多通道混合器的应用及连续批量制备脂质体的方法

技术领域

本发明涉及脂质体制备技术领域。更具体地说，本发明涉及一种多通道混合器的应用及连续批量制备脂质体的方法。

背景技术

由磷脂等类脂形成的双分子层的完全封闭的单层或多层囊泡被称作脂质体，其结构和构成成分与细胞膜相似。脂质体膜可插至细胞膜的脂质层中，然后释放出包埋物到细胞内，这便使细胞周围的包埋物的浓度升高，通过扩散慢慢渗透至细胞中，尤其当其成分脂质来自天然来源时。脂质体已被证明具有生物相容性、生物可降解性、无毒或轻度毒性、灵活性和非免疫原性，被广泛应用于体内和体外给药的药剂配方、护肤品配方、保健品配方等，用于包埋和递送具有生物活性的疏水和亲水分子。

传统生产脂质体的方法为薄膜水化法、溶剂蒸发法、乙醇注射法等，随后再通过高压均质、膜过滤等工序，以降低脂质体尺寸和提高其单分散性。这些传统制备方法工艺复杂，生产时间长，产量严格受批次体积量影响，且制备过程中需要高能输入如超声和高压。工业生产和实际应用场景中急需一种快速制备脂质体的方法，以减少成本，并使生产连续化，满足不同的应用场景需求。

为解决上述问题，目前出现了若干种基于乙醇注射(反溶剂混合)和特殊混合方式的脂质体制备方法，包括同轴注射，微流控法等，在一定程度上实现了脂质体的连续批量制备。其中微流控法需要精确控制微流道形貌，采用缓慢的微流控混合，制备效率较低。同轴注射法为近年新出现的方法，将磷脂/胆固醇的乙醇溶液与水通过同轴快速注射的方法混合，用以连续制备颗粒和脂质体。同轴注射法要求磷脂乙醇溶液通道与反溶剂的通道处于同一轴心，且混合时仅能由这两种液体混合，无法实现两种以上液体的混合。同时，该混合方式需要一个较长的注射混合通道，无法实现在较小距离和空间限制范围内的高效快速混合。而且，以上方法在对亲水性物质的包埋效果上不甚理想，很难达到高的包封率和负载率。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种基于多通道混合器连续批量制备脂质体的应用，还提出一种多通道混合器连续批量制备脂质体的方法，以及一种多通道混合器连续批量制备脂质体的方法制备得到脂质体。利用该多通道混合器，可实现超快速制备脂质体的效果，且制备出的脂质体尺寸均一大小可控。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种多通道混合器在连续批量制备脂质体过程中的应用。

本发明还提供一种多通道混合器连续批量制备脂质体的方法，包括以下步骤：

将磷脂等制备脂质体的原料溶解于良溶剂中，在室温条件下搅拌至完全溶解，形成磷脂等制备脂质体的原料的良溶剂溶液；

在多通道混合器的其中一个或几个通道内通入良溶剂溶液，在其余通道内通入反溶剂或反溶剂和亲水性物质形成的反溶剂溶液，使其在多通道混合器的混合腔中快速自组装成脂质体。

优选的是，所述多通道混合器为含有两个或两个以上通道的混合器。

优选的是，所述多通道混合器为包含四个通道的混合器，其中，相对的两个通道采用相同的通入速度。

优选的是，所述良溶剂溶液在其中一个通道内的通入速度为2～6mL/min。

优选的是，所述反溶剂或所述反溶剂溶液在除与其中一个通道相对通道中的其余通道内的通入速度为18～54mL/min。

优选的是，所述良溶剂溶液与所述反溶剂或所述反溶剂溶液的混合时间小于0.1秒。

优选的是，控制多通道混合器混合腔的尺寸、所述良溶剂溶液的通入速度、所述反溶剂或所述反溶剂溶液的通入速度，使雷诺数Re>4000。

本发明还提供一种多通道混合器连续批量制备脂质体的方法得到的脂质体。

本发明至少包括以下有益效果：

本方法运用具有多通道的微型混合器制备脂质体，具有耗能低、高效快速的特点。快速的混合过程使得在分子水平上直接有效的混合，导致脂质体形成物质的快速和均匀的过饱和，过程高效，产量高，通过该方法所制备的脂质体具有尺寸小、尺寸均匀、批次重复性高的特点。且由于混合均匀，磷脂析出和自组装成核迅速，可以生成小于100nm的脂质体，且脂质体尺寸可以通过调节混合速率实现；

多通道混合器各通道溶液通入速度单独可控，一方面操作方便，另一方面可自由控制最终产物中的组分比例、有机溶剂浓度等，使脂质体稳定性更易调控，减小溶剂对包埋物质的影响；

当雷诺数>4000，混合速率已经大于卵磷脂自组装形成脂质体的速率，因此提升混合速率不再影响脂质体生成过程和形貌，混合效果一致；

用这一方法制备的脂质体可实现对水溶性蛋白等亲水性物质的高包封率(>80％)和高负载量(>10％)。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1(A)为本发明其中一个技术方案的三通道混合器结构示意图；

图1(B)为本发明其中一个技术方案的二通道混合器结构示意图；

图1(C)为本发明其中一个技术方案的四通道混合器的结构示意图；

图2为本发明实施例1的四通道混合器的注射混合过程的示意图；

图3(A)为本发明实施例1自组装形成的脂质体的粒径和PDI图；

图3(B)为本发明实施例1自组装形成的脂质体的光散射强度图；

图4(A)为本发明实施例2不同比例的卵磷脂和胆固醇形成的脂质体的粒径和PDI图；

图4(B)为本发明实施例2不同比例的卵磷脂和胆固醇形成的脂质体的光散射强度图；

图5(A)为实施2卵磷脂自组装制备的脂质体的冷冻透射电镜照片；

图5(B)为实施例2卵磷脂：胆固醇质量比为60:40的冷冻电镜照片；

图6(A)为实施例3卵磷脂：人参皂甙质量比为60:40时制备的脂质体强度分布图；

图6(B)为实施例3卵磷脂：人参皂甙质量比为60:40时制备的脂质体的冷冻电镜照片；

图7为实施例4卵磷脂：胆固醇摩尔比为5:3时包封牛血清白蛋白包封率和荷载能力图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明提供一种多通道混合器，该混合器可为三通道混合器、二通道混合器、四通道混合器，分别如图1(A)、图1(B)、图1(C)所示。

<实施例1>

一种多通道混合器连续批量制备脂质体的方法，包括如下步骤：

(1)磷脂的良溶剂溶液的制备：称取900mg卵磷脂溶于30mL无水乙醇中，在室温条件下搅拌1h至完全溶解，形成卵磷脂乙醇溶液，然后将配制好的卵磷脂乙醇溶液、反溶剂去离子水分别吸入针筒。

(2)脂质体制备：通过数字注射泵将配制好的卵磷脂乙醇溶液和去离子水分别连接多通道混合器的1、3通道，在2、4通道分别通入相同的去离子水，1、3通道的通入速度分别为1、2、3、4、5、6mL/min，2、4通道的通入速度分别为9、18、27、36、45、54mL/min，所得脂质体从出口流出，用容器承接。混合过程中，雷诺数Re>4000。

制备过程如图2所示。使用马尔文粒度仪对脂质体进行表征，结果如图3所示，脂质体平均直径和聚合物分散性指数(PDI)随着总流率的增加而减小，直至总流率达60mL/min(Re～4000)颗粒粒径为65nm，PDI稳定分散性指数为0.25，批次重复性好。同时其光散射强度随着总流率的增加而减小，直至总流率达60mL/min(Re～4000)不变。

<实施例2>

一种多通道混合器连续批量制备脂质体的方法，包括如下步骤：

(1)磷脂等制备脂质体的原料的良溶剂溶液的制备：分别取卵磷脂：胆固醇(100：0)、(90：10)、(80：20)、(70：30)、(60：40)质量比共同溶于无水乙醇中，在室温条件下搅拌1h至完全溶解，配制卵磷脂胆固醇乙醇溶液，卵磷脂胆固醇乙醇溶液中卵磷脂和胆固醇的总浓度50mg/mL，然后将配制好的卵磷脂胆固醇乙醇溶液与反溶剂去离子水分别吸入针筒。

(2)脂质体制备：通过数字注射泵将配制好的卵磷脂胆固醇乙醇溶液和反溶剂去离子水分别连接多通道混合器的1、3通道，在2、4通道分别通入相同的去离子水，1、3通道的通入速度为6mL/min，2、4通道的通入速度为54mL/min，所得脂质体从出口流出，用容器承接。混合过程中，雷诺数Re>4000。

使用马尔文粒度仪对脂质体进行表征，结果如图4A所示，当胆固醇比例小于10％时，脂质体粒径和PDI与卵磷脂自组装相比无变化，脂质体粒径为170nm，PDI为0.50。随着胆固醇含量增加颗粒粒径和PDI减小直至70：30时颗粒粒径及PDI稳定分别为72nm和0.22，批次重复性好。图4B中，光散射强度随胆固醇含量的增加而增大，颗粒尺寸减小增加了光散射强度。同时用冷冻电镜表征如图5A所示，可以清楚的看见卵磷脂自组装是多分散性脂质体结构，而图5B卵磷脂：胆固醇为60：40的脂质体分散性小，颗粒尺寸变小。与粒度仪检测结果一致。

<实施例3>

一种多通道混合器连续批量制备脂质体的方法，包括如下步骤：

(1)磷脂等制备脂质体的原料的良溶剂溶液的制备：取卵磷脂：人参皂甙质量比60：40共同溶于无水乙醇中，在室温条件下搅拌1h至完全溶解，配制卵磷脂人参皂甙乙醇溶液，卵磷脂和人参皂甙的总浓度为30mg/mL，然后将配制好的卵磷脂人参皂甙乙醇溶液与反溶剂去离子水分别吸入针筒。

(2)脂质体制备：通过数字注射泵将配制好的卵磷脂人参皂甙乙醇溶液和去离子水分别连接多通道混合器的1、3通道，在2、4通道分别通入相同的去离子水，1、3通道的通入速度为6mL/min，2、4通道的通入速度为54mL/min，所得脂质体从出口流出，用容器承接。混合过程中，雷诺数Re>4000。

使用马尔文粒度仪对脂质体进行表征，结果如图6A所示，脂质体粒径为84±0.636nm，PDI为0.193±0.011，批次重复性好。同时用冷冻电镜表征如图6B所示，卵磷脂：人参皂甙质量比为60：40的脂质体分散性小，颗粒尺寸约为90nm，与粒度仪结果一致。

<实施例4>

一种多通道混合器连续批量制备脂质体的方法，包括如下步骤：

(1)磷脂等制备脂质体的原料的良溶剂溶液的制备：取卵磷脂和胆固醇摩尔比5：3共同溶于无水乙醇中，卵磷脂浓度70mg/mL，在室温条件下搅拌1h至完全溶解，配制卵磷脂胆固醇乙醇溶液。

(2)反溶剂牛血清白蛋白溶液制备：分别取牛血清白蛋白150mg、225mg溶解于250ml的水中，配置浓度分别为0.6mg/mL、0.9mg/mL的牛血清白蛋白溶液，然后将配制好的卵磷脂胆固醇乙醇溶液与反溶剂牛血清白蛋白溶液分别吸入针筒。

(3)脂质体制备：通过数字注射泵将配制好的卵磷脂胆固醇乙醇溶液和牛血清白蛋白溶液分别连接多通道混合器的1、3通道，在2、4通道分别通入相同的牛血清白蛋白溶液，1、3通道的通入速度为6mL/min，2、4通道的通入速度为54mL/min，所得脂质体从出口流出，用容器承接。混合过程中，雷诺数Re>4000。

使用马尔文粒度仪对脂质体进行表征，结果如表1所示，负载牛血清白蛋白的脂质体与空脂质体粒径、PDI，无显著差异。同时通过超滤、考马斯亮蓝显色法测定脂质体的包封率和荷载能力，如图7所示，牛血清白蛋白0.6mg/mL批次包封率和荷载能力分别为81％和11％，牛血清白蛋白0.9mg/mL批次包封率和荷载能力分别为85％和16％。结果表明，通过多通道混合器制备的脂质体可以大幅提高亲水性蛋白及其他分子的包封和荷载的能力。

表1

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。