一种褪黑素在制备治疗自身免疫性前列腺炎药物中的应用、治疗自身免疫性前列腺炎的药物

技术领域

本发明涉及药物应用技术领域，尤其涉及一种褪黑素在制备治疗自身免疫性前列腺炎药物中的应用、治疗自身免疫性前列腺炎的药物。

背景技术

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征(CP/CPPS)被称为III类前列腺炎，是50岁以下男性中常见的泌尿外科疾病，占所有前列腺炎病例的90％，其发病率约为8.4％。CP/CPPS的最常见症状主要包括发生在骨盆、会阴、阴囊和睾丸等部位的慢性骨盆疼痛。由于CP/CPPS的病因仍不清楚，目前 CP/CPPS的治疗方法尚不能让患者和医生令人满意。因此，对CP/CPPS病因的深入研究对于探索CP/CPPS的有效治疗方法尤为重要。

NLRP3、caspase-1和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)构成NLRP3炎性小体，具有促进促炎性细胞因子白介素1β(IL-1β)成熟的功能。越来越多的研究证实，NLRP3炎性小体与一系列慢性炎性疾病有关。目前，许多研究表明，NLRP3炎性小体和IL-1β参与CP/CPPS的发展和进程。因此，NLRP3 炎性小体和IL-1β可能是治疗CP/CPPS的靶标之一。

褪黑激素(又名褪黑素)是一种神经内分泌激素，主要由松果体以昼夜节律的方式分泌。它具有广泛的生物学特性，例如抗炎、抗氧化、免疫调节等。先前的研究表明，在多种炎性疾病中，褪黑素可以通过抑制NLRP3炎性小体从而发挥其抗炎作用。沉默信息调节剂1(Sirt1)是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的组蛋白脱乙酰基酶，研究已显示Sirt1是抗衰、抗压和抗炎的重要调节剂。许多研究表明，Sirt1可通过抑制NLRP3炎性小体和IL-1β从而发挥抗炎作用。此外，研究报告称，CP/CPPS中Sirt1表达降低，而白藜芦醇等药物可通过激活Sirt1从而抑制CP/CPPS中的异常炎症反应。然而，目前尚无针对褪黑激素是否通过激活Sirt1从而发挥对CP/CPPS保护作用的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种褪黑素在制备治疗自身免疫性前列腺炎药物中的应用、治疗自身免疫性前列腺炎的药物，褪黑素能够通过Sirt1依赖性抑制NLRP3炎性小体的表达从而减轻前列腺炎症。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种褪黑素在制备治疗自身免疫性前列腺炎药物中的应用。

优选的，所述自身免疫性前列腺炎由前列腺抗原诱发。

优选的，所述褪黑素以注射液的形式使用，所述褪黑素的注射液的制备方法包括：将褪黑素溶解于二甲基亚砜，将所得溶液与生理盐水混合，得到褪黑素注射液。

优选的，所述褪黑素的注射液的浓度为3～8mg/mL。

本发明提供了一种治疗自身免疫性前列腺炎的药物，所述药物的活性成分包括褪黑素。

优选的，所述药物组合物的剂型为注射剂。

本发明提供了一种褪黑素在制备治疗自身免疫性前列腺炎药物中的应用。本发明以自身免疫性前列腺炎鼠模型为试验对象，研究发现褪黑素通过增强Sirt1通路、抑制NLRP3炎症小体从而明显减轻前列腺组织的炎性改变、疼痛反应及外周血中致炎性细胞因子的含量，即褪黑素通过Sirt1依赖性抑制NLRP3炎性小体的表达从而减轻前列腺炎症，褪黑素对于前列腺炎的治疗是可行有效的。

附图说明

图1为实施例1和对比例1～2中处理后的小鼠前列腺组织学染色的代表性表现图、病理改变得分比较图、小鼠对盆腔疼痛测试反应的差异图以及小鼠血清中IFN-γ(a)、IL-17(b)、IL-1β(c)炎性细胞因子的表达水平效果图；

图2为实施例1和对比例1～2处理后小鼠前列腺组织的免疫组化分析图；

图3为实施例1和对比例1～2中处理后小鼠的蛋白免疫印迹检测结果以及NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和Sirt1条带的相对密度与相应的β-肌动蛋白条带的比值图；

图4为实施例1～2和对比例1～2处理后的小鼠前列腺组织学染色的代表性表现图、小鼠前列腺组织病理改变得分比较图、小鼠对盆腔疼痛测试反应的差异图以及小鼠血清中IFN-γ(a)、IL-17(b)、IL-1β(c)炎性细胞因子的表达水平图；

图5为实施例1～2和对比例1～2处理后的小鼠前列腺组织的免疫组化分析图；

图6为实施例1～2和对比例1～2中处理后小鼠的蛋白免疫印迹检测结果以及NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和Sirt1条带的相对密度与相应的β-肌动蛋白条带的比值图。

具体实施方式

本发明提供了一种褪黑素在制备治疗自身免疫性前列腺炎药物中的应用。

在本发明中，所述自身免疫性前列腺炎优选由前列腺抗原诱发。本发明对所述前列腺抗原的来源没有特殊的限定，本领域熟知的市售商品即可。

本发明对所述褪黑素的来源没有特殊的限定，本领域熟知的市售商品即可。在本发明中，所述褪黑素以注射液的形式使用，所述褪黑素的注射液的制备方法包括：将褪黑素溶解于二甲基亚砜，将所得溶液与生理盐水混合，得到褪黑素注射液。

在本发明中，所述褪黑素溶解于二甲基亚砜所得溶液的质量浓度优选为 0.1～0.2％；本发明对所述生理盐水的浓度没有特殊的限定，本领域熟知的市售生理盐水即可。本发明对所得溶液与生理盐水混合的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程能够将物料混合均匀即可。

在本发明中，所述褪黑素注射液中褪黑素的浓度优选为3～8mg/mL，更优选为4～6mg/mL。在本发明中，所述褪黑素注射液现配现用，避光保存。在本发明中，所述生理盐水的用量优选能够得到上述浓度范围的褪黑素注射液即可。

本发明提供了一种治疗自身免疫性前列腺炎的药物，所述药物的活性成分包括褪黑素。

在本发明中，所述药物组合物的剂型优选为注射剂。

本发明以自身免疫性前列腺炎鼠模型为试验对象，研究发现褪黑素通过增强Sirt1通路、抑制NLRP3炎症小体从而明显减轻前列腺组织的炎性改变、疼痛反应及外周血中致炎性细胞因子的含量，即褪黑素通过Sirt1依赖性抑制NLRP3炎性小体的表达从而减轻前列腺炎症。

本发明以自身免疫性前列腺炎鼠模型为试验对象，研究褪黑素对于自身免疫性前列腺炎的作用机制的方法优选包括：

建立自身免疫性前列腺炎鼠模型EAP，配制褪黑素注射液；

从皮下免疫第28天起，每天向EAP鼠腹腔内注射褪黑素注射液，直至第42天处死小鼠；

根据组织病理学、EAP鼠足底测痛、外周血ELISA检测评估炎症程度，然后根据蛋白免疫印迹和免疫组化检测EAP鼠前列腺组织中NOD (nucleotide bindingoligomerization domain)、样受体家族3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosisassociated speck like protein containing,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)、白细胞介素-1(interleukin-1β，IL-1β) 和沉默信息调节因子(silentmating type information regulation 2homolog 1), Sirt1的表达情况。

本发明建立自身免疫性前列腺炎鼠模型EAP，配制褪黑素注射液。在本发明中，所述自身免疫性前列腺炎鼠模型EAP的建立方法优选为：分别在第0天和第28天向非肥胖型糖尿病小鼠NOD皮下注射前列腺抗原与完全弗氏佐剂混合物，形成自身免疫性前列腺炎鼠模型EAP。在本发明中，所述前列腺抗原与完全弗氏佐剂混合物中前列腺抗原与完全弗氏佐剂的体积比优选为1:1。本发明对所述前列腺抗原与完全弗氏佐剂的来源没有特殊的限定，本领域熟知的市售商品即可。

在本发明中，所述褪黑素注射液的制备方法优选包括：将褪黑素溶解于二甲基亚砜，将所得溶液与生理盐水混合，得到褪黑素注射液。

在本发明中，所述褪黑素溶解于二甲基亚砜所得溶液的质量浓度优选为 0.1～0.2％；本发明对所述生理盐水的浓度没有特殊的限定，本领域熟知的市售生理盐水即可。本发明对所得溶液与生理盐水混合的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程能够将物料混合均匀即可。

在本发明中，所述褪黑素注射液中褪黑素的浓度优选为3～8mg/mL，更优选为4～6mg/mL。在本发明中，所述褪黑素注射液现配现用，避光保存。在本发明中，所述生理盐水的用量优选能够得到上述浓度范围的褪黑素注射液即可。

得到自身免疫性前列腺炎鼠模型EAP后，本发明从皮下免疫第28天起，每天向EAP鼠腹腔内注射褪黑素注射液，直至第42天处死小鼠。

在本发明中，所述每天向EAP鼠腹腔内注射褪黑素注射液的总注射量优选为30～80mg/kg，更优选为40～60mg/kg，进一步优选为45～50mg/kg，每次注射的褪黑素注射液的体积优选为0.2mL。本发明对所述注射的时间没有具体的限定，根据实际需求进行调整即可；在本发明的实施例中，具体为每天上午8～9点进行注射。

处死小鼠后，本发明根据组织病理学、EAP鼠足底测痛、外周血ELISA 检测评估炎症程度，然后根据蛋白免疫印迹和免疫组化检测EAP鼠前列腺组织中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和Sirt1的表达情况。

本发明对所述检测评估验证程度以及检测EAP鼠前列腺组织中 NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和Sirt1的表达情况的具体过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。

本发明通过对EAP鼠注射褪黑素注射液，研究褪黑素对EAP鼠模型前列腺验证程度的影响。

在本发明中，所述应用的方法优选还包括：配制Sirt1抑制剂-EX527注射液，自向EAP鼠腹腔内注射褪黑素注射液的前一天起，每隔一天向EAP 鼠腹腔内注射Sirt1抑制剂-EX527注射液，检测EAP鼠前列腺组织炎症程度。

在本发明中，所述Sirt1抑制剂-EX527注射液的制备方法优选包括：将 EX527溶解于二甲基亚砜，将所得溶液与生理盐水混合，得到Sirt1抑制剂 -EX527注射液。

本发明对所述EX527的来源没有特殊的限定，本领域熟知的市售商品即可。在本发明中，所述EX527溶解于二甲基亚砜所得溶液的质量浓度优选为0.1～0.2％；本发明对所述生理盐水的浓度没有特殊的限定，本领域熟知的市售生理盐水即可。本发明对所得溶液与生理盐水混合的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程能够将物料混合均匀即可。

在本发明中，所述Sirt1抑制剂-EX527注射液中Sirt1抑制剂-EX527的浓度优选为0.5～1mg/mL，更优选为0.6～0.8mg/mL。在本发明中，所述Sirt1 抑制剂-EX527注射液现配现用。在本发明中，所述生理盐水的用量优选能够得到上述浓度范围的Sirt1抑制剂-EX527注射液即可。

在本发明中，所述每隔一天向EAP鼠腹腔内注射Sirt1抑制剂-EX527 注射液的(即每天的总注射量)总注射量优选为5～10mg/kg，更优选为 6～9mg/kg，进一步优选为7～8mg/kg，每次注射Sirt1抑制剂-EX527注射液的体积优选为0.2mL。

本发明对所述检测EAP鼠前列腺组织炎症程度的具体过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。

本发明通过向EAP鼠腹腔内注射Sirt1抑制剂-EX527注射液，并检测 EAP鼠前列腺组织炎症程度，验证是否可以通过促进NLRP3、ASC、 caspase-1、IL-1β的表达从而抑制褪黑素对前列腺炎的保护作用。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)通过在第0天和第28天向非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)皮下注射前列腺抗原与完全弗氏佐剂混合物(体积比为1:1)建立自身免疫性前列腺炎鼠模型(EAP)；

(2)配制褪黑素注射液8mg/mL：将0.008g褪黑素溶解于0.05mL二甲基亚砜，将所得溶液(质量浓度为0.16％)与0.95mL生理盐水混合，得到褪黑素注射液；

(3)从皮下免疫第28天起，每天早上8-9点，向EAP鼠腹腔内注射 0.2mL褪黑素注射液(每天一次，每次总注射量为80mg/kg/d)，直至第42 天处死小鼠；根据组织病理学、EAP鼠足底测痛、外周血ELISA检测评估炎症程度，然后根据蛋白免疫印迹和免疫组化检测EAP鼠前列腺组织中 NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和Sirt1的表达情况。

实施例2

(1)通过在第0天和第28天向非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)皮下注射前列腺抗原与完全弗氏佐剂混合物(体积比为1:1)建立自身免疫性前列腺炎鼠模型(EAP)；

(2)使用实施例1制备的褪黑素注射液8mg/mL，同时配制Sirt1抑制剂-EX527注射液0.5mg/mL：将0.0005g EX527溶解于0.05mL二甲基亚砜，将所得溶液(质量浓度为0.1％)与0.95mL生理盐水混合，得到Sirt1抑制剂-EX527注射液；

(3)从皮下免疫第28天起，每天早上8～9点，向EAP鼠腹腔内注射褪黑素注射液(每天一次，每次注射的体积为0.2mL，每天总注射量为 80mg/kg/d)，直至第42天处死小鼠；

(4)从注射褪黑素注射液的前一天起，每隔一天向小鼠腹腔内注射Sirt1 抑制剂-EX527注射液(每天一次，每次注射的体积为0.2mL，每天总注射量为5mg/kg)，检测EAP鼠前列腺组织炎症程度。

对比例1(Control对照组)

(1)通过在第0天和第28天向非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)皮下注射无菌生理盐水与完全弗氏佐剂混合物(体积比为1:1)建立自身免疫性前列腺炎鼠模型(EAP)；

(2)配制对照组注射液:将0.05mL二甲基亚砜与0.95mL生理盐水混合，得到质量浓度为5％的二甲基亚砜溶液；

(3)从EAP鼠皮下免疫第28天起，每天上午8-9点，向EAP鼠腹腔内注射0.2mL对照组注射液，直至第42天处死小鼠；根据组织病理学、EAP 鼠足底测痛、外周血ELISA检测评估炎症程度，然后根据蛋白免疫印迹和免疫组化检测EAP鼠前列腺组织中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和Sirt1 的表达情况。

对比例2(EAP+DMSO组)

(1)按照实施例1的方法建立自身免疫性前列腺炎鼠模型(EAP)；

(2)配制对照组注射液，将0.05mL二甲基亚砜与0.95mL生理盐水混合，得到质量浓度为5％的二甲基亚砜溶液；

(3)从皮下免疫第28天起，每天上午8-9点，向EAP鼠腹腔内注射 0.2mL步骤(2)所述对照组注射液，直至第42天处死小鼠，根据组织病理学、EAP鼠足底测痛、外周血ELISA检测评估炎症程度，然后根据蛋白免疫印迹和免疫组化检测EAP鼠前列腺组织中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和Sirt1的表达情况。

检测结果

图1中A为实施例1和对比例1～2中处理后的小鼠前列腺组织学染色的代表性表现图(其中，a+d代表Control对照组(对比例1)；b+e代表 EAP+DMSO组(对比例2)；c+f代表EAP+Mel组(实施例1)；a、b、c，原始放大倍数：×100，bar＝100μm；d、e、f，原始放大倍数：×200，bar＝50 μm)；由图1中A可知，褪黑素缓解了EAP前列腺组织的炎症改变程度，且EAP+Mel组鼠模型的前列腺组织炎症改变与Control对照组一致。

图1中B为实施例1和对比例1～2处理后的小鼠前列腺组织病理改变得分比较图；根据病理评分标准，三组前列腺组织病理改变得分分别为：对照组：0.60±0.24，EAP+DMSO组：2.20±0.20，EAP+Mel组：1.00±0.32。

图1中C为实施例1和对比例1～2处理后的小鼠对盆腔疼痛测试反应的差异图：由图1中C可知，在1.0g和4.0g力的刺激下，EAP+Mel组盆腔疼痛反应明显弱于EAP+DMSO组，而对照组+DMSO和EAP+Mel组小鼠的疼痛反应一致。

图1中D为实施例1和对比例1～2处理后的小鼠血清中IFN-γ(a)、IL-17 (b)、IL-1β(c)炎性细胞因子的表达水平效果图；由图1中D可知，EAP+Mel 组小鼠血清中IFN-γ、IL-17、IL-1β的表达水平较EAP+DMSO组明显降低 (***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05)。

综合图1可知，褪黑素缓解了EAP模型的前列腺炎症改变，说明褪黑素对EAP具有治疗作用。

图2为实施例1和对比例1～2处理后小鼠前列腺组织的免疫组化分析图 (a、d和g为对照组；b、e和h为EAP+DMSO组；c、f和i为EAP+Mel 组；原始放大倍数：×200，bar＝50μm)，由图2可知，EAP+Mel组小鼠前列腺组织中NLRP3、ASC和caspase-1的表达较EAP+DMSO组明显减轻，说明褪黑素降低了EAP小鼠前列腺组织中NLRP3炎症相关蛋白的表达，说明褪黑素是通过降低NLRP3炎症小体相关蛋白表达从而发挥对EAP的治疗作用。

图3中A为实施例1和对比例1～2中处理后小鼠的蛋白免疫印迹检测结果，图3中A显示，EAP+Mel组小鼠前列腺组织中NLRP3、ASC和caspase-1 的表达较EAP+DMSO组明显下调，而Sirt1的表达水平明显升高。

图3中B、C、D、E和F分别为NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和Sirt1 条带的相对密度与相应的β-肌动蛋白条带的比值图(****P<0.0001， ***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05)；由图3中B、C、D、E和F可知，在EAP 中，褪黑素激活了Sirt1信号通路并降低NLRP3炎症相关蛋白及IL-1β的表达水平，说明褪黑素对EAP的治疗作用可能依赖于Sirt1通路的激活从而抑制炎症小体相关蛋白的表达。

图4中A为实施例1～2和对比例1～2处理后的小鼠前列腺组织学染色的代表性表现图(a、e为对照+DMSO组(对比例1)；b、f为EAP+DMSO 组(对比例2)；c、g为EAP+Mel组(实施例1)；d、h为EAP+Mel+EX527 组(实施例2)；a、b、c、d、原始放大倍数：×100，bar＝100μm；e、f、g、 h、原始放大倍数：×200，bar＝50μm)。由图4中A可知，Sirt1抑制剂-EX527 抑制了褪黑素对EAP鼠模型的治疗作用，即EAP+Mel+EX527组小鼠前列腺组织炎症改变与EAP+DMSO组一致。

图4中B为实施例1～2和对比例1～2处理后的小鼠前列腺组织病理改变得分比较图；由图4中B可知，四组前列腺组织病理改变得分分别为：0.67 ±0.21(对照组+DMSO组)，2.17±0.31(EAP+DMSO组)，0.83±0.31 (EAP+Mel组)，1.67±0.33(EAP+Mel+EX527组)。

图4中C为实施例1～2和对比例1～2处理后的小鼠对盆腔疼痛测试反应的差异图；由图4中C可知，在1.0g和4.0g力的刺激下，EAP+Mel+EX527 组的盆腔疼痛反应明显强于EAP+Mel组，而EAP+Mel+EX527和 EAP+DMSO组小鼠的疼痛反应一致。

图4中D为实施例1～2和对比例1～2处理后的小鼠血清中IFN-γ(a)、 IL-17(b)、IL-1β(c)炎性细胞因子的表达水平图；由图4中D可知， EAP+Mel+EX527组小鼠血清中IFN-γ、IL-17、IL-1β的表达水平较EAP+Mel 组明显升高，且其表达水平与EAP+DMSO组一致(****P<0.0001，**P<0.01， *P<0.05)；

综合图4可知，EX527拮抗了褪黑素对EAP的治疗作用，加重了前列腺炎的严重程度，说明Sirt1抑制剂-EX527可抑制褪黑素对EAP模型的保护作用，加重了前列腺炎的严重程度。

图5为实施例1～2和对比例1～2处理后的小鼠前列腺组织的免疫组化分析图(a、e和i为对照组+DMSO组；b、f和j为EAP+DMSO组；c、g 和k为EAP+Mel组；d、h和l为EAP+Mel+EX527组；原始放大倍数：×200，bar＝50μm)；由图5可知，EAP+Mel+EX527组小鼠前列腺组织中 NLRP3、ASC和caspase-1的表达较EAP+Mel组明显增加，说明EX527增加了褪黑素治疗的EAP前列腺组织中NLRP3炎性小体相关蛋白的表达，说明EX527拮抗褪黑素对EAP的治疗作用可能是通过激活NLRP3炎症小体发挥作用。

图6为中A为实施例1～2和对比例1～2中处理后小鼠的蛋白免疫印迹检测结果，图6中A显示，EAP+Mel+EX527组小鼠前列腺组织中NLRP3、 ASC和caspase-1的表达较EAP+Mel组明显升高，而Sirt1的表达水平明显降低。

图6中B、C、D、E和F分别为NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和Sirt1 条带的相对密度与相应的β-肌动蛋白条带的比值图(**P<0.01，*P<0.05)，由图6中B、C、D、E和F可知，EX527在褪黑素治疗的EAP中增加了NLRP3 炎性体相关蛋白和IL-1β的表达并抑制了Sirt1的表达，说明EX527是通过激活NLRP3炎症小体发挥对褪黑素治疗EAP的拮抗作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。