一种可视化监测活细胞中细胞色素c和评估呕吐毒素细胞毒性的方法

技术领域

本发明属于荧光成像及生物传感技术领域，具体涉及一种可视化监测活细胞中细胞色素c和评估呕吐毒素细胞毒性的方法。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON，也称为呕吐毒素)是常见的单端孢霉烯族B型毒素，它作为污染源出现在粮食谷物和其加工食品中，损害胃肠道系统，生殖系统，神经内分泌系统和免疫系统。DON的毒理学研究表明，线粒体信号通路的激活是DON诱导的免疫毒性的机制之一，在该过程中，线粒体通透性转换孔打开，线粒体膜电位降低，受损的线粒体将细胞色素c(Cyt c)释放到细胞质中，激活caspase 9和caspase 3而致使细胞凋亡。Cyt c是一种生物标志物，可导致线粒体不可逆转的功能障碍和胱天蛋白酶的快速活化，常作为细胞凋亡中的无回归点。目前对Cyt c进行检测的方法主要有流式细胞术，蛋白质印迹分析，高效液相色谱和酶联免疫吸附测定等，这些典型的检测技术已用于常规的基础生化研究，但是实验过程中繁杂的靶标提取程序限制了活细胞的实时监测。基于Cyt c作为DON毒性通路中的关键因素，开发一种有效监测Cyt c的方法以更好地了解DON毒理作用并进一步控制其风险具有重要的研究意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明开发了一种成本较低的分子印迹荧光探针、结合荧光成像技术，应用于在细胞中监测线粒体释出的Cyt c以评估DON的细胞毒性的方法，该方法具有合成路线简单、成本较低、选择性好、灵敏度高、生物相容性高等优点。

在本发明方法中，荧光成像技术可实现活细胞中生物标志物的可视化，由于其高灵敏度，低成本，低放射性，原位和实时检测以及在生物环境中的良好表现，该技术的采用将实现实时追踪活细胞中的Cyt c，为评估DON的细胞毒性更好地提供实时信息。

分子印迹聚合物(MIP)在高度交联的3D聚合物基质中形成与模板分子相同形状，大小和官能团功能的空穴，MIP修饰的荧光探针结合了MIP识别的优异的选择性和荧光检测的高灵敏度的优点而备受关注，近年来开发了大量的荧光型分子印迹材料在胞外检测相应的靶标，但结合MIP和荧光成像技术可视化监测Cyt c水平以评估DON毒性的方法还未见报道。

本发明第一个目的是提供一种可视化监测活细胞中Cyt c的方法，所述方法包括如下过程：

利用Cyt c作为模板分子对CdTe量子点进行分子印迹修饰，获得荧光型Cyt c分子印迹材料CdTe@MIP；然后将活细胞接种于含CdTe@MIP的培养基中进行孵育；孵育结束后，除去含CdTe@MIP的培养基、并进行染色，再保持在基本培养基中进行荧光成像。

在本发明的一种实施方式中，所述含CdTe@MIP的培养基中CdTe@MIP的浓度为350-450μg/mL；可具体选择400μg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述孵育的时间为10-15h；可具体选择12h。

在本发明的一种实施方式中，所述分子印迹修饰的过程包括：

(1)以Cyt c作为模板分子，与CdTe量子点、APTES分散于水中，在室温下反应30min；其中，Cyt c：APTES物质的量比为1：4；

(2)依次加入TEOS和NH

(3)反应结束后，固液分离、收集固体，洗涤，即得荧光型Cyt c分子印迹材料CdTe@MIP。

在本发明的一种实施方式中，所述CdTe量子点的制备过程包括：

(a)按物质的量比为1：2.4将Cd(NO

(b)将步骤(a)得到的混合液通N

在本发明的一种实施方式中，所述荧光型Cyt c分子印迹材料CdTe@MIP的制备过程具体包括：

(1)按物质的量比为1：2.4将Cd(NO

(2)将步骤(1)得到的混合溶液用NaOH调节pH值至11.2；

(3)将步骤(2)得到的混合溶液通N

(4)将模板分子Cyt c、10mL步骤(3)得到的CdTe量子点溶液和APTES在100mL烧瓶中混合反应30min(Cyt c：APTES物质的量比为1：4)；

(5)依次加入TEOS和25μL的NH

(6)所得产物离心，用0.5％曲拉通X-100洗涤至无模板分子Cyt c残留，得到目标荧光型Cyt c分子印迹材料CdTe@MIP。

本发明第二个目的是提供一种基于监测活细胞中Cyt c进行可视化评估呕吐毒素细胞毒性的方法，所述方法包括如下过程：

(1)利用Cyt c作为模板分子对CdTe量子点进行分子印迹修饰，获得荧光型Cyt c分子印迹材料CdTe@MIP；然后将活细胞接种于含CdTe@MIP的培养基中进行孵育；孵育一段时间后，除去含CdTe@MIP的培养基、并分别替换为含有一系列已知DON浓度的培养基继续孵育；孵育结束后，除去含有DON的培养基，清洗、染色，再置于基本培养基中进行荧光成像，获得不同浓度DON相应的激光共聚焦成像图，得到共聚焦图片相应的像素强度A；以无DON刺激时所得共聚焦图片的像素强度为A

(2)对步骤(1)中在含有一系列已知浓度的DON的培养基孵育后的细胞进行毒性检测，获得相应的细胞存活率或者细胞凋亡率；

(3)利用步骤(1)中不同浓度对应的激光共聚焦成像图的相对像素强度A/A

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，利用CCK-8细胞活性试剂盒对在含有DON的培养基孵育后的细胞进行毒性检测，获得相应的细胞存活率；利用AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒对在含有DON的培养基孵育后的细胞进行细胞凋亡检测，获得相应的细胞凋亡率。

在本发明的一种实施方式中，一系列已知浓度为0.5-10μM；具体可选：0.5μM,1μM,2μM,5μM,10μM。

在本发明的一种实施方式中，所述呕吐毒素细胞毒性评估模型为：

当相对像素强度A/A

在本发明的一种实施方式中，所述呕吐毒素细胞毒性评估模型为：

当相对像素强度A/A

在本发明的一种实施方式中，A/A

在本发明的一种实施方式中，所述呕吐毒素细胞毒性评估模型为：

利用相对像素强度与细胞存活率构建线性模型：y＝36.02x+61.69，其中，x为相对像素强度，y为细胞存活率。线性模型的R

在本发明的一种实施方式中，所述呕吐毒素细胞毒性评估模型为：

利用相对像素强度与细胞凋亡率构建线性模型：y＝-11.834x+14.191，其中，x为相对像素强度，y为细胞凋亡率。线性模型的R

在本发明的一种实施方式中，当DON浓度为0.5μM时，细胞存活率为89.02±2.85％；当DON浓度为1μM时，细胞存活率为82.20±3.15％；当DON浓度为2μM时，细胞存活率为71.19±2.54％；当DON浓度为5μM时，细胞存活率为68.46±1.80％；当DON浓度为10μM时，细胞存活率为63.48±0.88％。

在本发明的一种实施方式中，当DON浓度为0.5μM时，细胞凋亡率为4.91±0.39％；当DON浓度为1μM时，细胞凋亡率为7.14±0.80％；当DON浓度为2μM时，细胞凋亡率为9.66±0.60％；当DON浓度为5μM时，细胞凋亡率为13.39±0.83％；当DON浓度为10μM时，细胞凋亡率为21.98±1.82％。

在本发明的一种实施方式中，无DON刺激时，共聚焦图片的像素强度为A

当DON浓度为0.5μM时，共聚焦图片的相对像素强度为0.84±0.04，细胞存活率为89.02±2.85％，细胞凋亡率为4.91±0.39％；

当DON浓度为1μM时，共聚焦图片的相对像素强度为0.51±0.2，细胞存活率为82.20±3.15％，细胞凋亡率为7.14±0.80％；

当DON浓度为2μM时，共聚焦图片的相对像素强度为0.35±0.05，细胞存活率为71.19±2.54％，细胞凋亡率为9.66±0.60％；

当DON浓度为5μM时，共聚焦图片的相对像素强度为0.13±0.01，细胞存活率为68.46±1.80％，细胞凋亡率为13.39±0.83％；

当DON浓度为10μM时，共聚焦图片的相对像素强度为0.06±0.01，细胞存活率为63.48±0.88％，细胞凋亡率为21.98±1.82％。

在本发明的一种实施方式中，继续孵育的时间为5-8h。可具体选择5-7.5h。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中荧光成像的方法具体包括如下步骤：

消化生长至对数期的HepG2细胞，分散在完全培养基中，制成10

在本发明的一种实施方式中，为探究毒素孵育时间影响，在一组中，在含有CdTe@MIP探针的基本培养基孵育结束后，除去含有探针的基本培养基，均换为含5μM的DON的基本培养基，并分别孵育0、2.5、5、7.5h，以加入能抑制Cyt c释放的pepstatin A作为对照。吸出含有DON的基本培养基，用PBS清洗三次后用DAPI染色10min，10min后用PBS清洗三次，加入700μL基本培养基并立刻进行荧光成像。

本发明有益的技术效果在于：

1.本发明方法利用能特异性识别Cyt c的无标记荧光材料CdTe@MIP作为探针，结合了MIP识别的高选择性和荧光检测的高灵敏度，且易于制备，生物相容性好；且具有良好的黄色发光性能，具有显著的基于光诱导电子转移反应产生的荧光淬灭效应，可以对细胞中Cyt c进行荧光成像，实现对细胞内Cyt c的可视化监测。本发明方法中，进一步地，当HepG2细胞被DON诱导至凋亡时，线粒体产生的Cyt c释放至细胞质，激光共聚焦显微镜的成像结果显示，孵育至胞内的CdTe@MIP荧光探针与Cyt c反应导致其荧光信号的淬灭，可实现对活细胞内Cyt c的实时监测。

2.本发明基于CdTe@MIP荧光探针的细胞成像方法灵敏度高，成本低，放射性低，能原位、便捷实时、可视化监测DON诱导的细胞凋亡，丰富了DON毒性的评估手段，为食品安全提供了早期预警手段。

附图说明

图1为实施例1中制备的CdTe的透射电镜(TEM)图。

图2为实施例1中制备的CdTe@MIP的透射电镜(TEM)图。

图3为实施例1中制备的CdTe及CdTe@MIP的荧光光谱图。

图4为实施例1中制备的CdTe，CdTe@NIP及CdTe@MIP的红外光谱(FT-IR)图。

图5为实施例1所得CdTe@NIP及CdTe@MIP探针检测Cyt c优化响应时间图。

图6为实施例1所得CdTe@MIP探针用于体外不同浓度Cyt c荧光检测结果比对图。

图7为实施例1所得CdTe@NIP探针用于体外不同浓度Cyt c荧光检测结果比对图。

图8为实施例1所得CdTe@NIP及CdTe@MIP探针在560nm处的荧光强度与Cyt c浓度的线性关系。

图9为实施例2中不同浓度CdTe@MIP探针(100μg/mL,200μg/mL,400μg/mL,800μg/mL)与HepG2细胞共孵育12h的存活率。

图10为实施例3中不同浓度CdTe@MIP探针(100μg/mL,200μg/mL,400μg/mL,800μg/mL)与HepG2细胞共孵育12h的激光共聚焦成像图。

图11为实施例4中CdTe@MIP标记的HepG2细胞随DON刺激时间变化的激光共聚焦图。

图12为实施例4中CdTe@MIP标记的HepG2细胞随DON浓度变化的激光共聚焦成像图。

图13为实施例5中不同浓度DON(0.5μM,1μM,2μM,5μM,10μM)侵染HepG2细胞5h的细胞存活率与相对像素强度。

图14为实施例5中不同浓度DON(0.5μM,1μM,2μM,5μM,10μM)侵染HepG2细胞5h的细胞凋亡率。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

下述涉及的基本培养基为仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，购自赛默飞世尔科技公司，货号：11995073。

完全培养基为基本培养基添加10％的胎牛血清、1％青链霉素双抗后的培养基。

涉及的激光共聚焦成像仪器为德国Zeiss LSM880高分辨率激光共聚焦显微镜，其中DAPI激发波长：405nm，采集波长范围：410-498nm；CdTe@MIP激发波长：488nm，采集波长范围：493-635nm。并用ImageJ软件进一步量化共聚焦图像的荧光强度，获得图像相应的像素强度值。

实施例1 CdTe@MIP探针的制备

第一步、3-巯基丙酸稳定的CdTe量子点的制备

将92.4mg Cd(NO

第二步、CdTe@MIP的制备

将0.02mmol模板分子Cyt c、10mL上述的CdTe量子点溶液和0.08mmol APTES在100ml烧瓶中混合反应30min，依次加入0.4mmol TEOS和25μL的NH

非印迹材料(CdTe@NIP)的制备过程除没加模板分子外其余步骤同上，由此得到发射波长为560nm的CdTe@MIP和CdTe@NIP。

探针性能表征：

1、CdTe@MIP探针检测Cyt c的时间响应实验：

测试仪器：日立F-7000荧光分光光度计；实验方法为：在室温下，将1.0mL CdTe@MIP或CdTe@NIP加入到1.0mL 8μM的Cyt c溶液中，固定激发波长为470nm，对不同反应时间下的溶液进行荧光光谱检测。图5结果表明：随着反应时间的延长，CdTe@MIP发生明显的荧光淬灭现象，其荧光强度在30min时下降了26.56％并在1h内反应达到了平衡。CdTe@NIP的荧光强度在30min时下降了7.61％，下降幅度明显小于CdTe@MIP，说明CdTe@MIP探针响应迅速。

2、CdTe@MIP探针检测对Cyt c的灵敏度实验：

日立F-7000荧光分光光度计；实验方法为：在室温下，将1.0mL CdTe@MIP或CdTe@NIP加入到1.0mL不同浓度(4μM，8μM，12μM，16μM，24μM，32μM)的Cyt c溶液中，固定激发波长为470nm，对反应了1h后的溶液进行荧光光谱检测。图6结果表明：随着Cyt c溶液浓度的增加，探针的荧光强度逐渐降低，并在4-32μM范围内展现良好线性，说明本发明的CdTe@MIP探针荧光探针可用于胞外Cyt c有效检测。

实施例2 CdTe@MIP探针的细胞毒性检测

采用CCK-8细胞计数试剂盒检测CdTe@MIP探针的细胞毒性。消化生长至对数期的HepG2细胞并用完全培养基制成细胞悬液，将100μL 5×10

细胞存活率＝(实验孔吸光度—空白孔吸光度)/(对照孔吸光度—空白孔吸光度)×100％(图9)。在CdTe@MIP探针浓度为400μg/mL时细胞仍表现出约90％的细胞活力，证实了该探针具有一定的生物相容性。

实施例3 CdTe@MIP探针下的细胞荧光成像

细胞培养过程：消化生长至对数期的HepG2细胞并制成1mL约10

参照上述培养过程，仅仅将含CdTe@MIP探针的培养基中CdTe@MIP的浓度分别替换为100μg/mL、200μg/mL、800μg/mL，其他不变。

结合如图10所示，随着CdTe@MIP探针浓度的增加，HepG2细胞呈现明显的黄色荧光。用ImageJ软件分析单细胞的荧光强度，当CdTe@MIP探针浓度为100μg/mL，200μg/mL，800μg/mL时，其相对于400μg/mL(像素强度为44.69±2.86)时的相对像素强度分别为0.21±0.01，0.38±0.02，1.71±0.12，但当CdTe@MIP探针浓度达到800μg/mL时，它将穿透细胞核进而阻碍了细胞质中Cyt c的检测。因此选择最适CdTe@MIP探针孵育浓度为400μg/mL。

实施例4可视化评估呕吐毒素细胞毒性

1、CdTe@MIP探针对DON诱导HepG2细胞凋亡情况的成像

消化生长至对数期的HepG2细胞并制成1mL约10

在另一组中，优选加入DON样品的孵育时间：在除去含有探针的培养基后，换为含5μM DON的基本培养基，分别孵育0、2.5、5、7.5h。

对照组：以加入能抑制Cyt c释放的pepstatin A作为对照。

吸出含有DON的基本培养基，用PBS清洗三次后用DAPI染色10min，10min后用PBS清洗三次，加入700μL基本培养基并立刻进行荧光成像(图11、12)。随着DON浓度和反应时长的增加，细胞的荧光强度逐渐减弱。

结合图11可知，无DON刺激时，共聚焦图片的像素强度为A

当在用DON孵育5h前预先用100μM pepstatin A孵育24h时，共聚焦图片的相对像素强度为0.74±0.01，证明CdTe@MIP探针检测Cyt c的有效性。

结合图12可知，不同浓度下(0.5μM,1μM,2μM,5μM,10μM DON)毒性成像分析：

无DON刺激时，共聚焦图片的像素强度为A

实施例5

1、DON的细胞毒性检测

采用CCK-8细胞活性试剂盒检测CdTe@MIP探针的细胞毒性。

消化生长至对数期的HepG2细胞并制成细胞悬液，将100μL 5×10

细胞存活率＝(实验孔吸光度—空白孔吸光度)/(对照孔吸光度—空白孔吸光度)×100％(图13)。随着DON浓度的增加，细胞存活率逐渐减弱。

2、DON的致细胞凋亡性检测

采用AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。

消化生长至对数期的HepG2细胞并制成细胞悬液，将2mL 2.5×10

根据图13、14，已有常规方法对不同浓度下(0.5μM,1μM,2μM,5μM,10μM DON)毒性检测结果：

当DON浓度为0.5μM时，细胞存活率为89.02±2.85％，细胞凋亡率为4.91±0.39％；

当DON浓度为1μM时，细胞存活率为82.20±3.15％，细胞凋亡率为7.14±0.80％；

当DON浓度为2μM时，细胞存活率为71.19±2.54％，细胞凋亡率为9.66±0.60％；

当DON浓度为5μM时，细胞存活率为68.46±1.80％，细胞凋亡率为13.39±0.83％；

当DON浓度为10μM时，细胞存活率为63.48±0.88％，细胞凋亡率为21.98±1.82％。

结合实施例4、5(即图12、图13、图14)，给出如下评估模型：

无DON刺激时，共聚焦图片的像素强度为A

当DON浓度为0.5μM时，共聚焦图片的相对像素强度为0.84±0.04，细胞存活率为89.02±2.85％，细胞凋亡率为4.91±0.39％；

当DON浓度为1μM时，共聚焦图片的相对像素强度为0.51±0.2，细胞存活率为82.20±3.15％，细胞凋亡率为7.14±0.80％；

当DON浓度为2μM时，共聚焦图片的相对像素强度为0.35±0.05，细胞存活率为71.19±2.54％，细胞凋亡率为9.66±0.60％％；

当DON浓度为5μM时，共聚焦图片的相对像素强度为0.13±0.01，细胞存活率为68.46±1.80％，细胞凋亡率为13.39±0.83％；

当DON浓度为10μM时，共聚焦图片的相对像素强度为0.06±0.01，细胞存活率为63.48±0.88％，细胞凋亡率为21.98±1.82％。

基于此，给出如下评估模型：

当相对像素强度A/A

或者，当相对像素强度A/A

进一步的，获得如下毒性定量评估模型：

利用相对像素强度与细胞存活率构建线性模型：y＝36.02x+61.69，其中，x为相对像素强度，y为细胞存活率。线性模型的R

或者，利用相对像素强度与细胞凋亡率构建线性模型：y＝y＝-11.834x+14.191，其中，x为相对像素强度，y为细胞凋亡率。线性模型的R

利用共聚焦图片的相对像素强度来关联细胞存活和细胞凋亡率，发现相对像素强度越低、毒性越高，与相应的细胞存活率/细胞凋亡率数据呈现一致的毒性变化规律。基于此，可以使用本申请便捷的可视化监测过程代替现有的处理复杂、存在靶标分子损失、检测效率低的毒性评价方法。