一种有机溶剂中脂肪酶催化合成脂肪酸蔗糖酯的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种有机溶剂中脂肪酶催化合成脂肪酸蔗糖酯的方法。

(二)背景技术

脂肪酸蔗糖酯是一种非离子型表面活性剂，具有无毒、生物相容性好、无刺激性、可生物降解等优点。通过调节酰基供体链长及取代度，可在较大的范围内调整蔗糖酯的多种功能特性，如临界胶束浓度(CMC)、亲水亲油平衡值(HLB)等，从而使蔗糖酯满足特定的应用条件。因此，蔗糖酯被广泛应用于食品、日化品、制药等行业。例如，蔗糖酯是联合国国际粮农组织和世界卫生组织推荐使用的食品乳化剂；月桂酸蔗糖单酯对金黄色葡萄球菌等有害细菌具有较强的抑制作用等。

目前工业化生产蔗糖酯的方法主要为化学法。化学法以DMSO、DMF等强极性有机溶剂作为反应介质、以碳酸钾等作为催化剂合成蔗糖酯。虽然化学法合成蔗糖酯的产量较高，但具有以下几点缺陷：(1)化学催化剂的区域选择性较差，催化产物除单酯外，还有二酯、三酯等副产物，使原料利用率大幅下降，且不利于主产物的分离纯化，大幅增加下游工程的成本；(2)DMSO等强极性有机溶剂毒性大且沸点高，用现有的分离技术很难将其除尽，从而限制了所得的蔗糖酯在食品、日化品等领域中的应用；(3)化学法的反应条件苛刻，通常需要在高温、减压等条件下反应，生产成本以及对生产设备的要求较高，且高温易使蔗糖酯变性着色，从而降低产量。

由于化学法具有较多的局限性，近年来酶法合成蔗糖酯越来越引起人们的关注，其中，脂肪酶是最早应用于糖酯合成的酶。脂肪酶对蔗糖单酯合成的区域选择性较高，催化产物几乎全为6-O-蔗糖单酯。另外，酶法合成蔗糖酯的反应条件温和，可大大降低生产成本；不仅如此，酶法合成蔗糖酯的反应介质不含有或含有较少的DMSO等毒性有机溶剂，大大降低了产品下游工程的难度和成本。然而，目前并没有关于酶法工业化生产蔗糖酯的报道，其原因之一在于蔗糖在中低极性有机介质中的溶解度很低，从而极大地限制了蔗糖酯产量的提升。因此，使用叔戊醇等单一低毒有机体系作为反应介质的报道极少。为此，大部分研究者将叔戊醇/DMSO(V：V＝4:1)的混合体系作为反应介质来促进蔗糖的溶解，如，ManuelFerrer等人报道了H.lanuginosa lipase/Celite在叔戊醇/DMSO混合体系中催化月桂酸蔗糖酯的合成，蔗糖单酯产量可达到30g/L。然而，混合体系中含有的小部分DMSO仍会加大产物分离纯化的难度，并使蔗糖酯的应用受限。另一方面，脂肪酶在有机溶剂中能否维持活性构象，行使其正常的催化功能，是影响蔗糖酯产量的又一关键因素。脂肪酶的电离状态很大程度上决定了其活性构象，然而，目前几乎没有关于有机介质中脂肪酶电离状态对合成蔗糖酯的影响的报道。

(三)发明内容

为了解决上述问题，本发明采用叔戊醇或叔丁醇作为反应介质，通过脂肪酶催化合成脂肪酸蔗糖酯，并初步探究了加入碱性物质对提升脂肪酶酶活的作用，实现了一种绿色安全、低能耗的蔗糖酯生产方式，提高了蔗糖酯的安全性以应用于食品及日化品领域，并且简化产品的下游工程，降低蔗糖酯的生产成本。

本发明采用的技术方案是：

一种有机溶剂中脂肪酶催化合成脂肪酸蔗糖酯的方法，所述方法包括：

(1)在低毒有机溶剂中加入蔗糖和脂肪酸乙烯酯，以脂肪酶为催化剂，同时加入碱性物质以及分子筛，在60～85℃温度下反应18～24h；所述低毒有机溶剂为叔戊醇或叔丁醇；所述碱性物质为下列之一：月桂酸钠、三乙胺、甲酸钠、乙酸钠、磷酸氢二钠；叔戊醇或叔丁醇为低毒、低沸点的有机溶剂，作为反应介质可使产品蔗糖酯的安全性大大提高；加入的碱性物质能调节脂肪酶的电离状态，使脂肪酶处于活性构象，从而提升催化活力。

(2)反应液过滤，回收脂肪酶，脂肪酶用叔戊醇清洗、真空干燥回收备用，于叔戊醇中得到所述脂肪酸蔗糖酯。

所述蔗糖为经研磨后的小粒径细粉状蔗糖，加入量为0.1～0.6mmol/15mL，最优选0.4mmol/15mL。

所述脂肪酸乙烯酯为月桂酸乙烯酯或硬脂酸乙烯酯，加入量为1.7～3.4mmol/15mL，最优选2.25mmol/15mL。

所述脂肪酶为Novozym435，加入量为75～125mg/15mL，最优选100mg/15mL。

所述碱性物质加入量为30～90mg/15mL(优选90mg/15mL)，最优选月桂酸钠。

优选的，所述分子筛为

本发明的有益效果主要体现在：本发明采用低毒、低沸点的叔戊醇或叔丁醇作为脂肪酶催化合成蔗糖酯的反应介质，使产品蔗糖酯的安全性大大提高，可应用于食品及日化品领域，同时简化产品下游工程，降低生产成本；另一方面，本发明加入的碱性物质能调节脂肪酶的电离状态，使脂肪酶处于活性构象，从而提升催化活力，使得蔗糖酯产量接近DMSO/叔戊醇混合体系，是一种绿色安全、高效、低成本的蔗糖酯合成新方法。

(四)附图说明

图1为硬脂酸蔗糖酯的薄层色谱分析结果图。

图2为实施例1中月桂酸蔗糖酯的高效液相色谱图(叔戊醇体系)。

(五)具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

实施例1：

将蔗糖研磨成细粉状，在60℃真空干燥箱中干燥6h后备用。在两个50mL圆底烧瓶中分别加入蔗糖0.1mmol(0.034g)、2.25mmol(585μL)月桂酸乙烯酯，和15mL叔戊醇或叔丁醇，在60℃水浴锅中搅拌1h。再分别加入0.1gNovozym435、0.09g月桂酸钠及0.4g

可见，叔戊醇体系产率高于叔丁醇体系，因此后续实验采用叔戊醇为溶剂。

实施例2：

将蔗糖研磨成细粉状，在60℃真空干燥箱中干燥6h后备用。在五个50mL圆底烧瓶中分别加入蔗糖0.08/0.1/0.4/0.6/0.8mmol，和2.25mmol(585μL)月桂酸乙烯酯及15mL叔戊醇，在60℃水浴锅中搅拌1h。再在混合液中分别加入0.1g Novozym435、0.09g月桂酸钠及0.4g

可见，蔗糖单酯产量随着蔗糖浓度增加而增大，但体系中蔗糖浓度大于0.6mmol/15mL时，蔗糖单酯产量有所下降，因此体系中蔗糖浓度以0.1～0.6mmol/15mL为宜。

实施例3：

将蔗糖研磨成细粉状，在60℃真空干燥箱中干燥6h后备用。在五个50mL圆底烧瓶中分别加入1.51/1.70/2.25/3.40/3.61mmol月桂酸乙烯酯，和蔗糖0.4mmol(0.137g)及15mL叔戊醇，在60℃水浴锅中搅拌1h。在混合液中分别加入0.1g Novozym435、0.09g月桂酸钠及0.4g

可见，蔗糖单酯产量随着月桂酸乙烯酯浓度增加而增大，但体系中月桂酸乙烯酯浓度大于3.4mmol/15mL时，蔗糖单酯产量有所下降，因此体系中月桂酸乙烯酯浓度以1.7～3.4mmol/15mL为宜。

实施例4：

将蔗糖研磨成细粉状，在60℃真空干燥箱中干燥6h后备用。在五个50mL圆底烧瓶中分别加入蔗糖0.08/0.1/0.4/0.6/0.8mmol，和2.25mmol(585μL)硬脂酸乙烯酯及15mL叔戊醇，在60℃水浴锅中搅拌1h。在混合液中分别加入0.1g Novozym435、0.09g月桂酸钠及0.4g

可见，脂肪酸乙烯酯为硬脂酸乙烯酯时，体系中蔗糖浓以0.1～0.6mmol/15mL为宜。

实施例5：

将蔗糖研磨成细粉状，在60℃真空干燥箱中干燥6h后备用。在五个50mL圆底烧瓶中分别加入1.51/1.70/2.25/3.40/3.61mmol硬脂酸乙烯酯、0.4mmol蔗糖(0.137g)及15mL叔戊醇，在75℃水浴锅中搅拌1h。在混合液中分别加入0.1g Novozym435、0.09g月桂酸钠及0.4g

可见，脂肪酸乙烯酯为硬脂酸乙烯酯时，体系中硬脂酸乙烯酯以1.7～3.4mmol/15mL为宜。

实施例6：

将蔗糖研磨成细粉状，在60℃真空干燥箱中干燥6h后备用。在六个50mL圆底烧瓶中分别加入碳酸钠/甲酸钠/乙酸钠/月桂酸钠/磷酸氢二钠0.09g及50μL三乙胺、0.4mmol蔗糖(0.136g)，2.25mmol(585μL)月桂酸乙烯酯及15mL叔戊醇，在60℃水浴锅中搅拌1h。在混合液中分别加入0.1g Novozym435及0.4g

可见，脂肪酸乙烯酯为月桂酸乙烯酯时，体系中碱性物质以月桂酸钠为最优。

实施例7：

将蔗糖研磨成细粉状，在60℃真空干燥箱中干燥6h后备用。在五个50mL圆底烧瓶中分别加入0/15/30/90/100/120mg月桂酸钠、0.4mmol蔗糖(0.136g)、2.25mmol月桂酸乙烯酯(585μL)及15mL叔戊醇，在60℃水浴锅中搅拌1h。在混合液中分别加入0.1g Novozym435及0.4g

可见，碱性物质月桂酸钠加入量以30～90mg/15mL为宜，最优为90mg/15mL。

实施例8：

将蔗糖研磨成细粉状，在60℃真空干燥箱中干燥6h后备用。在五个50mL圆底烧瓶中分别加入0/15/30/90/100/120mg月桂酸钠、0.4mmol蔗糖(0.136g)、2.25mmol硬脂酸乙烯酯(585μL)及15mL叔戊醇，在60℃水浴锅中搅拌1h。在混合液中分别加入0.1g Novozym435及0.4g

同样的，脂肪酸乙烯酯为硬脂酸乙烯酯时，体系中碱性物质月桂酸钠加入量以30～90mg/15mL为宜，最优为90mg/15mL。

实施例9：

将蔗糖研磨成细粉状，在60℃真空干燥箱中干燥6h后备用。在五个50mL圆底烧瓶中分别加入0.4mmol蔗糖(0.136g)、2.25mmol月桂酸乙烯酯(585μL)及15mL叔戊醇，在60℃水浴锅中搅拌1h。在混合液中分别加入50/75/100/125/150mg Novozym435、90mg月桂酸钠及0.4g

可见，脂肪酸乙烯酯为月桂酸乙烯酯时，体系中Novozym435加入量以75～150mg/15mL为宜。

实施例10：

将蔗糖研磨成细粉状，在60℃真空干燥箱中干燥6h后备用。在五个50mL圆底烧瓶中分别加入0.4mmol蔗糖(0.136g)、2.25mmol硬脂酸乙烯酯(585μL)及15mL叔戊醇，在60℃水浴锅中搅拌1h。在混合液中分别加入50/75/100/125/150mg Novozym435、90mg月桂酸钠及0.4g

可见，脂肪酸乙烯酯为硬脂酸乙烯酯时，体系中Novozym435加入量以75～150mg/15mL为宜。

实施例11：

将蔗糖研磨成细粉状，在60℃真空干燥箱中干燥6h后备用。在五个50mL圆底烧瓶中分别加入0.4mmol蔗糖(0.136g)、2.25mmol月桂酸乙烯酯(585μL)及15mL叔戊醇，在60℃水浴锅中搅拌1h。在混合液中分别加入100mg Novozym435、90mg月桂酸钠及0.4g

可见，脂肪酸乙烯酯为月桂酸乙烯酯时，体系反应温度以85℃为宜。

实施例12：

将蔗糖研磨成细粉状，在60℃真空干燥箱中干燥6h后备用。在五个50mL圆底烧瓶中分别加入0.4mmol蔗糖(0.136g)、2.25mmol硬脂酸乙烯酯(585μL)及15mL叔戊醇，在60℃水浴锅中搅拌1h。在混合液中分别加入100mg Novozym435、90mg月桂酸钠及0.4g

可见，脂肪酸乙烯酯为硬脂酸乙烯酯时，体系反应温度同样以85℃为宜。