技术领域
本发明涉及一种用于检测多西他赛和顺铂预期疗效及毒负作用相关基因位点高效分型的方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
现有的随着全球生命科学领域的快速发展，药物疗效及毒负作用已成为医学界的热点问题。由于药物的不良反应，对患者的治疗带来巨大的隐患。
近年来，大量临床研究表明每一种化疗药物都有与其对应的评估其作用的靶标，如CASP7、ABCC2、TP53、ERCC1等基因。这些基因的表达水平和多态性可以科学地预测多西他赛和顺铂的预期疗效及毒负作用，提高治疗的针对性，为临床用药提供指导。
多西他赛（Docetaxel），为M期周期特异性药物，促进小管聚合成稳定的微管并抑制其聚解，从而使小管的数量显著减少，并可破坏微管网状结构。对晚期乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌有较好的疗效。对头颈部癌、胰腺癌、小细胞肺癌、胃癌、黑色素瘤、软组织肉瘤也有一定的疗效。
顺铂，能与DNA结合，引起交叉联结，从而破坏DNA的功能，并抑制细胞有丝分裂，为一种细胞非特异性药物。抗瘤谱较广，用于头颈部鳞癌；卵巢癌；胚胞性癌；精原性细胞瘤；肺癌；甲状腺癌；淋巴肉瘤及网状细胞肉瘤等。
现有基因检测技术主要有荧光PCR法、荧光芯片法、Sanger测序、二代测序等，都存在一定的缺陷；所述荧光PCR法的通量低而且成本高；Sanger测序的操作繁琐，通量低；二代测序成本非常高。
发明内容
针对上述存在的技术问题，本发明的目的是：提出了一种用于检测多西他赛和顺铂预期疗效及毒负作用相关基因位点高效分型的方法及其应用，可以对基因位点进行快速、准确的检测。
本发明的技术解决方案是这样实现的：一种用于基因位点高效分型的方法，包括以下步骤：
步骤一：确定检测位点信息，构建检测位点表；
步骤二：根据所述检测位点表确定待测SNP位点；
步骤三：针对所述待测SNP位点设计PCR扩增引物1st-PCRP、2nd-PCRP及单碱基延伸引物UEP_SEQ，并构建测位点检测序列信息表；
步骤四：根据所述测位点检测序列信息表合成待测位点PCR的扩增引物，扩增引物经过HPLC纯化和质谱质检；
步骤五：配置PCR反应体系、SAP反应体系和延伸反应体系；将所有所述待测位点PCR的扩增引物混合成工作液；
步骤六：采集待测生物的待测样本并提取备用，待测样本通过工作液和PCR反应体系进行扩增反应，得到扩增反应产物；
步骤七：所述扩增反应产物通过SAP反应体系进行SAP反应，得到SAP反应产物；
步骤八：所述SAP反应产物通过延伸反应体系进行单碱基延伸反应，得到延伸反应产物；
步骤九：所述延伸反应产物通过树脂进行脱盐纯化，得到检测样品；
步骤十：对检测样品进行激发，获得数据并分析数据，得到结果。
在一种优选的方案中，所述待测样本包括待测生物的全血、唾液或者其他组织的样本DNA。
在一种优选的方案中，所述步骤五中的PCR反应体系、SAP反应体系和延伸反应体系的试剂体积比为5：2：2。
在一种优选的方案中，所述步骤五中的PCR反应体系中的试剂包括Water,HPLCgrade、0 x PCR Buffer 20mM MgCl2、25mM MgCl2、25mM dNTP Mix、0.5 uM Primer Mix和5U/µl PCR Enzyme；所述Water,HPLC grade、0xPCR Buffer 20mM MgCl2、25mM MgCl2、25mMdNTP Mix、0.5 uM Primer Mix和5U/µl PCR Enzyme的试剂体积的体积比分别为8：5：4：1：10：2：2：5；
所述步骤六中扩增反应的反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共进行循环45次；72℃延伸5min；4℃保温。
在一种优选的方案中，所述步骤五中的SAP反应体系中的试剂包括NanopureWater,Autoclaved、SAP Buffer和SAP Enzyme(1.7U/ul)；所述Nanopure Water,Autoclaved、SAP Buffer和SAP Enzyme(1.7U/ul)的体积比为153：17：30；
所述步骤七中SAP反应的反应程序为：37℃时长20min；85℃时长5min；4℃保温。
在一种优选的方案中，所述步骤五中的延伸反应体系中的试剂包括Nanopurewater、iPLEX Buffer、iPLEX Termination mix、Extend Primer Mix和iPLEX Enzyme( x1.2倍)；所述Nanopure water、iPLEX Buffer、iPLEX Termination mix、Extend PrimerMix和iPLEX Enzyme( x 1.2倍)的体积比为619：200：200：940：41。
在一种优选的方案中，所述单碱基延伸反应的反应程序为：94℃时长30s；94℃时长5s，内循环5次，共进行循环40次，所述内循环为52℃时长5s，80℃时长5s；72℃时长5min；4℃保温。
在一种优选的方案中，所述位点检测序列信息表中PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的末端增加有通用序列ACGTTGGATG。
本发明的另一个目的在于一种基因位点高效分型的方法在多西他赛和顺铂的预期疗效及毒负作用的应用。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明的一种本发明主要基于Agena Bioscience的MassARRAY分型系统，对多西他赛和顺铂的预期疗效及毒负作用相关基因位点进行快速、准确的检测；通过对基因检测的结果的分析，提高药物的疗效，降低药物的毒副作用反应，同时减轻病人的痛苦和经济负担；本发明操作流程简单、检测准确性高、检测通量高并且检测成本低；通过仪器判断读取数据，结果分析方便，判读标准明确，花费时间短；操作方便，具有市场实际可应用性。
附图说明
下面结合附图对本发明技术方案作进一步说明：
附图1为本发明的一种用于基因位点高效分型的方法的实验步骤图；
附图2为本发明的检测位点表；
附图3为位点检测序列信息表；
附图4为位点rs25487的分型图。
具体实施方式
下面结合附图来说明本发明。
请参照图1，一种用于基因位点高效分型的方法，包括以下步骤：
步骤一：确定检测位点信息，构建检测位点表，如图2所示；
首先确定需要检测的基因，包括CASP7、CASP7、ABCC2、ERCC1、XRCC1、TP53、GSTP1、XPC、TP53、ERCC1、ERCC1、GSTP1；所述基因的位点分别是rs4353229、rs7921977、rs12762549、rs3212986、rs25487、rs1042522、rs1695、rs2228001、rs1042522、rs3212986、rs11615、rs1695；根据基因、位点、染色体以及用途构建检测位点表。
步骤二：根据所述检测位点表确定待测SNP位点；
待测SNP位点为rs4353229、rs7921977、rs12762549、rs3212986、rs25487、rs1042522、rs1695、rs2228001、rs1042522、rs3212986、rs11615、rs1695中的一种或多种。
步骤三：针对所述待测SNP位点设计PCR扩增引物1st-PCRP、2nd-PCRP及单碱基延伸引物UEP_SEQ，并构建测位点检测序列信息表，如图3所示；其中PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的末端增加通用序列ACGTTGGATG，增强引物特异性及扩增效率；单碱基延伸引物及其产物按照分子量的差值大于16道尔顿的原则进行设计；
所述rs4353229、rs7921977、rs12762549、rs3212986、rs25487、rs1042522、rs1695、rs2228001、rs1042522、rs3212986、rs11615、rs1695的1st-PCRP分别为ACGTTGGATGCAGGATAAGGAGCAGGGTTG、ACGTTGGATGCCCTTTAGCGAAAGCGAAAC、ACGTTGGATGTTTAGTTCCTCAGTTTCCCG、ACGTTGGATGAACTGGTGGGTGCCCCTCTA、ACGTTGGATGATAGTCGGGAATTACGTCGC、ACGTTGGATGTGGACATGGTGAATGACGGC、ACGTTGGATGTACCACCAATTGCAGTGGAC、ACGTTGGATGTAGGTTTTCTGGGAAGGGAC、ACGTTGGATGCATTGGAGAGGTTTGAGGTC；2nd-PCRP分别为ACGTTGGATGCCAAGTACAGCCAGGTCCTA、ACGTTGGATGTCGCTTTGGGCTCTTCCAC、ACGTTGGATGCACTGAATTCAGAGTCTGGG、ACGTTGGATGGCCTCAAAACCGAGAAGATG、ACGTTGGATGGTGGTTATCAAGGGTCATCC、ACGTTGGATGTTTCTTTGTTCAGCCCCCAG、ACGTTGGATGGGTGACTGTGTAACTTTCTC、ACGTTGGATGAGATGAAGCTCCCAGAATGC、ACGTTGGATGCATGCCTGGCTGCTATTTAG、UEP_SEQ分别为GGCGGCTGCCCTCCC、CTGCGGAGCGCACTA、GGACAAGAAGCGGAAG、ACCTGTTCCCATTTGAG、ACTGAAGTTCGTGCGCAA、TGGTGTAGATGAGGGAGA、ATACATGCAACAGAAGTGAC、tccTGCCAGAGGCTGCTCCCC、AACTTATGGGAGTTGATTACCT、
步骤四：根据所述测位点检测序列信息表合成待测位点PCR的扩增引物，扩增引物经过HPLC纯化和质谱质检；
步骤五：配置PCR反应体系、SAP反应体系和延伸反应体系；将所有所述待测位点PCR的扩增引物混合成工作液；所述工作液单一引物浓度为0.5μM至1μM；
所述PCR反应体系中的试剂包括Water,HPLC grade、0 x PCR Buffer 20mMMgCl2、25mM MgCl2、25mM dNTP Mix、0.5 uM Primer Mix和5U/µl PCR Enzyme；所述Water,HPLC grade、0xPCR Buffer 20mM MgCl2、25mM MgCl2、25mM dNTP Mix、0.5 uM Primer Mix和5U/µl PCR Enzyme的试剂体积的体积比分别为8：5：4：1：10：2：2：5。
所述SAP反应体系中的试剂包括Nanopure Water, Autoclaved、SAP Buffer和SAPEnzyme(1.7U/ul)；所述Nanopure Water, Autoclaved、SAP Buffer和SAP Enzyme(1.7U/ul)的体积比为153：17：30。
所述延伸反应体系中的试剂包括Nanopure water、iPLEX Buffer、iPLEXTermination mix、Extend Primer Mix和iPLEX Enzyme( x 1.2倍)；所述Nanopure water、iPLEX Buffer、iPLEX Termination mix、Extend Primer Mix和iPLEX Enzyme( x 1.2倍)的体积比为619：200：200：940：41。
步骤六：采集待测生物的待测样本并提取备用，所述待测样本包括待测生物的全血、唾液或者其他组织的样本DNA；待测样本通过工作液和PCR反应体系进行扩增反应，得到扩增反应产物；
所述扩增反应的反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共进行循环45次；72℃延伸5min；4℃保温。
步骤七：所述扩增反应产物通过SAP反应体系进行SAP反应，得到SAP反应产物；
所述SAP反应的反应程序为：37℃时长20min；85℃时长5min；4℃保温。
步骤八：所述SAP反应产物通过延伸反应体系进行单碱基延伸反应，得到延伸反应产物；
所述单碱基延伸反应的反应程序为：94℃时长30s；94℃时长5s，内循环5次，共进行循环40次，所述内循环为52℃时长5s，80℃时长5s；72℃时长5min；4℃保温。
步骤九：所述延伸反应产物通过树脂进行脱盐纯化，得到检测样品；
所述脱盐纯化过程包括：
步骤一：将洁净树脂铺平在96/15mg或384/6mg的样品板上，并风干；
步骤二：在样品板中加水，96孔板加入41ul水，384孔板加入16 ul水；
步骤三：将干燥的树脂倒入所述样品板中，封膜，放在旋转器上颠倒摇匀15分钟；
步骤四：以3200g（标准板离心机的4000 rpm）将样品板离心5分钟。
步骤十：对检测样品进行激发，获得数据并分析数据，得到结果；请参照图4，图4为位点rs25487的分型图；
启动点样仪，将检测样品点样到芯片上；利用质谱仪对点样的芯片进行激光解吸电离，获得数据后通过软件进行数据分析，各个位点的碱基型经过分析后得到分型图和分子量峰图，并保存至csv数据文件；分型结果判读方法参照各位点指示标记。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
机译： 评估与MetAP2表达相关的卵巢癌中顺铂耐药性，疾病进展和治疗效果的方法
机译： 用于检测个体血管疾病的方法，检测个体NCER的方法，用于治疗患有疾病血管疾病的个体的方法，用于确定抗高血压治疗血管生成素的有效性的可能性，用于确定在调节血管生成调节剂n ecveis血小板中进行测试的疗法的有效性，用于创建针对疾病或紊乱血管生成血小板的记录或特征并用于监测具有u的个体治疗的疗效。一种疾病或血管疾病
机译： 一种高效，分阶段的方法，用于处理大量电子数据，称为“最佳匹配优先”™，适用于电子发现和其他相关应用
