一种凯伦藻科多物种的快速检测方法

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，一种凯伦藻科多物种的快速检测方法。

背景技术

凯伦藻科(Kareniaceae)是甲藻门中较近建立的一个新科，凯伦藻科种类广泛分布于全球各大海域，到目前为止，已报道3属30个种。由于该科是有毒有害甲藻种类较为聚集的一个类群，且大部分种类频发藻华，严重威胁近海海域生态安全和水产养殖，因而备受各方关注。从20世纪90年代开始，我国近海海域也逐渐成为凯伦藻藻华的重灾区，凯伦藻曾引发我国最严重的几次藻华事件，给沿海地区造成了巨大的经济损失。研究凯伦藻赤潮，进行赤潮预警和日常监测，对于减少水产养殖业损失，保护海洋生态环境，有着重要的实际意义。

对赤潮进行预测首要问题是对引起赤潮的藻类进行检测。形态鉴别是传统的鉴别方法，但由于一些藻类的不同种属的形态差别甚微，难以准确鉴别。另一方面，环境对藻类的形态有很大的影响，鉴定到种存在的困难很多。目前，利用分子生物学手段检测微藻的方法日渐成熟，这些方法从分子水平解决了某些从形态上难以区分的藻类分类和鉴定问题。目前针对赤潮原因种的分子鉴定方法的研究已有很大进展，但针对引发赤潮的凯伦藻科多物种的分子鉴定技术尚待发展，因此需要建立一种特异稳定的、适用于凯伦藻绝大多数物种的早期监控及检测的技术手段。

发明内容

本发明目的在于提供一种检测速度快、特异性高、灵敏稳定的快速检测凯伦藻科多物种的快速检测方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种快速检测凯伦藻科多物种的引物对，凯伦藻属特异性引物为：

上游引物KMF2 5′-ATTGTGMACCAYCTKMTGT-3′，

下游引物KMR1 5′-ACAAGWTGACAGTGGCATG-3′；

卡尔藻属和塔卡藻属特异性引物为：

上游引物KAKVF1 5′-AYTGTGAMCYWCTTYGTGAG-3′，

下游引物KAKVR2 5′-ACMCMTGACAGCACCAAG-3′。

一种快速检测凯伦藻科多物种的试剂盒，所述试剂盒含所述引物对。

一种凯伦藻科多物种的快速检测方法，利用所述的凯伦藻属、卡尔藻属和塔卡藻属的特异性引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对海水中的凯伦藻科多物种进行检测；

其中，凯伦藻属特异性引物为：

上游引物KMF2 5′-ATTGTGMACCAYCTKMTGT-3′，

下游引物KMR1 5′-ACAAGWTGACAGTGGCATG-3′；

卡尔藻属和塔卡藻属特异性引物为：

上游引物KAKVF1 5′-AYTGTGAMCYWCTTYGTGAG-3′，

下游引物KAKVR2 5′-ACMCMTGACAGCACCAAG-3′。

以海水样品中藻基因组总DNA为模版，利用两对特异性引物通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳对海水中的凯伦藻科多物种进行检测。

所述PCR反应体系为：反应总体积为20μL，包括基因组DNA 1μL，Fly Buffer 4μL，dNTP1.6μL，TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase0.4μL(Transgen)，引物各0.4μL(浓度10μM)，最后加灭菌去离子水至20μL。

所述PCR反应程序为95℃预变性2min；95℃变性15s，49℃退火20s，72℃延伸15s，35个循环；72℃终延伸5min。

利用引物KMF2和KMR1对样品进行检测，待400bp左右出现条带，即样品中含凯伦藻；利用引物KAKVF1和KAKVR2对样品进行检测，待400bp左右出现条带，即样品中含卡尔藻或塔卡藻。

本发明所具有的优点：本发明检测方法采用核糖体DNA内转录间隔区(ITS)为目标基因，选取凯伦藻科多物种具有较高特异性的靶基因区域，根据该区域序列设计特异的兼并引物，采用基于核酸扩增的PCR技术进行检测，具有快速、特异性强、灵敏、检测范围宽等优点。

附图说明

图1为本发明实施例提供的KAKV和KM引物工作温度梯度电泳图，其中，1：47

图2为本发明实施例提供的KAKV和KM检出范围测定电泳图，其中，1：DNA模板10ng/μL；2：DNA模板2ng/μL；3：DNA模板0.4ng/μL；4：DNA模板0.08ng/μL；5：DNA模板16pg/μL；6：DNA模板3.2pg/μL；7：DNA模板0.64pg/μL；8：DNA模板0.128pg/μL；9：DL2000分子量标准；KAKV：卡尔藻属和塔卡藻属特异性引物；KM：凯伦藻属特异性引物。

图3为本发明实施例提供的对不同藻株检测电泳图，其中，1：A.pacificum；2：P.donghaiense；3：Chattonella sp.；4：H.akashiwo；5：A.anophagefferens；6：G.catenatum；7：Amphidinium sp.；8：S.trochoidea；9：S.costatum；10：P.tricorntum；11：C.closterium；12：P.globosa；13：I.galbana；14：Chlorella sp.；15：A.sanguinea；16～19：实验室分离培养的Karlodinium veneficum；20：Karlodinium veneficum；21：Takayamaxiamenensis；22：Karenia mikimotoi；23：DL2000分子量标准；KAKV：卡尔藻属和塔卡藻属特异性引物；KM：凯伦藻属特异性引物。

图4为本发明实施例提供的实际样品检测电泳图，其中1：LYG6；2：LYG8；3：FJ6；4：L2；5：L3；6：Karlodinium veneficum；7：Takayama xiamenensis；8：Karenia mikimotoi；9：DL2000分子量标准。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

实施例1

1.ITS序列获取：提取9株不同凯伦藻的基因组DNA作为模板，扩增引物为LH2：5′-AGGTGAACCTGCGGAAGGATC-3′和Dlam：5′-CCTGCAGTCGACAKATGCTTAARTTCAGCRGG-3′，以核糖体DNA转录单元内间隔区(ITS)为目标基因序列，进行PCR扩增，PCR扩增后将扩增产物分别与pMD18-T载体连接,转化感受态E.coli DH5α，挑选阳性克隆由公司进行测序，对测定序列去载体，Blast分析等，最终获得9株凯伦藻的ITS序列。

2.引物设计：将获得的ITS序列与从GenBank数据库下载的凯伦藻科3个属代表物种(19株)和凯伦藻科系统发育关系较近物种(4株)的已知ITS序列进行多序列比对(Multiple Alignment)，根据比对结果，设计引物。其中，凯伦藻属特异性引物为：上游引物KMF2 5′-ATTGTGMACCAYCTKMTGT-3′，下游引物KMR1 5′-ACAAGWTGACAGTGGCATG-3′；卡尔藻属和塔卡藻属特异性引物为：上游引物KAKVF1 5′-AYTGTGAMCYWCTTYGTGAG-3′，下游引物KAKVR2 5′-ACMCMTGACAGCACCAAG-3′。

3.Gradient PCR确定最佳扩增温度：反应体系：基因组DNA 1μL(≈10ng/μL)，FlyBuffer 4μL，dNTP1.6μL，TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase 0.4μL(Transgen)，引物各0.4μL(浓度10μM)，最后加灭菌去离子水至20μL。PCR反应程序：95℃预变性2min；95℃变性15s，46-61℃退火20s，72℃延伸15s，35个循环；72℃终延伸5min。

PCR产物利用Mupid-One电泳仪进行琼脂糖凝胶电泳(参见图1)，上样量为4μL，根据电泳结果确定两对引物的最佳工作温度为49℃。根据检测结果，引物具有较好的种属特异性，即KAKV引物可以特异性扩增卡尔藻属和塔卡藻属物种的ITS区域，而不会扩增凯伦藻属物种的ITS区域；KM引物可以特异性扩增凯伦藻属物种的ITS区域，而不会扩增卡尔藻属和塔卡藻属物种的ITS区域。

实施例2

按照上述实施例获得最适工作温度对剧毒卡尔藻、厦门塔卡藻和米氏凯伦藻的检出范围进行测定：

以实施例1记载的PCR体系以及扩增温度：反应体系：基因组DNA 1μL(≈10ng/μL)，Fly Buffer 4μL，dNTP1.6μL，TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase 0.4μL(Transgen)，引物各0.4μL(浓度10μM)，最后加灭菌去离子水至20μL。PCR反应程序：95℃预变性2min；95℃变性15s，49℃退火20s，72℃延伸15s，35个循环；72℃终延伸5min

将上述实施例获得对剧毒卡尔藻、厦门塔卡藻和米氏凯伦藻基因组DNA模板以5倍稀释倍数进行逐级稀释，获得不同浓度的DNA溶液，即，DNA模板10ng/μL；DNA模板2ng/μL；DNA模板0.4ng/μL；DNA模板0.08ng/μL；DNA模板16pg/μL；DNA模板3.2pg/μL；DNA模板0.64pg/μL；DNA模板0.128pg/μL；而后进行PCR扩增检测，由图2可见确定最低检出限为3.2pg/μL，即PCR管内含有0.16pg目标藻DNA即可检出(1μL模板，20μL扩增体系)。

实施例3引物特异性试验

本实施例对太平洋亚历山大藻(Alexandriumpacificum)、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、卡盾藻(Chattonella sp.)、赤潮异弯藻(Heterosigmaakashiwo)、抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)、链状裸甲藻(Gymnodiniumcatenatum)、前沟藻(Amphidinium sp.)、锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricorntum)、新月柱鞘藻(Cylindrotheca closterium)、球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、小球藻(Chlorella sp.)、红色赤潮藻(Akashiwo sanguinea)米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、厦门塔卡藻(Takayama xiamenensis)和剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum)为例，分别提取各藻的基因组DNA，以此为模板，特异性引物为：上游引物KMF2 5′-ATTGTGMACCAYCTKMTGT-3′，下游引物KMR1 5′-ACAAGWTGACAGTGGCATG-3′；或，特异性引物为：上游引物KAKVF1 5′-AYTGTGAMCYWCTTYGTGAG-3′，下游引物KAKVR25′-ACMCMTGACAGCACCAAG-3′。同时按照实施例1获得PCR体系以及最适扩增温度进行扩增，而经琼脂糖凝胶电泳，参见图3，经琼脂糖凝胶电泳只有米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、厦门塔卡藻(Takayama xiamenensis)和剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum)(正对照)的基因组DNA在DNA分子量标准的≈400bp处有扩增条带，其他微藻在400bp左右没有扩增条带。

实施例4

取连云港和秦皇岛等地的凯伦藻藻华暴发地区的海水样品进行检测，L2和L3是采自秦皇岛赤潮爆发期的样品，LYG6和LYG8是采自海州湾塔卡藻赤潮爆发区的样品，提取1升各海水样品的DNA，利用实施例1记载的引物和扩增条件进行检测(参见图4)，检测结果如图4所示，LYG6和LYG8是采自海州湾塔卡藻赤潮爆发区的样品，利用卡尔藻属和塔卡藻属特异性引物KAKV检测确实存在塔卡藻；L2和L3是采自秦皇岛赤潮爆发期的样品，经凯伦藻属特异性引物KM检测有凯伦藻存在。环境样品检测在很大程度说明本发明方法具有一定的实用价值。

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 一种凯伦藻科多物种的快速检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Thr Thr Gly Thr Gly Met Ala Cys Cys Ala Tyr Cys Thr Lys Met

1 5 10 15

Thr Gly Thr

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Cys Ala Ala Gly Trp Thr Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys

1 5 10 15

Ala Thr Gly

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Tyr Thr Gly Thr Gly Ala Met Cys Tyr Trp Cys Thr Thr Tyr Gly

1 5 10 15

Thr Gly Ala Gly

20

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Cys Met Cys Met Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala

1 5 10 15

Ala Gly