一种特异识别整合素β3亚基蛋白的核酸适体及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白检测技术领域，尤其涉及一种特异识别整合素β3亚基蛋白的核酸适体及其应用。

背景技术

肿瘤细胞分泌的外泌体(tumor derived-exosomes，TDEs)在肿瘤的亲器官性转移中发挥重要“桥梁”作用。TDEs膜表面带有肿瘤细胞的表面特征，也带有与待转移器官结合的特征。外泌体膜上的整合素介导了转移的亲器官性，整合素α2bβ3、αvβ3与骨转移的亲器官性相关。整合素αvβ3和α2bβ3可以与骨桥蛋白(OPN)、骨涎蛋白(BSP)和纤连蛋白(FN)等骨基质细胞因子结合，促进骨基质微环境与肿瘤细胞的黏附作用。B16黑色素瘤细胞注入β3+/+和β3-/-小鼠的左心室，发现74％的β3+/+小鼠在14天内发生溶骨性骨转移，而只有4％的β3-/-小鼠发生骨病变。因此，TDEs膜上整合素β3亚基可能介导肺癌的亲骨转移。

整合素β3亚基蛋白的识别方法常规为多克隆或单克隆抗体标记技术，即通过抗原抗体特异性结合的原理识别细胞表面或膜表面的整合素β3亚基蛋白。抗体的生产需要复杂的基因工程技术，生产成本高；同时，在使用中，存在批间差异大、有免疫原性、组织通透性差以及稳定性差等缺点。

核酸适体可描述为“化学抗体”。它是通过指数富集的配体系统进化法从DNA/RNA文库中筛选出来的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。通过分子内碱基堆积、疏水、氢键和静电等作用力折叠成独特的分子结构，核酸适体可高特异性和亲和力识别其靶标分子。相较于基因工程的复杂技术而言，核酸适体不但可以通过自动化的固相合成方法制备，而且可以通过核酸组装和化学交联技术合成制备多功能分子识别探针。同时，核酸适体还具有批次间差异小、无免疫原性、快速的组织通透性等优点。因此，核酸适体作为潜在的治疗药物吸引着研究者的注意。

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种特异识别整合素β3亚基蛋白的核酸适体及其应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种特异识别整合素β3亚基蛋白的核酸适体及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明的第一方面是提供一种特异识别整合素β3亚基蛋白的核酸适体，所述核酸适体选自如SEQ ID NO.1-10所示的序列；或选自如SEQ ID NO.1-10所示序列经标记修饰后的序列；或选自如SEQ ID NO.1-10所示序列经取代、缺失或添加若干核苷酸后的序列。

优选地，将所合成的整合素β3亚基蛋白的核酸适体随机DNA文库，依次采用整合素β3亚基纯蛋白筛选、采用整合素β3高表达细胞NCI-H460正筛选、采用整合素β3不表达细胞Hela负筛选，即得如SEQ ID NO.1-10所示的序列。

优选地，所述标记修饰选自荧光标记、放射性标记、治疗性标记、生物素标记或酶标记。

优选地，所述标记修饰为荧光标记。

本发明的第二方面是提供一种采用如上所述核酸适体特异识别整合素β3亚基蛋白的方法，将分散于结合缓冲液中的待测细胞样品与所述核酸适体摇床孵育，孵育完成后采用洗涤缓冲液离心清洗，清洗完成后通过流式细胞仪检测即可。

优选地，所述结合缓冲液包括：0.45％的葡萄糖，5mM的氯化镁，100mg/L的tRNA和1g/L的BSA。

优选地，所述洗涤缓冲液包括：0.45％的葡萄糖和5mM的氯化镁。

优选地，所述检测为荧光检测。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明为恶性肿瘤骨转移早期诊断的整合素β3亚基的识别提供了一种核酸适体类的分子标记物。与市面上的单抗类相比，核酸适体具有很多优势：无免疫原性，不易失活，容易合成和修饰，能批量生产，能快速的穿透组织和良好的代谢动力学，产品批次间差异小和具有很好的化学稳定性。本发明可用于恶性肿瘤骨转移早期诊断和监测、敏感而特异、并且可微创取材的分子标志物，为肺癌患者骨转移的早发现、早诊断和早干预提供一种新的手段。

附图说明

图1为10条候选序列与人肺腺癌上皮细胞NCI-H460细胞的结合情况，其中(A)为10条候选序列、文库序列和NCI-H460细胞流式结合图，(B)为10条候选序列、文库序列和NCI-H460细胞共聚焦结合图；

图2为10条候选序列与人肺腺癌上皮细胞A549细胞的结合情况，其中(A)为10条候选序列、文库序列和A549细胞流式结合图，(B)为10条候选序列、文库序列和A549细胞共聚焦结合图；

图3为10条候选序列、文库序列与人卵巢癌上皮细胞Hela细胞流式结合图；

图4为核酸适体S9与H460细胞(A)、A549细胞(B)的解离平衡常数，以及核酸适体S10与H460细胞(C)、A549细胞(D)的解离平衡常数。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得。

细胞来源：本实验所用到的细胞系人肺腺癌上皮细胞(NCI-H460)、人肺腺癌上皮细胞(A549)以及人宫颈癌细胞(Hela)均来源于ATCC。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

基于SELEX技术，先用整合素β3亚基纯蛋白进行筛选，再用整合素β3高表达细胞NCI-H460进行正筛选，最后用整合素β3不表达细胞Hela进行负筛选，以获得预期目的序列：合成整合素β3亚基蛋白的核酸适体筛选的随机DNA文库及引物；第一轮到第七轮筛选中，用整合素β3亚基纯蛋白筛选获得的A0-A7的ssDNA次级文库；在第八轮和第九轮筛选中，用整合素β3高表达细胞H460对A7-ssDNA再进行两轮细胞筛选，获得A8-ssDNA和A9-ssDNA；将次级文库A7-ssDNA，A8-ssDNA，A9-ssDNA送上海生工进行二代测序以及对比分析。

本次筛选通过二代测序阳性实验组共测出226533条序列，发明人依据三个阳性文库交集中丰度排行前200的核酸序列，通过MEGA7软件对序列进行同源性对比和构建进化树，将序列对比划分于不同的家族树中，最终挑选出10条候选核酸序列，这些序列满足只与整合素β3表达的细胞结合、且结合丰度值高、分布于不同的家族树中的挑选条件(如下所示)。

SEQ ID NO.1：TTCAGCACTCCACGCATAGCTGGCTATTCCGAGATTCCTTGCGCGAACTTCGTTGCTACACCTATGCGTGCTACCGTGAA

SEQ ID NO.2：TTCAGCACTCCACGCATAGCACATGTAGTGTGTGCGCCACAATTTGGGGCAACCAACTGACCTATGCGTGCTACCGTGAA

SEQ ID NO.3：TTCAGCACTCCACGCATAGCATACCCTGCCGCAAGCAGCTAATATTGATTAGTGACCGCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA

SEQ ID NO.4：TTCAGCACTCCACGCATAGCAGCCGAAGCGACAAGCTTGTGTAGAAGTTGGAAGCGTCCGCCTATGCGTGCTACCGTGAA

SEQ ID NO.5：TTCAGCACTCCACGCATAGCTTCTGACTGAATCGCTCGGTGTCGAAACAGGTGAGCCTTACCTATGCGTGCTACCGTGAA

SEQ ID NO.6：TTCAGCACTCCACGCATAGCTGTGTTCACAAGATAAAGGGCTCCTAGGCTATGTGCGTCTCCTATGCGTGCTACCGTGAA

SEQ ID NO.7：TTCAGCACTCCACGCATAGCGAAACGGTGCCATAAGATCAAGCCACATGACATGACCTTCCCTATGCGTGCTACCGTGAA

SEQ ID NO.8：TTCAGCACTCCACGCATAGCGAGACACGCAGTGTAGATGGTCAGGGCGTAGTTGAGCTTGCCTATGCGTGCTACCGTGAA

SEQ ID NO.9：TTCAGCACTCCACGCATAGCTGACTGCTCCTTAGGTGTGACCTAAAGTGTTCTGTTTTCGCCTATGCGTGCTACCGTGAA

SEQ ID NO.10：TTCAGCACTCCACGCATAGCTCCACGATGTAGGATCCACATGAGCGCTCCTGTTACCCTGCCTATGCGTGCTACCGTGAA

NCI-H460细胞培养24小时后，经PBS洗涤后，用0.2％的EDTA处理使其从培养皿上消化下来。NCI-H460细胞经洗涤缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM的氯化镁)离心洗涤2次后，分散于(体积为100μL)结合缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM的氯化镁，100mg/L的tRNA，1g/L的BSA)中。然后，NCI-H460细胞分别与200nM荧光素标记的核酸适体(SEQ IDNO.1-10)及随机文库于4℃摇床孵育30min。孵育完成后，NCI-H460细胞经(体积为1000μL)洗涤缓冲液离心洗涤两次，并分散于洗涤缓冲液(体积为300μL)中。最后通过流式细胞仪进行荧光检测(结果见图1(A))。

NCI-H460细胞培养24小时后，将NCI-H460贴壁细胞用PBS清洗2次，加入结合缓冲液(体积为100μL；PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM的氯化镁，100mg/L的tRNA，1g/L的BSA)。然后NCI-H460细胞分别与200nM荧光素标记的核酸适体(SEQ ID NO.1-10)及随机文库于4℃摇床孵育30min。孵育完成后，再用洗涤缓冲液清洗3次。最后通过激光共聚焦进行荧光检测(结果见图1(B))。

根据图1(A)的流式结果显示，10条核酸适体序列均可与NCI-H460细胞结合，呈现出不同荧光强度的结合情况，通过曲线偏移程度可进行比较；而文库序列不与NCI-H460细胞结合。同时，图1(B)共聚焦结果也与流式结果基本相符，各序列与NCI-H460细胞出现结合现象，且在细胞膜表面或是内部均出现不同强度的绿色荧光现象，即说明与FITC标记核酸适体的结合情况。结合流式与共聚焦验证结果，表明其中核酸适体S9和S10与NCI-H460细胞的结合能力最强。

A549细胞培养24小时后，经PBS洗涤后，用0.2％的EDTA处理使其从培养皿上消化下来。A549细胞经洗涤缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM的氯化镁)离心洗涤2次后，分散于(体积为100μL)结合缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM的氯化镁，100mg/L的tRNA，1g/L的BSA)中。然后，A549细胞分别与200nM荧光素标记的核酸适体(SEQ ID NO.1-10)及随机文库于4℃摇床孵育30min。孵育完成后，A549细胞经(体积为1000μL)洗涤缓冲液离心洗涤两次，并分散于洗涤缓冲液(体积为300μL)中。最后通过流式细胞仪进行荧光检测(结果见图2(A))。

A549细胞培养24小时后，将A549贴壁细胞用PBS清洗2次，加入结合缓冲液(体积为100μL；PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM的氯化镁，100mg/L的tRNA，1g/L的BSA)。然后A549细胞分别与200nM荧光素标记的核酸适体(SEQIDNO.1-10)及随机文库于4℃摇床孵育30min。孵育完成后，再用洗涤缓冲液清洗3次。最后通过激光共聚焦进行荧光检测(结果见图2(B))。

根据图2(A)的流式结果显示，10条核酸适体序列均可与A549细胞结合，呈现出不同荧光强度的结合情况，通过曲线偏移程度可进行比较；而文库序列不与A549细胞结合。同时，图2(B)共聚焦结果也与流式结果基本相符，各序列与A549细胞出现结合现象，且在细胞膜表面或是内部均出现不同强度的绿色荧光现象，即说明与FITC标记核酸适体的结合情况。结合流式与共聚焦验证结果，表明其中核酸适体S9和S10与A549细胞的结合能力最强。

Hela细胞培养24小时后，经PBS洗涤后，用0.2％的EDTA处理使其从培养皿上消化下来。Hela细胞经洗涤缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM的氯化镁)离心洗涤2次后，分散于(体积为100μL)结合缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM的氯化镁，100mg/L的tRNA，1g/L的BSA)中。然后，Hela细胞分别与200nM荧光素标记的核酸适体(SEQ ID NO.1-10)及随机文库于4℃摇床孵育30min。孵育完成后，A549细胞经(体积为1000μL)洗涤缓冲液离心洗涤两次，并分散于洗涤缓冲液(体积为300μL)中。最后通过流式细胞仪进行荧光检测(结果见图3)。

根据图3流式结果显示，10条核酸适体序列和文库序列均不与Hela细胞结合。

进一步对核酸适体S9和S10与肺腺癌上皮细胞(NCI-H460，A549)的结合亲和力进行研究，对比二者的优异程度。首先，对S9和S10进行预处理，采用如下的浓度梯度设置：0nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、120nM、150nM、180nM、200nM、250nM、300nM、350nM。同时，将NCI-H460和A549贴壁细胞用PBS清洗2次，加入0.2％的EDTA于37℃下消化细胞。用PBS清洗2次后，用洗涤缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM的氯化镁)吹打收集细胞至离心管中。离心清洗后，加入结合缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM的氯化镁，100mg/L的tRNA，1g/L的BSA)和处理后的核酸适体序列及文库。吸打混匀后置于4℃摇床孵育30min。孵育结束后，用洗涤缓冲液离心清洗2次。通过流式细胞仪进行荧光检测。

根据流式数据，圈出中心荧光范围，扣除背景荧光值，算出各浓度下的平均荧光强度，再根Y＝BmaxX/(Kd+X)公式，通过GraphPad Prism7.0计算出核酸适体S9和S10与NCI-H460和A549细胞的解离平衡常数，并以X轴为核酸适体不同梯度浓度，Y轴为平均荧光强度构建解离曲线图。如图4所示，核酸适体S9和S10与NCI-H460细胞和A549细胞的解离平衡常数分别为为90.14±31.29nM和49.47±8.765nM以及84.11±13.25nM和70.14±6.497nM。各解离平衡常数均在纳摩尔级别，说明该核酸适体与肺癌上皮细胞的结合亲和力较高，是识别整合素β3亚基蛋白的亲和分子。

综上所述，本发明中的核酸适体相较于传统的抗体，具有很多优势：无免疫原性，不易失活，容易合成和修饰，能批量生产，能快速的穿透组织和良好的代谢动力学，产品批次间差异小和具有很好的化学稳定性。利用本发明的短链核酸适体并加以修饰标记，可以对整合素β3亚基蛋白进行识别检测，且过程快速、简便，对恶性肿瘤骨转移的早期检测及临床治疗提供了新思路。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 上海市第六人民医院

<120> 一种特异识别整合素β3亚基蛋白的核酸适体及其应用

<141> 2021-02-18

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ttcagcactc cacgcatagc tggctattcc gagattcctt gcgcgaactt cgttgctaca 60

cctatgcgtg ctaccgtgaa 80

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