一种活性物质及其制备与抗炎应用

技术领域

本发明属于自然健康物质与药物或大健康产品研究开发领域，涉及一种活性物质及其制备与抗炎应用。

背景技术

忍冬科忍冬属植物是一种具有悠久历史的常用中药，始载于《名医别录》，列为上品。文献报道忍冬科忍冬属植物山银花和金银花具有抗炎作用，二者的酚酸类成分为抗炎活性成分。山银花（灰毡毛忍冬）种植面积最广，产量高且价格低廉。山银花为忍冬科忍冬属植物灰毡毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、疏散风热的功效，主要用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热；具有抗炎，抗病毒，抗菌，抗氧化，降脂与降糖等药理作用，有较高的保健与药用价值；含有酚酸类、黄酮类、环烯醚萜类、皂苷类、挥发油类成分及多种微量元素等。本研究以山银花为载体，采用溶剂提取技术、色谱富集技术，建立制备方法，并经抗炎活性考察，发现获得的山银花制备物（提取物与富集物）及其组合物均具有较强的抗炎活性，特别是通过富集物最佳配比组合可获得抗炎作用最强的活性物质。可用于药物和大健康产品的研发。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种活性物质，尤其是其抗炎活性；本发明的第二个目的在于提供一种活性物质的制备方法；本发明的第三个目的在于研究一种活性物质制备物及其组合物的抗炎活性，使其在制备抗炎药物或大健康产品方面得到较好的应用。

为实现上述目的，本发明提供了一种活性物质及其制备方法，本活性物质主要组成为：酚类（酚酸类、黄酮类）与萜类（环烯醚萜类、三萜类）；其代表性成分为：新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷、獐芽菜苦苷、断氧化马钱子苷、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬皂苷乙等。制备方法及其制备步骤为，（1）提取物：取山银花加6~12倍量0~95%乙醇回流提取1~4次，每次0.5~4 h，提取液浓缩干燥，即得。（2）全质富集物：将提取物加水分散，以生药量计使上样液浓度为0.1~1.4 g/mL，通过大孔吸附树脂柱，吸附流速为1~5 BV/h，树脂床径高比为1:2~12，用0~20%乙醇1~3 BV进行除杂，除杂流速为1~5 BV/h，弃去除杂液；用40~95%乙醇洗脱1~6 BV，洗脱流速为1~5 BV/h，收集40~95%乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得。（3）组分富集物：将提取物加水分散，以生药量计使上样液浓度为0.1~1.4 g/mL，通过大孔吸附树脂柱，吸附流速为1~5 BV/h，树脂床径高比为1:2~12，用0~20%乙醇1~3 BV进行除杂，除杂流速为1~5 BV/h，弃去除杂液；用20~40%乙醇洗脱1~6 BV，洗脱流速为1~5 BV/h，再用40~65%乙醇洗脱1~5 BV，洗脱流速为1~5 BV/h，最后用65~95%乙醇洗脱1~4 BV，洗脱流速为1~5 BV/h，收集20~40%乙醇洗脱液和40~65%乙醇部分洗脱液，浓缩干燥，获得酚类富集物；收集40~65%乙醇部分洗脱液和65~95%乙醇洗脱液，浓缩干燥，获得萜类富集物。（4）组合物：将酚类富集物和萜类富集物按配比1:10~10:1进行组合，得到组合物。

本发明所述的一种活性物质制备物的来源为忍冬科忍冬属植物及其他含有此类物质的植物资源。忍冬科忍冬属植物包括山银花、山银花藤、山银花叶及金银花、金银花藤、金银花叶。

本发明所述一种活性物质制备物的制备步骤中的大孔吸附树脂为弱极性和非极性大孔吸附树脂，可选用但不限于HPD-100、D101、AB-8、HPD-400、HPD-500、HPD-826型中的一种。本发明中，树脂柱内装载树脂的体积称为床容积（bed volume），简写为BV。

本发明将酚类富集物和萜类富集物按最佳配比进行组合，并获得最佳药效-药学质量表征的制备物及其组合物形式。由其制备的药物在抗炎方面显示出更佳的效果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明所述的一种活性物质及其制备与抗炎应用做进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于此。

实施例1

取山银花1 kg，加10倍量水回流提取2次，每次1 h，滤过，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得提取物，即制备物1。

实施例2

取山银花1 kg，加10倍量90%乙醇回流提取3次，每次1 h，滤过，药渣加入10倍量水回流提取3次，每次1 h，滤过，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得提取物，即制备物2。

实施例3

取金银花1 kg，加8倍量水回流提取2次，每次1 h，滤过，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得提取物，即制备物3。

实施例4

取金银花1 kg，加8倍量90%乙醇回流提取3次，每次1 h，滤过，药渣加入10倍量水回流提取3次，每次1 h，滤过，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得提取物，即制备物4。

实施例5

取山银花1 kg，加10倍量50%乙醇回流提取2次，每次1 h，滤过，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得稀醇提取物，即制备物5。

实施例6

1）取山银花1 kg，加8倍量40%乙醇回流提取2次，每次1 h，滤过，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得稀醇提取物。2）将稀醇提取物加水分散，使上样液浓度为0.1 g/mL，通过HPD-826型大孔吸附树脂柱，吸附流速为2 BV/h，树脂床径高比为1:8；先用5%乙醇洗脱1.5BV进行除杂，除杂流速为2 BV/h；继用40%乙醇洗脱4 BV，洗脱流速为2.5 BV/h。收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得全质富集物，即制备物6。

实施例7

1）取山银花1 kg，加10倍量50%乙醇回流提取2次，每次1 h，滤过，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得稀醇提取物。2）将稀醇提取物加水分散，使上样液浓度为0.1 g/mL，通过HPD-826型大孔吸附树脂柱，吸附流速为2 BV/h，树脂床径高比为1:8；先用5%乙醇洗脱1.5 BV进行除杂，除杂流速为2 BV/h；继用80%乙醇洗脱4 BV，洗脱流速为2.5 BV/h。收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得全质富集物，即制备物7。

实施例8

1）取山银花1 kg，加10倍量60%乙醇回流提取2次，每次1 h，滤过，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得稀醇提取物。2）将稀醇提取物加水分散，使上样液浓度为0.1 g/mL，通过HPD-826型大孔吸附树脂柱，吸附流速为2 BV/h，树脂床径高比为1:8；先用5%乙醇洗脱1.5 BV进行除杂，除杂流速为2 BV/h；继用60%乙醇洗脱4 BV，洗脱流速为2.5 BV/h。收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得全质富集物，即制备物8。

实施例9

1）取山银花1 kg，加8倍量40%乙醇回流提取2次，每次1 h，滤过，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得山银花稀醇提取物。2）将稀醇提取物加水分散，使上样液浓度为0.1 g/ml，通过HPD-826型大孔吸附树脂柱，吸附流速为2 BV/h，树脂床径高比为1:8；5%乙醇洗脱1.5 BV进行除杂，除杂流速为2 BV/h；先用20%乙醇4 BV洗脱，继用40%乙醇3 BV洗脱，最后用60%乙醇2 BV洗脱，洗脱流速均为2.5 BV/h。收集20%乙醇洗脱液和40%乙醇第2~3 BV洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得酚类富集物，即制备物9-1；收集40%乙醇第1 BV洗脱液和60%乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得萜类富集物，即制备物9-2。3）将制备物9-1和制备物9-2按质量比1:1进行配伍得到组合物1。4）将制备物9-1和制备物9-2按质量比1:2进行配伍得到组合物2。

实施例10

1）取山银花1 kg，加10倍量50%乙醇回流提取2次，每次1 h，滤过，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得山银花稀醇提取物。2）将稀醇提取物加水分散，使上样液浓度为0.1g/ml，通过HPD-826型大孔吸附树脂柱，吸附流速为2 BV/h，树脂床径高比为1:8；5%乙醇洗脱1.5 BV进行除杂，除杂流速为2 BV/h；先用30%乙醇4 BV洗脱，继用50%乙醇3 BV洗脱，最后用80%乙醇2 BV洗脱，洗脱流速均为2.5 BV/h。收集30%乙醇洗脱液和50%乙醇第2~3 BV洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得酚类富集物，即制备物10-1；收集50%乙醇第1 BV洗脱液和80%乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得萜类富集物，即制备物10-2。3）将制备物10-1和制备物10-2按质量比1:1进行配伍得到组合物3。4）将制备物10-1和制备物10-2按质量比2:1进行配伍得到组合物4。5）将制备物10-1和制备物10-2按质量比1:2进行配伍得到组合物5。

本发明所述的一种活性物质制备物及其组合物的代表性成分含量，可通过所建立的检测方法测定，检测方法为：（1）对照品溶液的制备：分别精密称取新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、隐绿原酸、绿原酸、木犀草苷、獐芽菜苦苷、断氧化马钱子苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙对照品，以50%甲醇溶解配制成混合对照品溶液（新绿原酸0.31mg/mL、异绿原酸A 5.08 mg/mL、异绿原酸B 0.30 mg/mL、异绿原酸C 0.90 mg/mL、隐绿原酸0.12 mg/mL、绿原酸4.83 mg/mL、断氧化马钱子苷2.73 mg/mL、獐芽菜苦苷2.89 mg/mL、木犀草苷0.19 mg/mL、灰毡毛忍冬皂苷乙5.42 mg/mL、川续断皂苷乙3.58 mg/mL）。0.45 μm微孔滤膜过，备用。（2）供试品溶液的制备：精确称取样品粉末（过四号筛）0.1 g，置于10 mL棕色容量瓶中，精密加入50%甲醇，超声溶解，经0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。（3）色谱条件：色谱柱：Waters XBridge C18 分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水（C）-乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0~20 min，10%~20% A；20~20.1 min，20%~22%A；20.1~40 min，22%~30% A；40~50 min，30%~35% A；50~60 min，35%~100% A。检测波长：211nm，流速：1.0 mL/min，柱温：30℃，进样量：20 μL。

其含量范围为：新绿原酸0.11%~4.67%、隐绿原酸0.43%~9.92%、绿原酸1.77%~16.43%、异绿原酸A 0.37%~12.93%、异绿原酸B 0.33%~9.96%、异绿原酸C 0.78%~15.14%、木犀草苷0.03%~1.14%、獐芽菜苦苷0.24%~10.99%、断氧化马钱子苷0.17%~10.33%、灰毡毛忍冬皂苷乙0.20%~19.71%、川续断皂苷乙0.25%~16.76%。

药效实验

本发明分别对实施例1-10中活性物质的制备物及其组合物的抗炎作用进行了考察，主要内容为：考察二甲苯致耳肿胀急性炎症小鼠的耳肿胀度及耳肿胀抑制率，并测定血清中炎症因子白介素-10（IL-10）、白介素-6（IL-6）及肿瘤细胞坏死因子-α（TNF-α）的含量。

小鼠适应性喂养一周后用于正式试验，按照完全随机法将152只小鼠分为19组，分别为正常对照组、模型对照组、提取物组（制备物1-5）、全质富集物组（制备物6-8）、组分富集物组（制备物9-1、9-2；10-1、10-2）、组合物组（组合物1-5）。受试物组按等生药量2.25 g/Kg/d给药，正常对照组和模型对照组灌服等体积蒸馏水。每天灌胃给药一次，灌胃剂量为0.2 mL/10 g，连续7 d，末次给药前禁食12 h，可自由饮水。末次给药后1 h，在小鼠左耳耳廓正反面均匀涂抹二甲苯20 μL，造成耳肿胀模型，右耳涂抹等量的蒸馏水，左右耳形成对照。小鼠致炎40 min后，摘眼球取血，脱颈处死。沿耳廓线剪下双耳用直径8 mm内径打孔器将双耳相同部位等面积切下，称重，记录左右耳片重量，计算小鼠耳肿胀度（耳肿胀度 = 左耳片重量 – 右耳片重量）及耳肿胀抑制率（肿胀抑制率 = （模型组平均肿胀度 – 给药组平均肿胀度）/模型组平均肿胀度 × 100%）。血浆样品采集后，30min内于4℃低温离心，3000 r/min，离心15 min，离心后取上清液，分装备用，并置于-80℃冰箱保存。炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10含量测定：严格按照试剂盒说明及要求对小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10进行测定。结果见表1和表2。

由表1和表2结果可知，与正常对照组比较，模型对照组（涂抹二甲苯）的耳肿胀度显著升高（

本发明考察并建立了一种活性物质的制备工艺，获得了最佳药效-药学质量表征的制备物及其组合物形式，使其在制备治疗炎症药物或大健康产品方面得到较好的应用。本发明所述制备物及其组合物与制备方法可单独使用，也可组方使用。以上所述实施例仅为本发明的适用实施例，并不用以限制本发明，但在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应属于在本发明的保护范围之内。