一种土壤微生物总DNA高效提取方法

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，尤其涉及一种一种土壤微生物总DNA高效提取方法。

背景技术

土壤微生物是土壤生态系统中最具活力的组成部分，其中微生物多样性对维持土壤生态功能起重要作用。目前，土壤理化性质与微生物特性和功能相关性的研究方法则主要是利用高通量测序分析物种多样性、群落结构、丰度，寻找其与土壤肥力以及土壤健康的相关关系，并可进一步应用于土壤的可持续利用发展、经营管理和改良，从而促进经济作物增产，治理环境污染。分子生物学技术研究土壤微生物群落结构的实质是建立土壤微生物DNA的差异与土壤微生物的种群结构特征的相关性。因此，提取土壤微生物DNA则成为开展土壤微生物分子生态学，遗传学工作的重要前提。一方面，获得大片段、多样性程度高、具有代表性的土壤微生物总DNA是研究土壤微生物群落结构的关键基础。另一方面，由于土壤样品中可能含有较多的腐殖质酸，粘粒，重金属离子等抑制物质，内切酶消化、PCR扩增、杂交等后续操作会被干扰抑制，因而减少甚至消除抑制物质的残留对于提取与纯化土壤微生物基因组总DNA在研究中显得尤为重要。而磁性纳米颗粒材料具有多种独特性质，如高比表面积，吸附能力强，并且能够在合适的缓冲液中选择性的富集DNA，此外，具有超高顺磁性这一性质使得易于实现高通量自动化提取，因此是土壤微生物DNA提取纯化的理想材料。

基本上，土壤微生物基因组DNA提取可分为直接和间接提取两种方法。

(1)间接法：从土壤中收集细胞，然后进行裂解得到DNA。此法分离得到的DNA纯度较高，但是由于微生物细胞与土壤粘附在一起，不容易分离，细胞收集过程中会丢失很多，所获得DNA量比较少；

(2)直接法：通过化学，物理机械的方法使微生物细胞在土壤中裂解，然后抽提纯化直接得到总DNA.此法获得的DNA会受到胞外DNA以及土壤中腐殖质酸等物质的污染，片段完整性不如间接法且小于1.7kb片段比例较高，但是可以得到较多的DNA。

由此可见，上述的两种方法都不能全面真实的反映土壤的信息，因此，急需一种能够全面真实反映突然信息的提取。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种土壤微生物总DNA高效方法，适合于不同地区、不同来源的土壤，具有通用性；所得的DNA完整性好、纯度较高；所用时间短，步骤少，提取的条件不严格；可适配兼容市场上的绝大部分核酸提取仪，具备高通量，规范化，高效率的优势。

本发明的技术方案如下：提供一种土壤微生物总DNA高效提取试剂盒，包括：直径为0.5～8mm的氧化锆珠，Buffer SLB1，Buffer SLB2，Buffer PS，MBs，Buffer WSI，BufferWSII，Buffer WSIII，Buffer ES；

所述Buffer SLB1为含有月桂酰肌氨酸钠的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，其中，月桂酰肌氨酸钠的浓度为80～150g/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为100～500mmol/L；Buffer SLB1的pH为6.8～8.0；

所述Buffer SLB2为含有月桂酰肌氨酸钠的乙二胺四乙酸二钠盐缓冲液，其中，月桂酰肌氨酸钠的浓度为50～100g/L，乙二胺四乙酸二钠盐的浓度为1～5mmol/L；BufferSLB2的pH为6.8～8.0；

所述Buffer PS为3～8mol/L盐酸胍水溶液，其pH为5.0～7.0；

所述MBs为含有直径400～1000nm的羟基磁性纳米颗粒的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，其中，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为1～5mmol/L，所述羟基磁性纳米颗粒的含量50～100mg/mL；MBs的pH为6.8～7.5；

所述Buffer WSI含有盐酸胍、异丙醇的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，其中，盐酸胍的浓度为3～6mol/L、异丙醇的体积分数为50～80％、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为40～100mmol/L；Buffer WSI的pH为6.8～9.0；

所述Buffer WSII为含有异丙醇的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，其中，异丙醇的体积分数为60～80％，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为40～120mmol/L；Buffer WSII的pH为6.8～9.0；

所述Buffer WSIII为含有氯化钾的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，其中，氯化钾的浓度为8.5～20g/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为40～120mmol/L，Buffer WSIII的pH为6.8～9.0；

所述Buffer ES为含有乙二胺四乙酸二钠的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，其中，乙二胺四乙酸二钠的浓度为1mmol/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为10mmol/L，Buffer ES的pH为6.0～8.0。

本发明提供两种上述试剂盒的使用方法，采用前述的土壤微生物总DNA高效提取试剂盒，方法一的技术方案包括以下步骤。

S1：在装好氧化锆珠的第一离心管中，加入0.20～0.25g土壤、0.5～1.0mL BufferSLB1、45～90μL Buffer SLB2、0.3～0.5mL buffer PS，在涡旋仪高速涡旋5～20分钟裂解微生物，其中，氧化锆珠与土壤样品量使用比例为1～5；

S2：将步骤S1中的第一离心管及内容物在50～95℃下水浴或金属浴10～20分钟；对于富含有机质的底泥，调高水浴或金属浴的温度(如70～95℃)和增加步骤S1的珠磨时间可提高DNA提取量。对于极难裂解的微生物(如：葡萄球菌属，真菌)，90℃以上的水浴或金属浴8分钟以上可提高其裂解效果；

S3：将经过步骤S2的第一离心管及内容物在8000～16000rpm离心2～10分钟，转移上清液至第二离心管中；

S4：向经过步骤S3的第二离心管中加入等体积的异丙醇，混匀；

S5：向经过步骤S4的第二离心管中加入入40～120μLMBs，混匀，室温放置3～10分钟；

S6：将经过步骤S5的第二离心管转移至磁力架上，磁富集5～30秒后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的羟基磁性纳米颗粒冲刷至第二离心管内溶液中，静置磁力架磁吸附20～80秒至溶液澄清，吸弃上清；

S7：从磁力架上取下第二离心管，加入600～1000μL Buffer WSI，涡旋振荡10～50秒混匀，将第二离心管置于磁力架上，磁富集5～30秒后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的羟基磁性纳米颗粒冲刷至管内溶液中，静置磁力架，磁吸附20～80秒至溶液澄清，吸弃上清；

S8：从磁力架上取下第二离心管，加入600～1000μL Buffer WSII，涡旋振荡10～50秒混匀，将第二离心管置于磁力架上，磁富集5～30秒后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的羟基磁性纳米颗粒冲刷至管内溶液中，静置磁力架，磁吸附20～80秒至溶液澄清，吸弃上清；

S9：从磁力架上取下第二离心管，加入600～1000μL Buffer WSIII，涡旋振荡10～50秒混匀，将第二离心管置于磁力架上，磁富集5～30秒后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的羟基磁性纳米颗粒冲刷至管内溶液中，静置磁力架，磁吸附20～80秒至溶液澄清，吸弃上清；

S10：将第二离心管置于磁力架上，打开第二离心管的管盖，对第二离心管内的内容物干燥，至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光；

S11：向第二离心管中加入50～200μL Buffer ES，混匀，于45～90℃加热3～20分钟；

S12：加热结束后，震荡第二离心管，然后将第二离心管置于磁力架上磁吸20～120至溶液澄清，小心转移上清至保存管并保存于-20℃以下待用，期间每隔2～3分钟颠倒一次。

所述步骤S2还包括：向第一离心管中加入20～100μL RNA酶，室温放置2～10分钟；或者所述步骤S3为：将经过步骤S2的第一离心管及内容物在8000～16000rpm离心2～10分钟，转移上清液至第二离心管中；向第二离心管中加入20～100μL RNA酶，室温放置2～10分钟。

在步骤S6、S7、S8、S9的吸弃上清的过程中，不能触碰到羟基磁性纳米颗粒。

在步骤S1中，土壤若为土壤保存液或者其含水量较高，需要先离心尽量去除游离水分。

步骤S1中的土壤样品为在低温条件下冻存的野外采集的土壤。

本发明提供两种上述试剂盒的使用方法，采用前述的土壤微生物总DNA高效提取试剂盒，方法二的技术方案包括以下步骤。

SS1：在装好氧化锆珠的第三离心管中，加入0.20～0.25g土壤样品、0.5～1.0mLBuffer SLB1、45～90μL Buffer SLB2、0.3～0.5mL buffer PS，在涡旋仪高速涡旋5～20分钟裂解微生物，其中，氧化锆珠与土壤样品量使用比例为1～5；

SS2：将步骤SS1中的第三离心管及内容物在50～95℃下水浴或金属浴10～20分钟；

SS3：将经过步骤SS2的第三离心管及内容物在8000～16000rpm离心2～10分钟；

SS4：96深孔板的1号孔位装入第三离心管上清液0.5～1mL和0.4～0.8mL异丙醇；2号孔位装入40～80μLMBs和600～1200μL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，其中，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为1～5mmol/L；3号孔位装入600～1200μL Buffer WSI；4号孔位装入600～1200μL Buffer WSII；5号孔位装入600～1200μL Buffer WSIII；6号孔位装入100～200μLBuffer ES；

SS5：将1号孔位中的液体与2号孔位中的液体加入至提取管内混合3～20分钟，室温条件下磁吸附60～180秒；

SS6：将3号孔位中的液体加入至提取管内，混合1～3分钟，室温条件下磁吸附60～180秒；

SS7：将4号孔位中的液体加入至提取管内，混合1～3分钟，室温条件下磁吸附60～180秒；

SS8：将5号孔位中的液体加入至提取管内，混合10秒～1分钟，室温条件下磁吸附10～60秒；

SS9：将6号孔位中的液体加入至提取管内，混合1～15分钟，55℃～90℃条件下磁吸附60～180秒。

SS10：将提取管至于无磁的环境下，使羟基磁性纳米颗粒与核酸分离。

在步骤SS10中，将100～200μL Buffer ES加入至提取管中。

采用上述方案，本发明提供一种土壤微生物总DNA高效提取方法，应用物理机械的方式来释放土壤中的微生物核酸，效率高；另外，运用超顺磁性纳米颗粒对核酸的高亲和力来达到选择性地提取土壤微生物DNA的效果。其中物理机械破碎方式，通过使用氧化锆珠来实现。由于氧化锆珠具有更高的硬度和韧性，以及热膨胀性能，相比于玻璃珠，性能更为优异，当在高速振荡条件下，通过氧化锆珠之间的碰撞产生较为合适的机械剪切力破碎土壤颗粒以及其中的微生物细胞，释放核酸，同时对DNA的机械损伤小，完整性更佳。再合适地组合缓冲液和磁性纳米颗粒，在缓冲液中离液剂的作用下，磁性纳米颗粒选择性地吸附核酸，无需单独去除腐殖酸，重金属离子以及其他杂质的步骤或添加试剂就可实现DNA的选择性吸附分离纯化且易于自动化，实现高通量的土壤DNA提取。

附图说明

图1为采用本发明的方法从Species A-稻田土，Species B-菜地土，Species C-森林土，Species D-底泥提取DNA进行电泳的结果图；

图2为表3中的样品1、2、3、4、5的DNA进行细菌16S rDNA保守序列扩增的结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

本发明提供一种土壤微生物总DNA高效提取试剂盒，包括：直径为0.5～8mm的氧化锆珠，Buffer SLB1，Buffer SLB2，Buffer PS，MBs，Buffer WSI，Buffer WSII，BufferWSIII，Buffer ES；

所述Buffer SLB1为含有月桂酰肌氨酸钠的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，其中，月桂酰肌氨酸钠的浓度为80～150g/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为100～500mmol/L；Buffer SLB1的pH为6.8～8.0；

所述Buffer SLB2为含有月桂酰肌氨酸钠的乙二胺四乙酸二钠盐缓冲液，其中，月桂酰肌氨酸钠的浓度为50～100g/L，乙二胺四乙酸二钠盐的浓度为1～5mmol/L；BufferSLB2的pH为6.8～8.0；

所述Buffer PS为3～8mol/L盐酸胍水溶液，其pH为5.0～7.0；

所述MBs为含有直径400～1000nm的羟基磁性纳米颗粒的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，其中，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为1～5mmol/L，所述羟基磁性纳米颗粒的含量50～100mg/mL；MBs的pH为6.8～7.5；

所述Buffer WSI含有盐酸胍、异丙醇的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，其中，盐酸胍的浓度为3～6mol/L、异丙醇的体积分数为50～80％、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为40～100mmol/L；Buffer WSI的pH为6.8～9.0；

所述Buffer WSII为含有异丙醇的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，其中，异丙醇的体积分数为60～80％，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为40～120mmol/L；Buffer WSII的pH为6.8～9.0；

所述Buffer WSIII为含有氯化钾的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，其中，氯化钾的浓度为8.5～20g/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为40～120mmol/L，Buffer WSIII的pH为6.8～9.0；

所述Buffer ES为含有乙二胺四乙酸二钠的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，其中，乙二胺四乙酸二钠的浓度为1mmol/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为10mmol/L，Buffer ES的pH为6.0～8.0。

实施例1

本发明还提供两种土壤微生物总DNA高效提取方法，方法一为：采用前述的土壤微生物总DNA高效提取试剂盒，包括以下步骤。

S1：在装有0.2～0.25g氧化锆珠的第一离心管中，加入0.20～0.25g土壤、0.5～1.0mL Buffer SLB1、45～90μL Buffer SLB2、0.3～0.5mL buffer PS，在涡旋仪高速涡旋5～20分钟裂解微生物；

S2：将步骤S1中的第一离心管及内容物在50～95℃下水浴或金属浴10～20分钟；本步骤用于灭活核酸酶。

S3：将经过步骤S2的第一离心管及内容物在8000～16000rpm离心2～10分钟，转移上清液至第二离心管中；

S4：向经过步骤S3的第二离心管中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀；

S5：向经过步骤S4的第二离心管中加入40～120μLMBs，颠倒混匀，室温放置3～10分钟；

S6：将经过步骤S5的第二离心管转移至磁力架上，磁富集5～30秒后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的羟基磁性纳米颗粒冲刷至第二离心管内溶液中，静置磁力架磁吸附20～80秒至溶液澄清，吸弃上清；

S7：从磁力架上取下第二离心管，加入600～1000μL Buffer WSI，涡旋振荡10～50秒混匀，将第二离心管置于磁力架上，磁富集5～30秒后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的羟基磁性纳米颗粒冲刷至管内溶液中，静置磁力架，磁吸附20～80秒至溶液澄清，吸弃上清；

S8：从磁力架上取下第二离心管，加入600～1000μL Buffer WSII，涡旋振荡10～50秒混匀，将第二离心管置于磁力架上，磁富集5～30秒后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的羟基磁性纳米颗粒冲刷至管内溶液中，静置磁力架，磁吸附20～80秒至溶液澄清，吸弃上清；

S9：从磁力架上取下第二离心管，加入600～1000μL Buffer WSIII，涡旋振荡10～50秒混匀，将第二离心管置于磁力架上，磁富集5～30秒后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的羟基磁性纳米颗粒冲刷至管内溶液中，静置磁力架，磁吸附20～80秒至溶液澄清，吸弃上清；

S10：将第二离心管置于磁力架上，打开第二离心管的管盖，对第二离心管内的内容物干燥，至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光；本步骤耗时3～30分钟。

S11：向第二离心管中加入50～200μL Buffer ES，混匀，于45～90℃加热3～20分钟；混匀可采用涡旋振荡或吹吸混匀。

S12：加热结束后，震荡第二离心管，然后将第二离心管置于磁力架上磁吸20～120秒至溶液澄清，小心转移上清至保存管并保存于-20℃以下待用。震荡第二离心管用于将羟基磁性纳米颗粒混匀。

所述步骤S2还包括：向第一离心管中加入20～100μL RNA酶，室温放置2～10分钟；或者所述步骤S3为：将经过步骤S2的第一离心管及内容物在8000～16000rpm离心2～10分钟，转移上清液至第二离心管中；向第二离心管中加入20～100μL RNA酶，室温放置2～10分钟。

在步骤S6、S7、S8、S9的吸弃上清的过程中，不能触碰到羟基磁性纳米颗粒。

在步骤S1中，土壤若为土壤保存液或者其含水量较高，需要先离心尽量去除游离水分。

步骤S1中的土壤样品为在-20℃至-80℃条件下冻存的野外采集的土壤。

采用上述方法分别对Species A-稻田土，Species B-菜地土，Species C-森林土，Species D-底泥提取DNA，并对其进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，从图1中可以看出：本方法可以分离纯化得到高质量的土壤基因组DNA，所有样品条带均主要集中在大于Marker(DL15000)的15kb位置，表明样品DNA完整性较好；与此同时，在Marker(DL15000)的250～1000bp位置不存在明显的亮斑条带，则说明不存在明显的腐殖酸残留。

实施例2

本发明提供两种土壤微生物总DNA高效提取方法，方法二为：采用前述的土壤微生物总DNA高效提取试剂盒，采用核酸提取仪提取DNA：

SS1：在装好氧化锆珠的第三离心管中，加入0.20～0.25g土壤样品、0.5～1.0mLBuffer SLB1、45～90μL Buffer SLB2、0.3～0.5mL buffer PS，在涡旋仪高速涡旋5～20分钟裂解微生物，其中，氧化锆珠与土壤样品量使用比例为1～5；

SS2：将步骤SS1中的第三离心管及内容物在50～95℃下水浴或金属浴10～20分钟；

SS3：将经过步骤SS2的第三离心管及内容物在8000～16000rpm离心2～10分钟；

SS4：96深孔板的1号孔位装入第三离心管上清液0.5～1mL和0.4～0.8mL异丙醇；2号孔位装入40～80μLMBs和600～1200μL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，其中，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为1～5mmol/L；3号孔位装入600～1200μL Buffer WSI；4号孔位装入600～1200μL Buffer WSII；5号孔位装入600～1200μL Buffer WSIII；6号孔位装入100～200μLBuffer ES；

自动化操作步骤：

(1)依下列表格，96深孔板中计入相应组分：

表1

(2)按以下程序运行：

表2

表3为方法二使用核酸提取仪(16channel)对Species A-稻田土提取核酸纯度评价。

表3

请参阅图2，图2为在表3中的样品1、2、3、4、5的DNA进行细菌16S rDNA保守序列扩增的结果。结合纯度测试数据可知(表3)，所有样品纯度较高，完全满足下游实验，如PCR、实时荧光定量PCR以及其他核酸扩增实验的要求。此外，从图2(细菌16S rDNA保守序列扩增)可知，本方法提取得到的土壤DNA样品，可直接用于后续的16S rDNA宏基因组学分析，不存在PCR抑制物质的残留，无需进一步地纯化，因此极大地提高了效率。

综上所述，本发明提供一种土壤微生物总DNA高效提取方法，应用物理机械的方式来释放土壤中的微生物核酸，效率高；另外，运用超顺磁性纳米颗粒对核酸的高亲和力来达到选择性地提取土壤微生物DNA的效果。其中物理机械破碎方式，通过使用氧化锆珠来实现。由于氧化锆珠具有更高的硬度和韧性，以及低热膨胀性能，相比于玻璃珠，性能更为优异，当在高速振荡条件下，通过氧化锆珠之间的碰撞产生较为合适的机械剪切力破碎土壤颗粒以及其中的微生物细胞，释放核酸，同时对DNA的机械损伤小，完整性更佳。再合适地组合缓冲液和磁性纳米颗粒，在缓冲液中离液剂的作用下，磁性纳米颗粒选择性地吸附核酸，无需单独去除腐殖酸，重金属离子以及其他杂质的步骤或添加试剂就可实现DNA的选择性吸附分离纯化且易于自动化，实现高通量的土壤DNA提取。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。