活脑膜ILC2以产生IL-10，其介导对小胶质细胞激活的抑制。具体地讲，本发明人发现，ILC缺陷型小鼠表现出抑制解除的小胶质细胞炎症应答和增加的血脑屏障(BBB)通透性。随后的转录组分析出乎意料地揭示了脑膜ILC2为IL-10的供应者。因此，在脑膜移入过继传输的ILC2之后发生神经炎症表型的修正，有益效果被IL-10中和抗体或Il10

在一个总的方面，本发明涉及在有需要的受试者中抑制小胶质细胞激活或降低BBB通透性或增加BBB稳定性的方法。

在一个实施方案中，本申请提供了在有需要的受试者中抑制小胶质细胞激活的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的激活的ILC2。

在一个实施方案中，本申请提供了在有需要的受试者中降低BBB通透性或增加BBB稳定性的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的激活的ILC2。

在本申请的实施方案中，激活的ILC2通过使ILC2与至少一种选自IL-33、IL-25、IL-2和IL-7或它们的组合的细胞因子接触而被激活。

在本申请的其他实施方案中，细胞被基因修饰，优选地，与其他方面相同的未被修饰的细胞相比，细胞被基因修饰以增加IL-10产量。

在本申请的实施方案中，通过静脉内或鞘内施用向有需要的受试者施用治疗有效量的激活的ILC2。

在另一个实施方案中，本申请提供了在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活、降低BBB通透性或增加BBB稳定性的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的能够增加该受试者中激活的ILC2的数量的药剂，优选地该激活的ILC2为脑膜ILC2。

在另一个实施方案中，本申请提供了在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活、降低BBB通透性或增加BBB稳定性的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的能够增加受试者中激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的IL-10产量的药剂。

在另一个实施方案中，本申请提供了在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活、降低BBB通透性或增加BBB稳定性的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的能够增加受试者中激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的Timp1产量的药剂。

在本申请的某些实施方案中，受试者需要治疗与小胶质细胞激活或BBB破坏相关的疾病，诸如神经退行性疾病、炎性障碍、脑膜炎、中风、神经心理障碍、慢性疼痛、外伤性脑损伤、脊髓损伤、视神经炎症、病毒或细菌感染。

在本申请的优选实施方案中，受试者需要治疗神经退行性疾病，该神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、多发性硬化症、朊病毒病、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿病和衰老。

在本申请的其他优选实施方案中，受试者需要治疗神经精神障碍，该神经精神障碍选自抑郁症、焦虑症、双相抑郁症和精神分裂症。

在另一个总的方面，本申请提供了用于减少有需要的受试者的小胶质细胞激活的药物组合物及其制备方法。

在一个实施方案中，本申请提供了用于减少有需要的受试者的小胶质细胞激活的药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的分离的激活的ILC2和药学上可接受的载体。本申请还提供了制备药物组合物的方法，该方法包括将治疗有效量的分离的激活的ILC2与药学上可接受的载体组合。

在另一个实施方案中，本申请提供用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的能够增加受试者中激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的数量的药剂和药学上可接受的载体。本申请还提供了制备药物组合物的方法，该方法包括将治疗有效量的药剂与药学上可接受的载体组合。

在另一个实施方案中，本申请提供用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的能够增加受试者中激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的IL-10或Timp1产量的药剂以及药学上可接受的载体。本申请还提供了制备药物组合物的方法，该方法包括将治疗有效量的药剂与药学上可接受的载体组合。

从随后的详细描述和所附权利要求中本发明的这些方面和其他方面以及优点将变得显而易见。应当理解，本文所述的各种实施方案的特性中的一个、一些或全部可组合以形成本发明的其他实施方案。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解上述发明内容以及下文本发明的详细描述。应当理解，本发明不限于附图中示出的精确实施方案。

在附图中：

图1A-图1L示出了富集表现出IL-10显性激活特征的ILC2的脑膜：

图1A：显示ILC(表达Tbet(ILC1)、GATA3(ILC2)或Rorγt(ILC3)的CD45

图1B：在脑膜中发现的ILC1、ILC2、ILC3的相对频率(n＝4只小鼠x2个实验)；

图1C(i)：全标本中的Rag2

图1C(ii)：用针对CD90(绿色)、Lyve1(蓝色)和GATA3(红色)的抗体标记的Rag2

图1D：显示从死后人脑膜中分离的细胞的代表性FACS图(示出了CD45

图1E：在3d全身性IL-33处理后显示Rag2

图1F：比较由从经PBS和IL-33处理的小鼠分选的ILC2表达的转录物的火山图(Volcano plot)；

图1G：比较从PBS和IL-33处理的小鼠分选的脑膜ILC2的(i)转录因子、(ii)细胞因子和(iii)细胞外标记的热图。N＝20/20只小鼠×2个实验；

图1H：在用IL-2/IL-7培养5天并用IL-33再刺激的从Rag2

图1I：IL-33刺激的mILC2的上清液中IL-5、IL-13和IL-10的Luminex测量值；n＝20个脑膜，4个孔；

图1J：从用IL-33全身处理3天后的小鼠中急性分离的脑膜CD90

图1K：来自双光子延时IL-10抗体捕获电影的停帧；针对CD90(绿色)和IL-10(红色)的荧光抗体显示在12、40、60和120m下的IL-10荧光增加。示出了代表性的3个实验；以及

图1L：从健康人供体的血液中分离的未刺激或IL-33刺激的ILC2的上清液中IL-10的Luminex测量值。N＝总共9个独特供体中的5个独特供体，其中示出了来自2个实验中的1个实验的数据；

图2示出了如通过FACS测量的在被动传输后小鼠的脑膜ILC2的定量；

图3A-图3E示出了ILC缺陷型Rag2

图3A：Rag2

图3B：原始态

图3C：代表性FACS图显示从原始态Rag2

图3D：示出了在来自Rag2

图3E：与从Rag2

图4A至图4D(ii)示出了ILC缺陷型小鼠中实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)严重程度的增加与T细胞无法在脑膜中停滞相关：

图4A：Rag2

图4B：被动EAE诱导后Rag2

图4C(i)：浸润T细胞作为从Rag2

图4C(ii)：来自图4C(i)的完整数据的图，n＝7/7只小鼠(2个实验)；

图4D(i)：T细胞作为从Rag2-/-和Rag2

图4D(ii)：来自图4D(i)的完整数据的图，n＝7/7只小鼠(2个实验)；

图5A至5J示出了ILC2分泌的因子抑制小胶质细胞炎症，并且IL-10中和消除了抑制：

图5A和图5B：在具有或不具有ILC2上清液和/或1ug/ml R848(参见每个图下方的矩阵)的情况下培养小胶质细胞，通过Luminex分析最终上清液中分泌的因子。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；方差分析。2个实验×双份样品；

图5C：在具有/不具有rIL-33的情况下培养小胶质细胞，通过Luminex分析上清液中的Timp1；

图5D：在具有/不具有1ug/ml R848的情况下培养小胶质细胞，通过Luminex分析上清液中的Mmp2、3、8、9和12；

图5E：在具有/不具有ILC2上清液和/或1ug/ml R848(参见每个图下方的矩阵)的情况下培养小胶质细胞，通过Luminex分析最终上清液中分泌的因子；p<0.0001；方差分析。示出了2个代表性实验(2个实验)；

图5F和图5G：如前所述但还在具有/不具有针对IL-10和IL-10rα的抗体的情况下培养小胶质细胞，通过Luminex分析最终上清液中分泌的因子。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；方差分析。双份孔(2个实验)；

图5H：如前所述但还在具有rmIL-10的情况下培养小胶质细胞，通过Luminex分析最终上清液中分泌的因子。****，p<0.0001；方差分析。双份孔(2个实验)；

图5I：在具有/不具有R848的情况下培养小胶质细胞并用普通培养基、含有IL-2、IL-7和IL-33但不含ILC2的培养基、来自野生型ILC2的上清液或来自Il10

图5J：将小胶质细胞用ILC2上清液或培养基处理，然后用R848刺激；通过Luminex分析最终上清液中的Mmp9和Timp1。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；方差分析；

图6A至图6I是除了被动传输的ILC2移入脑膜中以IL-10依赖性方式抑制神经炎症：

图6A：代表性FACS图示出了在i.v.被动传输ILC2以及对那些细胞的GATA3和ST2标记后从Rag2

图6B：来自移入小鼠的脑膜的CD45细胞的ILC2百分比，n＝3/3只小鼠(2个实验)；

图6C：代表性FACS直方图示出了在i.v.传输ILC2或PBS对照后从Rag2

图6D：在i.v.传输ILC2或PBS对照后从Rag2

图6E：在被动传输ILC2或PBS和3d IMQ后从Rag2

图6F：从E中的小鼠的脑中分选的小胶质细胞分泌的因子的Luminex测量值；学生T检验；**，p<0.01；****，p<0.0001；n＝5/5只小鼠(2个实验中的一个实验)；

图6G：在被动传输野生型或Il10

图6H：在被动传输ILC2或PBS和3d IMQ后从Rag2

图6I：培养2天后小胶质细胞分泌的因子的Luminex分析。**，p<0.01；****，p<0.0001；方差分析；n＝6/5/5只小鼠(来自2个实验)，具有相似的结果；

图7A至图7G示出了ILC缺陷型小鼠显示出‘脱离(decoupled)’皮肤相对于脑对IMQ激发的应答：

图7A：IMQ处理后野生型、Rag2

图7B：来自三个组的背部皮肤的代表性H&E标记：在来自野生型小鼠的背部长毛皮肤中注意到“H”显著的角化过度；“M”显著的芒罗(Munro)微脓肿；“A”显著的棘皮症；“I”显著的皮肤浸润；“DP”显著的真皮乳头；“DC”扩张的毛细血管。在Rag2

图7C：来自三个组的脑切片的代表性H&E标记；在野生型和Rag2

图7D：示出了在用0.8mg/天TLR7激动剂IMQ局部处理3天后从野生型、Rag2

图7E：(D)的定量；p<0.01；***，p<0.001；方差分析；n＝3/3/3只小鼠(2个实验)；

图7F：来自IMQ处理的Rag2

图7G：如通过旷场试验(open field test)所测量的经媒介物处理相对于经IMQ处理的Rag2

图8示出了IL-10的阻断消除了与ILC2被动传输相关的抑制作用：示出了来自从在收集之前在具有/不具有针对IL-10的中和抗体的情况下用PBS(对照)或ILC2传输并且用0.8mg IMQ处理3天的小鼠的脑中分选的小胶质细胞的上清液中分泌的因子的Luminex检测；学生T检验；n＝10/5/5只小鼠，示出了组合的两个实验的结果。

具体实施方式

背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。

除非另行指出，否则任何数值，诸如本文所述的浓度或浓度范围被理解为在所有情况下用术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其他变型应被理解为是指包括指定的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且是非排他性的或开放式的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括这些组合物、混合物、过程、方法、制品或设备未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确地指明相反，否则“或”是指包括性的“或”而不是排他性的“或”。例如，条件A或B由以下任一项满足：A为真(或存在)而B为假(或不存在)，A为假(或不存在)而B为真(或存在)，以及A和B均为真(或存在)。

除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同物。此类等同物旨在由本发明所涵盖。

如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，但不能将附加的整数或整数组添加到指定的方法、结构或组成中。

如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“基本上由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不会实质上改变指定方法、结构或组成的基本或新型特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。

如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选是指哺乳动物，最优选是指人，将通过或者已经通过根据本发明的实施方案的方法对其进行治疗。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于奶牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人等，更优选地包括人。

在某些实施方案中，受试者需要治疗与小胶质细胞激活相关的障碍。此类障碍的示例包括但不限于：神经退行性疾病、炎性障碍、神经心理障碍、慢性疼痛、脊髓损伤、视神经炎症、病毒或细菌感染。

在某些实施方案中，受试者需要治疗神经退行性疾病，该神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、多发性硬化症、朊病毒病、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿病和衰老。

在某些优选的实施方案中，受试者需要治疗神经精神障碍，该神经精神障碍选自抑郁症、焦虑症、双相抑郁症和精神分裂症。

还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特性时，本文使用的“约”、“大约”、“大致”、“基本上”和类似的术语表示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员所理解的。至少，包括数值参数的这种参考将包括使用本领域已接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他系统误差、制造公差等)的变化，不会改变最低有效数字。

如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受试者的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。术语“联合”的使用并不限制疗法施用于受试者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在第二疗法施用于受试者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)，与此同时，或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。

如本文所用，术语“小胶质细胞激活”是指与小胶质细胞的先天激活或适应性激活相关的过程。此类激活可包括小胶质细胞的形态学变化(包括细胞过程的缩短和它们的胞体增大)，以及促炎性细胞因子和趋化因子、反应性氧和/或氮中间体、蛋白酶和补体蛋白的释放，以及细胞表面激活抗原的上调。

本发明人已经首次证明，脑膜ILC2通过IL-10的分泌在脑部的边缘处发挥有效的调节作用。在EAE和IMQ介导的全身性炎症模型中，ILC缺陷型小鼠分别在基线处显示出增加的小胶质细胞反应性、以及对适应性免疫激发或先天免疫激发的神经炎症应答加剧。在这两种模型中，ILC缺陷型小鼠显示出外周细胞的脑浸润增加和BBB完整性受损，如通常从脑中排除的分子的实质渗漏所示。

对小鼠中的脑膜ILC亚群的表征指示的ILC2占主导地位，并且位于矢状窦中，因此具有对CSF和血液两者的潜在访问；对人脑膜样品的后续询问表明类似的ILC2群体。来自对照和IL-33刺激的小鼠的所分选的脑膜ILC2的RNAseq分析揭示出激活特征，该激活特征通过转录因子和细胞外标记密切定位于经典ILC2，但出乎意料地由Il10标签主导。

随后确认了IL-33刺激的脑膜ILC2在蛋白质水平上的IL-10产生和释放，以及与炎症和组织保护的消退相关的若干其他因子，包括Timp1，Timp1是通过抑制Mmp、细胞外基质和紧密连接降解的肽酶而显示在BBB处具有保护性的因子。因此，来自激活的ILC2的上清液显示在体外稳健地抑制细胞因子、趋化因子和Mmp从小胶质细胞的释放，当IL-10信号传导被阻断时，保护效应在很大程度上被消除。在体内，接受ILC2的被动传输的Rag2

自从它们的初始发现以来，ILC亚型的多样性已显著增长，其中与若干T细胞类型的功能类似物已得到充分表征(Artis等人,Nature,2015,517:293–301)。然而，针对T调节细胞(即先天淋巴样调节细胞)的ILC推论仍然明显不存在。然而，最近，缺乏经典ILC2标记并且具有通过Id3与ILC所共有的预期的Id2区分的转录因子标签的肠道驻留谱系阴性细胞在抗CD40诱导的结肠炎模型中被指定为保护性IL-10的来源(Wang等人,Cell,2017,171(1):201-216)。因此，此细胞被认为是长期难解的“ILC

本申请中所描述的脑膜ILC2的转录和功能分析证实了IL-10在IL-33激活后高度上调。对来自其他鼠组织以及如本文所述随后来自人血液的经典ILC2中IL-10产生的进一步检测表明，ILC2的IL-10产生可能是有规律的而不是例外的。应当注意，本文所述的在RNAseq数据集中突出显示的Gata3、Irf4和Nfil3是其他细胞类型中的IL-10产生的真正参与者，因此排除了对另外的新因子的搜索。因此，ILC2可出乎意料地代表具有广泛调节功能的关键先天淋巴样细胞群。这种先前未认识到的经典ILC2工具建议将ILC2细胞疗法作为一种新的治疗方法。此外，考虑到证明了IL-33对IL-10产量的重要性，根据时间或分子背景，对警报素的理解可能需要一些重新考虑以包括修复信号传导。

本文所述的观察结果表明，脑膜ILC2是通过调节趋化因子(例如CCL3和CCL4)参与神经免疫稳态、外周免疫细胞的脑导向趋化性的多潜能作用因子，并且通过IL-10和Timp1以及可能的其他机制在BBB完整性中进一步起着意想不到的作用。鉴于本公开，可以鉴定可用于调节神经炎症和屏障完整性的另外的因子/药剂。此类因子/药剂最终可通过细胞或小分子治疗方法用于改善CNS炎性病理，诸如多发性硬化症、脑膜炎或中风中的BBB破坏、或与慢性炎症共病的精神障碍(Bhatarya等人,2016,Psychopharmacology(Berl).233:1623-36)。

在一个总的方面，本发明涉及减少或抑制有需要的受试者的小胶质细胞激活或减少BBB破坏的方法。

根据本发明的实施方案，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的II型先天淋巴样细胞(ILC2)、优选激活的ILC2。

如本文所用，术语“II型先天淋巴样细胞”、“ILC2”和“ILC2细胞”各自是指具有淋巴样形态并且不存在T细胞受体但可在激活时表达2型辅助T(Th2)细胞相关细胞因子的淋巴细胞群。Th2细胞因子的示例包括白介素4(IL-4)、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13。ILC2被认为是先天辅助细胞。

鉴于本公开，ILC2可通过使用本领域已知的方法表达一种或多种标记来鉴定。在一些实施方案中，ILC2细胞对于淋巴标记CD90的表达被测试为阳性，对于淋巴标记ICOS的表达被测试为阳性，并且对于与免疫细胞命运决定和成熟相关的谱系标记(下文称为Lin)的表达被测试为阴性。在一些实施方案中，ILC2细胞被测试为对于淋巴标记CD90和ICOS的表达呈阳性、对于Lin的表达呈阴性，并被进一步测试为对于IL7Ra(CD127)、CD161、ST2、干细胞抗原1(Sca1)、IL2Ra(CD25)和CRTH2的一种或多种另外的标记的表达呈阳性。例如，人ILC2细胞可见于胃肠道和肺中，并且通过其CD161的表达和Th2细胞上表达的化学趋化物受体同源分子(CRTH2)进行鉴定(Mjosberg等人,Nat Immunol.2011；12(11):1055-1062)。鉴于本公开，ILC2可根据已知的方法获得。例如，细胞可使用可商购获得的试剂盒和荧光激活细胞分选(FACS)从骨髓中分离并富集ILC2。

如本文所用，术语“激活的ILC2”是指已与药剂接触以通过ILC2诱导Th2细胞因子产生的ILC2。在一些实施方案中，ILC2由细胞因子诸如IL-33、IL-25、IL-7、IL-2和/或它们的组合激活。

鉴于本公开，激活的ILC2可使用本领域已知的方法获得。ILC2细胞可从ILC2细胞的各种合适来源分离，所述各种合适来源包括但不限于肺组织、胃肠(GI)道、CNS组织、哺乳动物血液和/或血液产品。在一些实施方案中，ILC2细胞可来源于人脐带血细胞。此类人脐带血细胞可来源于供体受试者和/或来源于患者自己的脐带血。在分离期间，细胞可通过对应于感兴趣的细胞的尺寸的涤纶网(Dacron mesh)过滤，然后以50×g洗涤两次，每次1分钟。细胞活力可通过台盼蓝染料排除来确定。具有>90％活力的细胞可用于移植。离体细胞可以是成体体细胞、成体祖细胞、成体干细胞、胚胎祖细胞或胚胎干细胞。此类细胞的来源是本领域普通技术人员熟知的。在分离后，细胞可被离体激活，任选地修饰。

ILC2细胞可通过与其他细胞共培养和/或通过与一种或多种刺激或激活分子诸如各种细胞因子一起培养来激活。例如，与鼠ILC2一样，人ILC2可在体外或离体扩增和激活，并响应于IL-2、IL-7和IL-33或IL-25而产生显著量的IL-5和IL-13。在一些实施方案中，激活的ILC2细胞可使用体外方法产生，所述体外方法包括从受试者收集人脐带血，从脐带血中分离c-Kit阳性细胞，并且在IL-33细胞因子的存在下培养c-Kit阳性细胞，从而产生IL-33激活的ILC2细胞。在一些实施方案中，ILC2细胞通过将培养物中的c-Kit阳性细胞暴露于一种或多种细胞因子IL-33、IL-25、IL-2和IL-7来激活。在一些实施方案中，体外方法还包括通过测量ILC2的一种或多种标记的表达，诸如ST2、杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1(KLRG1)、SCA-1或CD127在ILC2细胞中的表达来分析所产生的ILC2细胞。在一些实施方案中，所激活的ILC2细胞基本上不含为IL-25反应性但不同于ILC2的多潜能祖细胞2(MPP2)。

IL-33是属于IL-1超家族的细胞因子。其是充当核因子和促炎性细胞因子的双重功能蛋白。与异染色质的核定位和缔合由N末端结构域介导，并允许IL-33作为NF-κB复合物的p65亚基的新型转录调节子起作用。C末端结构域足以结合ST2受体并激活来自极化Th2细胞和ILC2细胞的2型细胞因子(例如IL-5和IL-13)的产生。因此，在一些实施方案中，所激活的ILC2细胞可通过使ILC2细胞与IL-33或其C末端结构域接触而产生。

激活长度可通过实验确定，这可取决于诸如ILC2的起源、细胞因子和/或用于激活的条件等因素。在某些实施方案中，使ILC2与药剂诸如IL-33、IL-25、IL-2、IL-7、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)接触至少30分钟(例如，至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时)。在优选的实施方案中，在施用至受试者之前，使ILC2与细胞因子接触至少4小时以进行激活。

在一些实施方案中，可用于本发明的激活的ILC表达CD90、SCA-1、iCOS和/或ST2，响应于IL-25和/或IL-33，并产生IL-10、IL-5和IL-13。

在本申请的某些实施方案中，所施用的ILC2被基因修饰。本领域技术人员将认识到，鉴于本公开可利用本领域已知的方法将基因修饰引入细胞中。例如，为了操纵任何给定的相关因子的基因表达，可以使用一种或多种病毒载体、或病毒载体和其他基因递送和编辑工具(包括使用mRNA、siRNA、miRNA或其他基因修饰)。

在某些实施方案中，ILC2可被修饰成表达免疫调节分子(包括但不限于细胞因子)，优选地，ILC2被修饰成表达IL-10。在某些实施方案中，ILC2可被基因修饰以表达导致ILC2数量增加和/或IL-10产量增加的药剂，优选地，ILC2被修饰以表达IL-33受体。在某些实施方案中，ILC2细胞可被基因修饰以表达一种或多种其他目的产物，诸如已知在减少小胶质细胞激活方面有效的一种或多种蛋白质，例如TGF-β。

如本文所用，“自体的”是指从受试者或宿主的组织或细胞来源的生物物质或细胞。待施用到受试者体内的激活的ILC2可为自体的。

如本文所用，“异源”是指从与受试者或宿主不同的物种或相同物种的不同个体(例如，同种异体或异种)的组织或细胞来源的生物物质或细胞。待施用到受试者体内的激活的ILC2可为异源的。

在本申请的某些实施方案中，在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活或BBB破坏的方法包括向该受试者施用治疗有效量的能够增加受试者中激活的ILC2的数量的药剂。能够增加激活的ILC2的数量的药剂的示例包括但不限于能够激活ILC的药剂，诸如IL-33、IL-25、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-2和IL-7。

增加受试者中激活的ILC2的数量可能意味着增加受试者中总激活的ILC2的数量或增加特定组织驻留的激活的ILC2的数量。ILC2驻留在哺乳动物的皮肤、肺、肝、肠、脂肪和脑中。在优选的实施方案中，由于本发明的一种或多种治疗，受试者具有增加数量的激活的脑膜ILC2。

除了已知能够激活ILC2并导致激活的ILC的数量增加的药剂之外，可使用包括以下步骤的方法鉴定可用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活或BBB破坏的其他药剂：

(1)在适合于ILC2生长和激活的条件下使ILC2与测试化合物接触；以及

(2)测量所激活的ILC2的数量。

适合于ILC2的生长和激活的条件是本领域技术人员已知的。用于使细胞离体生长的合适生长培养基是本领域熟知的，并且公开于例如“Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique and Specialized Applications”R.I.Freshney,2010,Wiley-Blackwell中。每种类型的细胞的最佳培养基可获自细胞的专门供应商(例如：ATCC-LGC,MI,Italy；CDC,Atlanta,Ga.,USA)。可通过ILC2的一种或多种标记(诸如CD90和ICOS、IL7Ra(CD127)、CD161、ST2、干细胞抗原1(Sca1)、IL2Ra(CD25)和CRTH2)的表达以及对于Lin的表达呈阴性来鉴定和定量激活的ILC2。

在本申请的某些其他实施方案中，在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的方法包括向该受试者施用治疗有效量的能够增加受试者中ILC2的IL-10产量的药剂。能够增加ILC2的IL-10产量的药剂的示例包括但不限于IL-25、IL-33、IL-2、IL-4或它们的组合。并非所有激活的ILC2都具有增加的IL-10产量。ILC2的组织位置似乎起作用。例如，肺中的ILC2在用单独的IL-33治疗后产生非常少(如果有的话)的IL-10。然而，如果肺中的ILC2被IL-33和IL-2和/或IL-4激发，则它们产生高水平的IL-10。在某些实施方案中，可使用细胞因子的组合来获得增加ILC2的IL-10产量的协同反应。例如，IL-25和IL-33的组合可导致比各自单独高得多的IL-10产量。在某些其他实施方案中，可使用细胞因子的组合来获得增加ILC2的Timp1产量的协同反应。

增加受试者中激活的ILC2的IL-10或Timp1产量可能意味着增加受试者中总激活的ILC2的IL-10或Timp1产量或增加特定组织驻留的激活的ILC2的IL-10或Timp1产量。在优选的实施方案中，由于本发明的一种或多种治疗，受试者具有增加的通过激活的脑膜ILC2的IL-10或Timp1产量。

除了已知能够增加ILC2的IL-10或Timp1产量的药剂之外，可使用包括以下步骤的方法鉴定可用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的其他药剂：

(1)在适合于由ILC2产生IL-10的条件下使ILC2与测试化合物接触；以及

(2)测量由ILC2产生的IL-10或Timp1的水平。

适合于由ILC2产生IL-10的条件是本领域技术人员已知的。鉴于本公开可使用本领域已知的方法，例如通过对IL-10或Timp1具有特异性的抗体来鉴定和定量由ILC2产生的IL-10或Timp1。

在某些方面，本发明涉及用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的药物组合物。

在一个实施方案中，该药物组合物包含治疗有效量的所激活的ILC2以及药学上可接受的载体。

在另一个实施方案中，该药物组合物包含治疗有效量的能够增加受试者中激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的数量的药剂以及药学上可接受的载体。

在另一个实施方案中，该药物组合物包含治疗有效量的能够增加在受试者中激活的ILC2的IL-10或Timp1产量的药剂以及药学上可接受的载体。Timp1的产生可通过激活的ILC2直接增加，或通过其产生和/或活性由激活的ILC2增加的另一因素(例如，IL-10)间接地增加。

药学上可接受的载体是无毒的并且不应干扰活性成分的功效。药学上可接受的载体可包括但不限于一种或多种，诸如水、二醇、糖、油、氨基酸、醇、防腐剂、润滑剂、稳定剂、着色剂等。任何合适的药学上可接受的载体可与激活的ILC2、增加ILC2的数量的药剂或增加IL-10或Timp1产量的药剂一起使用以施用至受试者。例如，合适的配制品可包括水性和非水性无菌注射溶液，该无菌注射溶液可含有使得配制品与预期接受者的体液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌抗生素和溶质；以及可包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。配制品可存在于单位剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿和小瓶)中，并且可储存在冷冻或冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在即将使用之前添加无菌液体载体(例如注射用水)。一些示例性成分为SDS、甘露糖醇或另一种糖、以及磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

应当理解，除了上文特别提及的成分之外，本发明所公开的主题的配制品还可包含本领域中关于所考虑的配制品类型常规的其他药剂。例如，可使用无菌的不含热原的水性和非水性溶液。

本发明所公开的主题的治疗方案和组合物可与另外的药剂或生物应答调节剂(包括但不限于细胞因子)一起使用。

本发明所公开的主题的组合物的施用可通过本领域普通技术人员已知的任何方法，包括但不限于静脉内施用、滑膜内施用、经皮施用、肌内施用、皮下施用、局部施用、直肠施用、阴道内施用、瘤内施用、口服施用、经颊施用、鼻内施用、肠胃外施用、吸入和吹入法。在一些实施方案中，用于施用本发明所公开主题的组合物的合适方法包括但不限于静脉内注射。另选地，可将组合物以任何其他方式沉积在需要治疗的部位处。施用本发明所公开主题的组合物的具体模式取决于各种因素，包括待治疗的细胞的分布和丰度、组合物的另外的组织或细胞靶向特征、以及组合物从其施用部位代谢或去除的机制。

根据本发明的实施方案，分离的ILC2或其药物组合物的施用可以是全身的或局部的。在某些实施方案中，施用是肠胃外施用。在优选的实施方案中，向受试者施用分离的ILC2或其药物组合物是通过注射、输注、静脉内(IV)施用、鞘内施用或股骨内施用。在又进一步优选的实施方案中，向受试者施用分离的ILC2或其药物组合物是通过静脉内或鞘内施用。

施用增加激活的ILC2的数量或ILC2的IL-10产量的药剂(诸如细胞因子)可以是肌内的、皮下的或静脉内的。然而，也可设想其他施用模式，诸如皮肤施用、皮内施用或鼻内施用。可通过使用针注射药剂组合物的悬浮液来实现药剂的肌内施用。另选地，使用无针注射装置来施用组合物(使用例如Biojector

在某些实施方案中，ILC2可从患者收获，任选地被基因修饰，通过离体处理激活，然后施用回患者体内以减少小胶质细胞激活。

对于静脉内、皮肤或皮下注射，药剂组合物可以是不含热原并且具有合适的pH、等渗性和稳定性的肠胃外可接受的水性溶液的形式。本领域的技术人员完全能够使用例如等渗媒介物诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液来制备合适的溶液。根据需要，可包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。也可使用缓释配制品。

将有效剂量的本发明所公开组合物的组合物施用至有需要的受试者。如本文所用，“有效量”是指在向有需要的受试者施用后组合物在受试者体内提供期望的局部或全身效果的量。在一些实施方案中，有效量是足以实现受试者中的小胶质细胞激活减少的有益或期望临床结果的量。有效量可在单次施用中一次性全部提供，或者以在若干次施用中提供有效量的分次量提供。

可改变本发明所公开主题的组合物中的活性成分的实际剂量水平，以便施用可有效实现特定受试者的期望治疗反应的活性化合物的量。所选择的剂量水平可取决于治疗组合物的活性、施用途径、与其他药物或治疗的组合、所治疗病症的严重性、以及针对每个受试者的个体因素(包括他们的体型、年龄、损伤和/或疾病状况和先前的病史)、以及自疾病发生或疾病开始以来的时间量。然而，鉴于本公开，以低于实现期望治疗效果所需的水平开始组合物的剂量并逐渐增加剂量直至实现期望效果也在本领域的技术范围内。

例如，在审查本文所呈现的本发明所公开主题的公开内容之后，本领域的普通技术人员可考虑特定配制品、与组合物一起使用的施用方法以及病症的严重性来为个体患者定制剂量。剂量的进一步计算可考虑患者身高和体重、症状的严重性和阶段以及另外的有害身体状况的存在。此类调节或变型、以及对何时和如何作出此类调节或变型的评价是医学领域的普通技术人员所熟知的。

本专利申请中所有引用的参考文献的内容(包括参考文献、公布的专利、公布的专利申请以及共同未决的专利申请)在此明确地以引用方式并入。

本发明还提供了以下非限制性实施方案。

实施方案1是一种在有需要的受试者中减少或抑制小胶质细胞激活的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)。

实施方案1a是一种在有需要的受试者中降低血脑屏障(BBB)通透性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)。

实施方案2是根据实施方案1或1a所述的方法，其中所述ILC2通过使所述ILC2与选自IL-33、IL-25、IL-2、IL-7或它们的组合的至少一种细胞因子接触来激活。

实施方案2a是根据实施方案2所述的方法，其中所述ILC2通过使所述ILC2与选自IL-33、IL-25、IL-2、IL-7的两种细胞因子接触来激活。

实施方案2b是根据实施方案2所述的方法，其中所述ILC2通过使所述ILC2与选自IL-33、IL-25、IL-2、IL-7的三种细胞因子接触来激活。

实施方案2c是根据实施方案2所述的方法，其中所述ILC2通过使所述ILC2与细胞因子IL-33、IL-25、IL-2和IL-7接触来激活。

实施方案2d是根据实施方案2所述的方法，其中所述ILC2通过使所述ILC2与IL-33和IL-25接触来激活。

实施方案2e是根据实施方案2至2d中任一项所述的方法，其中所述ILC2通过使所述ILC2与至少一种细胞因子接触至少30分钟、优选地至少2小时、更优选地至少4小时来激活。

实施方案3是根据实施方案1至2d中任一项所述的方法，其中所施用的激活的ILC2细胞是自体的。

实施方案3(a)是根据实施方案1至2d中任一项所述的方法，其中所施用的激活的ILC2细胞是同种异体的。

实施方案3(b)是根据实施方案1至2d中任一项所述的方法，其中所施用的激活的ILC2细胞是同基因的。

实施方案4是根据实施方案1至3(b)中任一项所述的方法，其中所述ILC2被基因修饰。

实施方案4a是根据实施方案4所述的方法，其中与其他方面相同的未被修饰的细胞相比，所述细胞被基因修饰以增加IL-10产量。

实施方案4b是根据实施方案4所述的方法，其中与其他方面相同的未被修饰的细胞相比，所述细胞被基因修饰以增加激活的ILC2的数量。

实施方案4c是根据实施方案4所述的方法，其中与其他方面相同的未被修饰的细胞相比，所述细胞被基因修饰以增加Timp1产量。

实施方案5是根据实施方案1至4c中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的激活的ILC2是静脉内或鞘内施用的。

实施方案6是一种在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的能够增加所述受试者中的激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的数量的药剂。

实施方案6a是一种在有需要的受试者中降低血脑屏障(BBB)通透性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的能够增加所述受试者中的激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的数量的药剂。

实施方案7是根据实施方案6或6a所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用选自IL-33、IL-25、IL-2、IL-7或它们的组合的至少一种细胞因子。

实施方案7a是根据实施方案7所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用选自IL-33、IL-25、IL-2、IL-7的两种细胞因子。

实施方案7b是根据实施方案7所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用选自IL-33、IL-25、IL-2、IL-7的三种细胞因子。

实施方案7c是根据实施方案7所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用IL-33、IL-25、IL-2、IL-7。

实施方案8是一种在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加所述受试者中的激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的IL-10产量的药剂。

实施方案8a是一种在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加所述受试者中的激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的Timp1产量的药剂。

实施方案8b是一种在有需要的受试者中降低血脑屏障(BBB)通透性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加所述受试者中的激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的IL-10产量的药剂。

实施方案8c是一种在有需要的受试者中降低血脑屏障(BBB)渗透性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加所述受试者中的激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的Timp1产量的药剂。

实施方案9是根据实施方案8至8c中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的IL-33、IL-25、IL-2、IL-4或它们的组合。

实施方案10是根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述受试者需要治疗与小胶质细胞激活相关的障碍。

实施方案11是根据实施方案10所述的方法，其中所述受试者需要治疗神经退行性疾病、炎性障碍、神经心理障碍、慢性疼痛、外伤性脑损伤、脊髓损伤、视神经炎症、病毒或细菌感染。

实施方案12是根据实施方案10所述的方法，其中所述受试者需要治疗神经退行性疾病，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、多发性硬化症、朊病毒病、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿病、衰老、脑膜炎和中风。

实施方案13是根据实施方案10所述的方法，其中所述受试者需要治疗神经精神障碍，所述神经精神障碍选自抑郁症、焦虑症、双相抑郁症和精神分裂症。

实施方案14是一种用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的分离的激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)以及药学上可接受的载体。

实施方案14a是根据实施方案14所述的药物组合物，所述药物组合物还包含至少一种药剂，所述至少一种药剂能够激活所述组合物中的ILC2或使所述ILC2保持在激活状态。

实施方案14b是根据实施方案14a所述的药物组合物，其中所述至少一种药剂选自IL-33、IL-25、IL-2和IL-7。

实施方案14c是根据实施方案14a所述的药物组合物，其中所述至少一种药剂包括选自IL-33、IL-25、IL-2和IL-7的两种药剂。

实施方案14d是根据实施方案14a所述的药物组合物，其中所述至少一种药剂包括选自IL-33、IL-25、IL-2和IL-7的三种药剂。

实施方案14e是根据实施方案14a所述的药物组合物，其中所述至少一种药剂包括IL-33、IL-25、IL-2和IL-7。

实施方案14f是根据实施方案14a所述的药物组合物，其中所述至少一种药剂包括IL-33和IL-25。

实施方案14g是根据实施方案14至14f中任一项所述的药物组合物，其中所述ILC2是脑膜ILC2。

实施方案15是一种用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的能够增加受试者中的激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的数量的药剂以及药学上可接受的载体。

实施方案15a是根据实施方案15所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含选自IL-33、IL-25、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-2和IL-7的至少一种药剂。

实施方案15b是根据实施方案15所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含选自IL-33、IL-25、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-2和IL-7的两种药剂。

实施方案15c是根据实施方案15所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含选自IL-33、IL-25、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-2和IL-7的三种药剂。

实施方案15d是根据实施方案15所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含选自IL-33、IL-25、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-2和IL-7的四种药剂。

实施方案15e是根据实施方案15所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含IL-33、IL-25、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-2和IL-7。

实施方案15f是根据实施方案15所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含IL-33和IL-25。

实施方案15g是根据实施方案15至15f中任一项所述的药物组合物，其中所述ILC2是脑膜ILC2。

实施方案16是一种用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的能够增加受试者中的激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的IL-10产量的药剂以及药学上可接受的载体。

实施方案16a是根据实施方案16所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含选自IL-33、IL-25、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-2和IL-7的至少一种药剂。

实施方案16b是根据实施方案16所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含选自IL-33、IL-25、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-2和IL-7的两种药剂。

实施方案16c是根据实施方案16所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含选自IL-33、IL-25、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-2和IL-7的三种药剂。

实施方案16d是根据实施方案16所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含选自IL-33、IL-25、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-2和IL-7的四种药剂。

实施方案16e是根据实施方案16所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含IL-33、IL-25、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-2和IL-7。

实施方案16f是根据实施方案16所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含IL-33和IL-25。

实施方案16g是根据实施方案16至16f中任一项所述的药物组合物，其中所述ILC2是脑膜ILC2。

实施方案17是一种制备根据实施方案14至14g中任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括将所述治疗有效量的分离的激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)与所述药学上可接受的载体混合。

实施方案18是一种制备根据实施方案15至15g中任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括将所述治疗有效量的能够增加所述受试者中的ILC2的数量的药剂与所述药学上可接受的载体混合。

实施方案19是一种制备根据实施方案16至16g中任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括将所述治疗有效量的能够增加所述受试者中的所述激活的II型先天淋巴样细胞(ILC2)的IL-10产量的药剂与所述药学上可接受的载体混合。

实施方案20是一种鉴定可用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的药剂的方法，所述方法包括：

(1)在适合于所述ILC2生长的条件下使先天淋巴样细胞(ILC2)与所述药剂接触；以及

(2)测量所述ILC2的数量；

其中所述ILC2的数量与对照水平相比增加指示所述药剂可用于减少有需要的受试者中的小胶质细胞激活。

实施方案21是一种鉴定可用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的药剂的方法，所述方法包括：

(1)使先天淋巴样细胞(ILC2)与所述药剂接触；以及

(2)测量由所述ILC2产生的IL-10的水平；

其中由所述ILC2产生的IL-10的量与对照水平相比增加指示所述药剂可用于减少有需要的受试者中的小胶质细胞激活。

实施方案21a是一种鉴定可用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞激活的药剂的方法，所述方法包括：

(1)使先天淋巴样细胞(ILC2)与所述药剂接触；以及

(2)测量由所述ILC2产生的Timp1的水平；

其中由所述ILC2产生的Timp1的量与对照水平相比增加指示所述药剂可用于减少有需要的受试者中的小胶质细胞激活。

实施方案21b是一种鉴定可用于在有需要的受试者中降低BBB通透性的药剂的方法，所述方法包括：

(1)使先天淋巴样细胞(ILC2)与所述药剂接触；以及

(2)测量由所述ILC2产生的IL-10的水平；

其中由所述ILC2产生的IL-10的量与对照水平相比增加指示所述药剂可用于降低有需要的受试者中的BBB通透性。

实施方案21c是一种鉴定可用于在有需要的受试者中降低BBB通透性的药剂的方法，所述方法包括：

(1)使先天淋巴样细胞(ILC2)与所述药剂接触；以及

(2)测量由所述ILC2产生的Timp1的水平；

其中由所述ILC2产生的Timp1的量与对照水平相比增加指示所述药剂可用于降低有需要的受试者中的BBB通透性。

实施方案22是根据实施方案1至13中任一项所述的方法、根据实施方案14至16中任一项所述的药物组合物、或根据实施方案17至21c中任一项所述的方法，其中所述ILC2表达CD90、ICOS、IL7Ra(CD127)、CD161、ST2、干细胞抗原1(Sca1)、IL2Ra(CD25)和CRTH2中的一种或多种并且对于Lin的表达呈阴性。

实施方案22a是根据实施方案22所述的方法，其中所述ILC2表达CD90、ICOS、IL7Ra(CD127)、CD161、ST2、干细胞抗原1(Sca1)、IL2Ra(CD25)和CRTH2中的两种，并且对于Lin的表达呈阴性。

实施方案22b是根据实施方案22所述的方法，其中所述ILC2表达CD90、ICOS、IL7Ra(CD127)、CD161、ST2、干细胞抗原1(Sca1)、IL2Ra(CD25)和CRTH2中的三种，并且对于Lin的表达呈阴性。

实施方案22c是根据实施方案22所述的方法，其中所述ILC2表达CD90、ICOS、IL7Ra(CD127)、CD161、ST2、干细胞抗原1(Sca1)、IL2Ra(CD25)和CRTH2中的四种，并且对于Lin的表达呈阴性。

实施方案22d是根据实施方案22所述的方法，其中所述ILC2表达CD90、ICOS、IL7Ra(CD127)、CD161、ST2、干细胞抗原1(Sca1)、IL2Ra(CD25)和CRTH2中的五种，并且对于Lin的表达呈阴性。

实施方案22e是根据实施方案22所述的方法，其中所述ILC2表达CD90、ICOS、IL7Ra(CD127)、CD161、ST2、干细胞抗原1(Sca1)、IL2Ra(CD25)和CRTH2中的六种，并且对于Lin的表达呈阴性。

实施方案22f是根据实施方案22所述的方法，其中所述ILC2表达CD90、ICOS、IL7Ra(CD127)、CD161、ST2、干细胞抗原1(Sca1)、IL2Ra(CD25)和CRTH2中的七种，并且对于Lin的表达呈阴性。

实施方案22g是根据实施方案22所述的方法，其中所述ILC2表达CD90、ICOS、IL7Ra(CD127)、CD161、ST2、干细胞抗原1(Sca1)、IL2Ra(CD25)和CRTH2中的八种，并且对于Lin的表达呈阴性。

实施方案22h是根据实施方案22至22g中任一项所述的方法，其中所述激活的ILC2产生IL-10。

实施方案22i是根据实施方案22至22h中任一项所述的方法，其中所述激活的ILC2还产生IL-4、IL-5、IL-9和IL-13中的至少一种。

实施方案22j是根据实施方案22i所述的方法，其中所述激活的ILC2还产生IL-4、IL-5、IL-9和IL-13中的两种。

实施方案22k是根据实施方案22j所述的方法，其中所述激活的ILC2还产生IL-4、IL-5、IL-9和IL-13中的三种。

实施方案22l是根据实施方案22j所述的方法，其中所述激活的ILC2还产生IL-4、IL-5、IL-9和IL-13。

实施方案22m是根据实施方案22至22l中任一项所述的方法，其中所述激活的ILC2产生Timp1。

实施方案22n是根据实施方案1至22m中任一项所述的方法，其中所述激活的ILC2是脑膜ILC2。

包括以下实施例以进一步说明本发明所公开主题的各种实施方案。然而，鉴于本公开，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明所公开主题的精神和范围的情况下可在所公开的具体实施方案中作出许多改变并且仍获得相同或类似的结果。这些实施例不以任何方式限制本发明。它们仅用于阐明本发明。

CD45+Lin–FCεr1a–DX5–CD90+IL7rα+细胞的转录因子标记(图1A)用于解析ILC1(Tbet+)、ILC2(Gata3Hi)和ILC3(RORγt+Gata3–/lo)亚群。首先，分析脑膜先天淋巴样细胞(mILC)以确定最丰富的类型。小心解剖原始态小鼠的脑，并立即将其置于4％多聚甲醛中进行固定。在4℃处固定48小时(hr)之后，将脑在30％蔗糖在H

为了探索ILC2可能可行地影响CNS的可能解剖途径，使用CD90标记ILC和使用Lyve1描绘淋巴组织与非淋巴组织来进行免疫标记和对完整脑膜的高分辨率共焦成像(Louveau等人,2015,Nature 523,337–341)。CD90+ILC主要在窦内可视化，但不限于Lyve1+淋巴本身(图1C(i))；原位Gata3免疫标记的添加确认了ILC2的存在(图1C(ii))。作为脑脊液(CSF)和CNS血流的脉管，窦表明分泌因子作为允许脑膜ILC与CNS中的其他细胞发生相互作用的可能的机制连接。

ILC此前还未在人类脑膜中得到表征(或甚至未鉴定)。在本研究中研究了它们在新鲜死后脑膜中的存在。简言之，在收到时，解剖死后18-24小时的矢状窦、软膜和脉络膜丛组织，小心地用PBS洗涤，解离，并标记用于通过流式细胞术分析。在所有样品中成功解析了CD45+Lin–CD11c–FcεR1–CD127+CRTH2+CD161+细胞(图1D)。对新鲜死后脑膜的研究的早期结果表明，人类脑膜也含有与小鼠脑膜中发现的ILC2类似的ILC2群体。

为了探测IL-25和IL-33的相对功能应答，通过腹膜内(i.p.)注射用每种细胞因子处理Rag2

小胶质细胞(CNS内的主要免疫存在)参与持续监测并易于响应以保护微妙的周围神经组织。为了检查mILC2来源的因子在CNS免疫调节中的作用，将小胶质细胞从ILC2缺陷型Rag2

使用Iba-1的免疫标记确实表明来自ILC缺陷型小鼠的脑的小胶质细胞密度存在可见的差异(图3A)，显示每单位面积的小胶质细胞数量增加(图3B)。随后通过流式细胞术对急性分离的脑细胞悬浮液进行的分析揭示了来自ILC缺陷型小鼠的小胶质细胞的升高的侧向散射(细胞粒度的一般指示，因此暗示细胞内活性)(图3C)、增加的CD45(图3D)和其他表面激活标记(例如FcRII/III和MARCO)(图3E)的表达。这些观察确实表明与ILC缺乏相关的基线小胶质细胞状态改变。与I型和II型应答两者相关的激活标记相似地升高，表明一般激活而不是M1或M2偏移。

为了探测mILC2的功能作用，每日向对照和ILC2缺陷型小鼠注射0.033mg/kg，与rIL-33间隔24小时以激活ILC2，持续3天。然后分离脑膜和脑细胞，并将其一起置于37℃处在具有10％FBS、1:100P/S、1:100L-谷氨酰胺、1:100NEAA、1:100丙酮酸钠、1:1000β-巯基乙醇(均为Gibco)的RPMI中的培养物中。IL-33处理增强了ILC2充足的小鼠和ILC2缺陷型小鼠之间的差异，其中如通过Luminex珠测定法分析的分泌谱显示，ILC2缺陷型小鼠中若干种细胞因子和趋化因子的水平增加。

ILC2缺陷型小鼠中的这种“过度激活的”小胶质细胞状态可通过ILC免疫抑制作用的丧失来解释，所述ILC免疫抑制作用可适宜地增强对小胶质细胞的去抑制。然而，另选地，渗漏的血脑和/或血CSF屏障(BBB、BCB)也可导致正常外周限制的免疫刺激因子的实质水平增加并导致小胶质细胞的“过度激活”。第一种情形将与ILC的直接免疫调节作用一致，并且第二种情形与肠道ILC类似脑膜ILC可参与调节屏障功能的替代可能性一致。为了全面地询问这些可能性，表征对适应性免疫激发和先天免疫激发两者的应答。选择涉及CNS的直接自身免疫性攻击的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)作为适应性模型，然而选择局部施用咪喹莫德(IMQ)(显示诱导皮肤和脑部炎症两者的免疫刺激剂)以检查脑边缘处的先天效应物(包括ILC和小胶质细胞)之间的相互作用。

据发现，ILC缺陷型小鼠的EAE严重性增加与T细胞无法在脑膜中停滞相关。简言之，将从Mog

在Rag2

另外，ILC缺陷型小鼠显示出脱离皮肤与脑对局部IMQ的应答。广泛局部使用以在啮齿动物模型中诱导银屑病皮肤炎症的TLR7/8激动剂IMQ也显示促进剧烈的小胶质细胞应答和脑的免疫浸润。加上Rag2

比较了野生型小鼠、Rag2

虽然实质微出血和免疫浸润可被视为宏观水平上完整性的有效量度，但也评估了BBB对亚细胞颗粒的通透性的变化。用伊文斯蓝染料的经心脏注射监测IMQ处理，伊文斯蓝染料通常被完整的血脑和血CSF屏障(BCB)排除在脑之外。与细胞浸润的测量一致，与Rag2-/-对照相比，来自ILC缺陷型小鼠的脑显示出增加水平的实质伊文斯蓝染色(图7F)。

为了探测ILC2对小胶质细胞的特异性作用，将ILC2或PBS(对照)被动静脉内传输到Rag2

每天向Rag2

除了以1ul/10

将所分选的细胞以1×10

向雌性Rag2

传输后五周，所有动物均显示ILC2移入到脑膜(图2)、肺和股骨骨髓中，其中所移入的细胞采用对应于过继组织的差异标记标签。来自具有ILC2脑膜移入的小鼠的小胶质细胞相对于PBS对照显示出激活标记的减少(参见例如图6A-图6I)。在ILC2传输的小鼠的海马体中小胶质细胞密度可能由于激活减少而降低。

外周组织中的ILC2已显示被警报素激活(Vannella等人,2016,Sci Transl Med.,8(337):337ra65)。先前已显示IL-33激活脑膜ILC2(Gadani等人,J Exp Med.2017；214(2):285-296)，并且通过对IL-33处理的小鼠的窦中的Gata3

为了询问mILC2的全转录组，向小鼠(n＝20/组和2个独立组)注射PBS、rIL-25或rIL-33(两者均为0.033mg/kg)。然后分选mILC2，提取RNA，并进行RNAseq分析。分层聚类显示处理与PBS组之间存在明显差异。根据纯度测试可以预知，分层聚类反映了经典ILC2相关因子的患病率(图1F、图1G

为了确认转录数据，使用多种方法探测IL-10蛋白产生。首先，从IL-33处理的小鼠中分选脑膜ILC2，将其维持在具有IL-2和IL-7的培养物中，并且然后用IL-33再刺激。FACS分析显示这些细胞表达ST2并且对于IL-5、IL-13以及IL-10呈强阳性(图1H)；培养上清液的Luminex分析证实了IL-10释放(图1I)。为了排除细胞培养伪迹的可能性，接下来从IL-33处理的小鼠中急性分离细胞，通过细胞内标记揭示出显著部分的脑膜ILC2为IL-10阳性(图1J)。最后，使用IL-10抗体捕获试剂对来自IL-33处理的Rag2

在上述实验中，还从非脑膜组织中急性分离ILC2以用于比较。令人惊讶的是，来自颅盖、胫骨和肺的ILC2也显示出IL-10的阳性标记(数据未示出)，表明ILC的IL-10产生可能不像先前提出的那样受到组织限制。基于这些观察结果，测试了人ILC2的IL-10能力。为此，从健康供体血液中分选CD45

接下来，将mILC2和小胶质细胞一起共培养以确定ILC2的IL-10产生是否抑制小胶质细胞激活。首先，从IL-33处理的小鼠中分选ILC2，并且从原始态小鼠中分选小胶质细胞。然后，将小胶质细胞单独培养、或与ILC2一起培养、或与ILC2上清液一起培养，之后进行LPS刺激。为了结合仍存在于上清液中的IL-33和阻断其对小胶质细胞(该小胶质细胞也表达IL-33的受体)的直接作用，可溶性ST2以300ng/ml的浓度包含在所有条件中。

如通过Luminex所测量，含有ILC2或ILC2上清液的孔中的IL-5、IL-13和IL-10蛋白水平高于在具有/不具有LPS的情况下仅包含小胶质细胞的孔。与单独的上清液相比，用上清液和LPS处理的小胶质细胞中IL-10和IL-13两者的水平降低，这表明激活的小胶质细胞对IL-10和IL-13的活性消耗和受体结合。这种解释通过没有观察到IL-5水平差异的观察结果得到强化，小胶质细胞不表达针对IL-5的受体。还分析了几种其他细胞因子和趋化因子，其中一些显示出被ILC2或ILC2上清液接近完全抑制(例如IL-6)以及其他部分抑制(TNF-α)或无抑制(CXCL10)，表明存在特异性而不仅仅是对小胶质细胞具有毒性的因子。为了特异性地确定IL-10介导的作用，将实验用所添加的IL-10(300ng/ml)和IL10ra(300ng/ml)中和抗体重复24小时。IL-10中和消除了对小胶质细胞应答的抑制，如通过升高细胞因子和趋化因子水平的再出现所证实的。此结果强烈表明ILC2来源的IL-10主要负责观察到的小胶质细胞抑制。

为了确认人ILC2细胞可产生IL-10，如鼠ILC2中所观察到的，这是用人细胞进行的类似实验。从六个独特的正常人血供体中分选ILC2(Lin-IL7ra+CRTH2+CD161+)，并将其在具有和不具有IL-33刺激的情况下在类似于鼠ILC2的条件下培养，并且使用Luminex珠测定法分析上清液中的细胞因子含量。来自六位供体中的五位供体的ILC2显示出在IL-33刺激后IL-10(和作为阳性对照的IL-13)水平增加。这表明人ILC2能够产生IL-10。为了探测ILC2是否在产生IL-10的能力方面独特，获得另外的样品，但这次针对ILC1、ILC2和ILC3进行分选。将细胞在视情况而定含有因子以增强ILC1、ILC2或ILC3亚型(分别为IL-12+IL-15、IL-33和IL-1b+IL-6+IL-23)的培养基中孵育。如前所述测量所有三种细胞类型的上清液中的细胞因子水平。含有ILC2的孔显示出比含有ILC1或ILC3的孔显著更多的IL-10和IL-13。来自一个供体的ILC3上清液显示出IL-10，表明ILC3也可能是IL-10产生者的可能性。这些结果提供了人ILC(以及尤其是ILC2)能够产生IL-10的另外证据。

从IL-33处理的小鼠分离ILC2并从原始态小鼠分离小胶质细胞，测试ILC2抑制小胶质细胞炎性因子的能力。将小胶质细胞单独培养、直接与ILC2一起培养、或与来自ILC2的上清液一起培养，随后用含有R848、TLR7/8激动剂(类似于IMQ并非常适合于细胞培养)的培养基、或无激动剂的对照培养基培养。包含可溶性ST2以便阻断来自ILC2上清液的IL-33对ST2+小胶质细胞的任何可能的直接作用。IL-5、IL-13和IL-10全部从含有ILC2(扩展数据)或ILC2上清液的孔测量到，但在来自仅含有小胶质细胞的孔的上清液中检测不到(IL-5、IL-13)或几乎检测不到(IL-10)(图5A)，表明小胶质细胞不是这些因子的显著来源。还测量了几种其他细胞因子和趋化因子，异质抑制模式表明具有特异性(图5B)。由于ILC2和上清液两者均显示出类似的作用，因此推断可溶性因子可能代替直接的细胞接触。除了促炎性细胞因子之外，小胶质细胞还通过胞外基质组分的酶促降解产生基质金属蛋白酶(Mmp)以及具体地讲神经毒性关键参与者Mmp9和BBB25-27。继而，Mmp被金属蛋白酶(Timp)家族的组织抑制剂成员反向调节。根据RNAseq，Timp1信息在激活的ILC2中高度(6.7Log2倍数，调节的p<0.02)上调，并且通过IL-33激活的ILC2的上清液的蛋白质分析得到确认(图5C)。可以预知，小胶质细胞在R848激发后显示出Mmp9产生的强烈增加(图5D)，然后Mmp9被来自激活的ILC2的上清液有效抑制(图5E)。

为了通过ILC2上清液探测IL-10在抑制这些因子中的重要性，接下来在测定中包括针对IL-10和IL-10rα的中和抗体。仅抗体处理的孔中IL-10信号的几乎完全消融表明抗体阻断是有效的(图5F)。因此，IL-10中和消除了抑制，如通过升高的细胞因子和趋化因子(图5G)水平的再出现所证实的。可以预知，ILC2、小胶质细胞与Mmp9的调控之间的关系在IL-10和Timp1方面在一定程度上更复杂。在若干种系统中显示，Mmp9的产生直接由IL-10负调控，但也由Timp1负调控，Timp1本身可由IL-1031诱导。Timp1也显示以自分泌以及旁分泌的方式起作用。因此，预期IL-10和Timp1的组合将在不存在Timp1的情况下显示出优于IL-10的Mmp9抑制。为了支持这一点，rmIL-10确实抑制了Mmp9，但程度低于完全ILC2上清液(图5H)。在这种可能性的进一步测试中，将来自Il10-/-小鼠的ILC2上清液与来自野生型小鼠的ILC2对未刺激和R848刺激的小胶质细胞的作用就总Timp1蛋白分泌而言进行比较，并且发现IL-10的存在导致在任一条件下的Timp1水平增加(图5I)。Mmp9/Timp1比率表明IL-10与Timp1之间的协同作用，其中IL-10和IL-10ra阻断足以强烈消除由ILC2上清液介导的抑制(图5J)。

总体而言，这些数据表明，脑膜ILC2可能以多种方式起作用，不仅抑制促炎性细胞因子和趋化因子产生，而且还抑制Mmp(包括Mmp9)对BBB的降解。IL-10还被建议直接作为Mmp9的抑制剂起到双重作用并且也间接通过Timp1起到双重作用。RNAseq数据突出显示为在激活的脑膜ILC2中上调的其他因子(例如，双向调节因子、精氨酸酶)也可能在BBB保护和神经炎症抑制中起作用并需要进一步研究。

为了测试单独的ILC2是否可在体内影响小胶质细胞表型并抑制神经炎症，并且为了排除在Rag2

为了检查这一点，也在IMQ激发之前进行ILC2的过继传输。当对全脑样品的髓样细胞进行分选时，小胶质细胞(CD11b+CD45Mid)数量在各组之间显示无差异(数据未示出)，然而来自ILC2移入的小鼠的脑包含比来自ILC缺陷型对照小鼠的脑显著更少的单核细胞(CD11b+CD45HiLy6cHi)，表明ILC2补充足以钝化浸润(图6E)。也从脑中分选每只小鼠相等数量的小胶质细胞，将其置于培养物中，并且针对分泌的因子分析上清液，揭示来自ILC2移入小鼠的脑的小胶质细胞显示出受抑制的谱——主要在趋化因子水平方面(图6F)。

此外，为了确定IL-10的阻断是否将影响ILC2传输抑制细胞浸润和小胶质细胞炎症的能力，重复上述实验，但在IMQ处理的第2天和第3天注射针对IL-10的中和抗体。类似于体外实验，IL-10阻断消除了ILC2传输对小胶质细胞的促炎性因子释放的抑制影响(图8)。最后，用野生型或Il-10

总之，这些结果表明，ILC2分泌的因子可能在保护微妙的CNS组织的屏障的强化方面和在相关的小胶质细胞炎症的抑制方面起到可能的若干机制作用中的一种作用。实际上，此类活性将与其中IL-10也起到显著作用的外周粘膜组织(如肠道)中所显示的ILC介导的屏障调控一致。

本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的广义的发明构思的情况下，可对上述实施方案作出修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖在本发明实质和范围内的修改，如本说明书所定义。