抑制B型肝炎病毒复制及B型肝炎表面抗原分泌的方法

技术领域

本发明涉及肝脏免疫疗法领域，尤其涉及B型肝炎病毒感染的免疫清除领域。

背景技术

B型肝炎病毒(HBV)为引起急性及慢性肝炎及肝细胞癌(HCC)的主要人类病原体。尽管可获得有效的HBV疫苗，但估计全球超过2.4亿人长期感染HBV。未经治疗个体充当病毒携带者且具有罹患硬化及HCC的高风险。涉及聚乙二醇化干扰素及核苷(核苷酸)类似物(拉米夫定、阿丹弗(adefovir)、因提弗(entecavir)及田诺弗(tenofovir)等)的用于慢性B型肝炎的治疗方案可抑制HBV DNA复制。然而，仅约3％-7％经聚乙二醇化干扰素治疗的患者及1％-12％经核苷(核苷酸)类似物治疗的患者显示出持续反应。此外，经核苷(核苷酸)类似物治疗可诱导耐药性HBV变体。因此，需要探索用于治疗慢性HBV感染的其他治疗性策略。

肝脏为身体内最大的内部器官，负责解毒、代谢活性及养分储存。此外，肝脏为具有独特性能的免疫器官，这些独特性能包括主要的先天性免疫、较低的适应性免疫及诱导免疫耐受性。因此，肝脏通常不能施加有效的免疫反应以清除许多重要病原体，诸如B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、或疟疾。这些病原体可避开免疫监视且在肝微环境中保持持续性感染。逆转肝脏的免疫耐受性对于完全清除持续性感染至关重要。

CD11b为表达于肝免疫细胞的表面上的I型跨膜糖蛋白，这些肝免疫细胞包括库弗细胞(Kupffer cell)(肝脏常驻巨噬细胞)、树突状细胞(DC)、骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)、自然杀手细胞(NK)、及B细胞和T细胞的子集。CD11b也称为整合素αM(ITGAM)，它与其β-链搭配物CD18非共价结合以形成功能性整合素异二聚体CD11b/CD18。CD11b/CD18也称为巨噬细胞-1抗原(Mac-1)或补体受体3(CR3)，其通过调节细胞粘着、迁移、趋化性、及噬菌作用而介导发炎。

近期研究已显示，活化的CD11b通过泛素介导的MyD88及TRIF的降解来负调控TLR信号传导(C.Han等人,Nat.Immunol.,2010,11(8):734-42)。活化的CD11b也负调控DC功能以抑制T细胞活化且负调控B细胞受体(BCR)信号传导以维持B细胞耐受性。

发明内容

本发明是关于基于结合肝骨髓及淋巴免疫细胞群体上的CD11b调节免疫反应的方法。具体地，用抗CD11b抗体与CD11b结合触发具有以下作用中的一或多种的免疫刺激环境：增加CD11b+外周血液单核细胞(PBMC)上MHC II及CD86的表面表达；抑制血液中B型肝炎表面抗原(HBsAg)及HBV DNA的水平；及加速HBV自肝脏清除。

本发明一方面涉及一种用于治疗B型肝炎病毒感染的药物组合物。根据本发明的一种实施方式的药物组合物包含有效量的抗CD11b的抗体或其结合片段。有效量为将产生所需作用的量。本领域技术人员将理解，有效量将取决于患者的病况、年龄、性别等且有效量可无需过度实验使用常规技能即可确定。来自抗体的结合片段可包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双功能抗体；直链抗体；单链抗体分子(scFv)；及自抗体片段形成的多特异性抗体。

根据本发明的实施方式，抗CD11b的抗体可为多克隆或单克隆抗体。抗CD11b的抗体可包含由NYWIN(SEQ ID NO:1)或GFSLTSNSIS(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基组成的重链互补决定区1(HCDR1)；由NIYPSDTYINHNQKFKD(SEQ ID NO:3)或AIWSGGGTDYNSDLKS(SEQ IDNO:4)的氨基酸残基组成的重链CDR2(HCDR2)；和由SAYANYFDY(SEQ ID NO:5)或RGGYPYYFDY(SEQ ID NO:6)的氨基酸残基组成的重链CDR3(HCDR3)；及由RASQNIGTSIH(SEQ ID NO:7)或KSSQSLLYSENQENYLA(SEQ ID NO:8)的氨基酸残基组成的轻链CDR1(LCDR1)；由YASESIS(SEQID NO:9)或WASTRQS(SEQ ID NO:10)的氨基酸残基组成的轻链CDR2(LCDR2)；和由QQSDSWPTLT(SEQ ID NO:11)或QQYYDTPLT(SEQ ID NO:12)的氨基酸残基组成的轻链CDR3(LCDR3)。

根据本发明的一些实施方式，抗CD11b的抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:13的序列的重链可变区，及包含SEQ ID NO:23的序列的轻链可变区；(b)包含SEQ ID NO:14的序列的重链可变区，及包含SEQ ID NO:24的序列的轻链可变区；(c)包含SEQ ID NO:15的序列的重链可变区，及包含SEQ ID NO:25的序列的轻链可变区；(d)包含SEQ ID NO:16的序列的重链可变区，及包含SEQ ID NO:26的序列的轻链可变区；(e)包含SEQ ID NO:17的序列的重链可变区，及包含SEQ ID NO:27的序列的轻链可变区；(f)包含SEQ ID NO:18的序列的重链可变区，及包含SEQ ID NO:28的序列的轻链可变区；(g)包含SEQ ID NO:19的序列的重链可变区，及包含SEQ ID NO:29的序列的轻链可变区；(h)包含SEQ ID NO:20的序列的重链可变区，及包含SEQ ID NO:30的序列的轻链可变区；(i)包含SEQ ID NO:21的序列的重链可变区，及包含SEQ ID NO:31的序列的轻链可变区；或(j)包含SEQ ID NO:22的序列的重链可变区，及包含SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区。

本发明一方面涉及治疗HBV感染的方法。根据本发明的一种实施方式的方法包含向有需要的个体施予有效量的抗CD11b的抗体。与CD11b结合的抗CD11b抗体触发如通过以下观测结果所证明的免疫刺激性反应：CD11b+外周血液单核细胞(PBMC)中MHC II及CD86的表面表达增加；血液中B型肝炎表面抗原(HBsAg)及HBV DNA的水平受到抑制；及HBV自肝脏的清除加速。

附图说明

图1显示描绘根据本发明的一种实施方式治疗方案的示意图。

图2显示抗体治疗后的基于流体动力注射的HBV携带者小鼠中CD11b+外周血液单核细胞(PBMC)上MHC II及CD86的表面表达。

图3显示抗体治疗后的基于流体动力注射的HBV携带者小鼠中血清HBsAg的动态变化。数据显示为平均值±SEM(*p<0.05，斯氏t检验)。

图4显示抗体治疗后的基于流体动力注射的HBV携带者小鼠中血清HBV DNA的动态变化。数据显示为平均值±SEM(*p<0.05,**p<0.01，斯氏t检验)。

图5显示抗体治疗后的基于流体动力注射的HBV携带者小鼠中CD11b+PBMC上血清HBV DNA、MHC II、及CD86表达的程度之间的关系。相关性是使用皮尔森相关系数(Pearson's correlation coefficient)确定。

图6A显示HepG2细胞上的CD11b表达。图6B显示HBsAg的滴度，且图6C显示抗CD11b抗体治疗后，经HBV转染的HepG2细胞的载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样(APOBEC-B)RNA表达的效价。数据显示为平均值±SEM。

图7显示肝脏中HBV DNA定量的结果。提取总肝脏DNA且通过实时PCR用HBx特异性引物测得1μg的gDNA。各点表示来自1只小鼠肝脏的HBV DNA。所检测极限为1000份拷贝/微克。

图8显示10种人源化抗CD11b抗体的轻链可变区序列。

图9显示10种人源化抗CD11b抗体的重链可变区序列。

图10显示如用流式细胞计分析的10种人源化抗CD11b抗体与表达于K562细胞上的CD11b的结合。

具体实施方式

本发明的实施方式涉及治疗HBV感染或缓解HBV感染的病况的方法。本发明的方法是基于通过抗体或其结合片段与肝骨髓及淋巴免疫细胞群体上的CD11b结合来调节免疫反应。本发明的发明人出人意料地发现，用抗CD11b抗体与CD11b结合触发具有以下作用中的一或多种的免疫刺激环境：增加CD11b+外周血液单核细胞(PBMC)上MHC II及CD86的表面表达；抑制血液中B型肝炎表面抗原(HBsAg)及HBV DNA的水平；及加速HBV自肝脏的清除。

B型肝炎病毒(HBV)为具有共价闭合环状双股DNA(cccDNA)基因组的包膜病毒。HBV感染引起急性及慢性发炎性肝脏疾病。长期HBV感染会引起肝硬化及肝细胞癌。HBV的长期慢性感染由受损HBV特异性免疫反应产生，由此免疫系统无法消除或治愈经感染肝细胞。

CD11b为表达于肝免疫细胞的表面上的I型跨膜糖蛋白，这些肝免疫细胞包括库弗细胞(肝脏常驻巨噬细胞)、树突状细胞(DC)、骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)、自然杀手细胞(NK)、及B细胞及T细胞的子集。CD11b也称为整合素αM(ITGAM)，它与其β-链搭配物CD18非共价结合以形成功能性整合素异二聚体CD11b/CD18。CD11b/CD18也称为巨噬细胞-1抗原(Mac-1)或补体受体3(CR3)，其通过调节细胞粘着、迁移、趋化性及噬菌作用而介导发炎。

在全身性红斑性狼疮症中，整合素-αM的变体(CD11b变体)与自体反应性B细胞相关联，这些自体反应性B细胞对B细胞受体(BCR)交联展现过度增生性反应。Ding等人使用经野生型或狼疮相关联变体的CD11b转染的B细胞，发现变体CD11b中的突变通过破坏CD22-CD11b直接结合来消除CD11b对BCR信号传导的调节性作用。(C.Ding等人,Nat.Commun.2013；4:2813)。他们推断CD11b负面调节BCR信号传导以维持自体反应性B细胞耐受性。

然而，CD11b可在不同系统或疾病中扮演不同角色。举例而言，CD11b缺陷会增强巨噬细胞中TLR介导的反应，使得小鼠更易罹患内毒素休克及大肠杆菌引起的败血症，从而显示CD11b是经由泛素介导的MyD88及TRIF降解而负面调节TLR信号传导(C.Han等人,Nat.Immunol.,2010,11(8):734-42)。尚未知整合素-αM(CD11b)是否在诸如HBV感染的肝脏疾病中起任何作用。

因此，本发明的发明人打算研究CD11b是否在HBV感染中会有任何影响。我们出乎意料地发现，CD11b确实在慢性HBV感染的肝免疫反应中扮演角色。简言之，通过抗CD11b抗体与CD11b结合来抑制CD11b功能，会产生免疫刺激性反应，如通过以下所证明：CD11b+外周血液单核细胞(PBMC)中MHC II及CD86的表面表达增加；血液中B型肝炎表面抗原(HBsAg)及HBV DNA的水平受到抑制；及HBV自肝脏的清除加速。

基于这些出人意料的发现，本发明的实施方式涉及控制或治疗HBV感染或缓解HBV感染的病况的方法。本发明的方法是基于与CD11b(尤指肝骨髓细胞及淋巴免疫细胞上的CD11b)结合的抗体。本发明的实施方式将通过以下特定实施例来说明。本领域技术人员应了解，这些实施例仅用于说明且并不意谓限制本发明的范围，因为其他修改及变化在不脱离本发明的范围的情况下是可能的。

抗CD11b抗体

本发明的实施方式可使用各种抗CD11b抗体，其可为多克隆或单克隆且包括可商购的抗体。数个抗CD11b抗体可商购自各种供货商。举例而言，CD11b单克隆抗体(M1/70)、CD11b单克隆抗体(M1/70.15)及CD11b单克隆抗体(ICRF44)尤其可购自Thermo FisherScientifics(Waltham,MA,USA)。本发明的实施方式可使用这些可商购抗CD11b抗体或其CD11b结合片段中的任意。

此外，我们已生成数个特异性地结合于CD11b的单克隆抗体及人源化抗体。发现这些抗体具有类似生物活性。单克隆抗体的生产及抗体的人源化使用本领域中已知的技术(参见US 2018/0362651A1，该文献记载的内容以引用的方式并入)。就人源化而言，针对人类抗体数据库搜索鼠类抗人类CD11b抗体的可变域序列。作为实施例，选择与鼠类抗人类CD11b具有高同源性的10组人类构架序列作为轻链与重链两者的人类受体。同时，分析N-糖基化基序。应因此避免候选人类可变区中的潜在糖基化位点。10条轻链的人源化可变域表示为VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、LC1、LC2、LC3、LC4及LC5(图8)；同时，10条重链的人源化可变域表示为VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、HC1、HC2、HC3、HC4及HC5(图9)。这些轻链及重链肽序列提供以高亲和力结合至人类抗CD11b的人源化抗体或抗原结合部分。

用流式细胞计使用已经过CD11b表达载体转染的K562细胞来测定人源化抗CD11b抗体的特异性。如图10中所示，测试出的所有人源化抗CD11b抗体均能够结合表达CD11b的K562细胞。相反，这些抗体并不结合未经转染的K562细胞。这些结果显示人源化抗CD11b抗体可特异性结合CD11b表位。应注意，重链及轻链的所有组合或排列均紧密结合至CD11b。类似地，这些人源化抗体也特异性地结合于HepG2细胞上的CD11b。

本发明的实施方式可使用以上抗CD11b抗体或其抗原结合部分中的任一种，其包含以下中的至少一种：由NYWIN(SEQ ID NO:1)或GFSLTSNSIS(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基组成的重链互补决定区1(HCDR1)；由NIYPSDTYINHNQKFKD(SEQ ID NO:3)或AIWSGGGTDYNSDLKS(SEQ ID NO:4)的氨基酸残基组成的重链CDR2(HCDR2)；和由SAYANYFDY(SEQ ID NO:5)或RGGYPYYFDY(SEQ ID NO:6)的氨基酸残基组成的重链CDR3(HCDR3)；及以下中的至少一种：由RASQNIGTSIH(SEQ ID NO:7)或KSSQSLLYSENQENYLA(SEQ ID NO:8)的氨基酸残基组成的轻链CDR1(LCDR1)；由YASESIS(SEQ ID NO:9)或WASTRQS(SEQ ID NO:10)的氨基酸残基组成的轻链CDR2(LCDR2)；和由QQSDSWPTLT(SEQ ID NO:11)或QQYYDTPLT(SEQID NO:12)的氨基酸残基组成的轻链CDR3(LCDR3)。

在本发明的一些实施方式中，抗CD11b抗体或其抗原结合部分包含(i)包含重链可变区的重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:1的H-CDR1、包含SEQ ID NO:3的H-CDR2及包含SEQ ID NO:5的H-CDR3，及(ii)轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:7的L-CDR1、包含SEQ ID NO:9的L-CDR2及包含SEQ ID NO:11的L-CDR3；或(iii)包含重链可变区的重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:2的H-CDR1、包含SEQ ID NO:4的H-CDR2及包含SEQ ID NO:6的H-CDR3，及(iv)轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:8的L-CDR1、包含SEQ ID NO:10的L-CDR2及包含SEQ ID NO:12的L-CDR3。

在本发明的一些实施方式中，人源化抗CD11b抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含由SEQ ID NO:13组成的氨基酸序列的重链可变区，及包含由SEQ ID NO:23组成的氨基酸序列的轻链可变区；

(b)包含由SEQ ID NO:14组成的氨基酸序列的重链可变区，及包含由SEQ ID NO:24组成的氨基酸序列的轻链可变区；

(c)包含由SEQ ID NO:15组成的氨基酸序列的重链可变区，及包含由SEQ ID NO:25组成的氨基酸序列的轻链可变区；

(d)包含由SEQ ID NO:16组成的氨基酸序列的重链可变区，及包含由SEQ ID NO:26组成的氨基酸序列的轻链可变区；

(e)包含由SEQ ID NO:17组成的氨基酸序列的重链可变区，及包含由SEQ ID NO:27组成的氨基酸序列的轻链可变区；

(f)包含由SEQ ID NO:18组成的氨基酸序列的重链可变区，及包含由SEQ ID NO:28组成的氨基酸序列的轻链可变区；

(g)包含由SEQ ID NO:19组成的氨基酸序列的重链可变区，及包含由SEQ ID NO:29组成的氨基酸序列的轻链可变区；

(h)包含由SEQ ID NO:20组成的氨基酸序列的重链可变区，及包含由SEQ ID NO:30组成的氨基酸序列的轻链可变区；

(i)包含由SEQ ID NO:21组成的氨基酸序列的重链可变区，及包含由SEQ ID NO:31组成的氨基酸序列的轻链可变区；或

(j)包含由SEQ ID NO:22组成的氨基酸序列的重链可变区，及包含由SEQ ID NO:32组成的氨基酸序列的轻链可变区。

经抗CD11b抗体治疗增强了CD11b+免疫细胞的抗原呈递能力。

为了评估抗CD11b抗体抗慢性HBV感染的治疗效果，我们利用通过将pAAV/HBV1.2质粒流体动力注射(HDI)至CBA/caJ小鼠中产生的HBV携带者小鼠模型。简言之，将10微克pAAV/HBV1.2 DNA以高压方式注入至雄性CBA/caJ小鼠的尾部静脉中。在注射之后，定期对小鼠抽血以监测HBsAg及HBV DNA的血清水平。(Huang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2006年11月21日；103(47):17862-17867)。

HBV携带者小鼠表达B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)、B型肝炎核心抗原(HBcAg)、及HBV DNA的高血清水平，但在肝脏中具有血清丙胺酸转胺酶(ALT)的正常水平且不具有显著发炎。此小鼠模型关于HBV续存的特征类似于免疫耐受性阶段中人类慢性HBV感染的那些。(Chou等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2015年2月17日；112(7):2175-80)。

如图1中所示，将HBV携带者小鼠(在流体动力注射后4周)划分为两组且用5mg/kg对照物IgG(ctrl IgG)或抗CD11b抗体治疗。每3-4天重复注射持续4次。收集血液样品以用于在第2、4、6及8周分析。

在初次抗体治疗之后两周评估HBV携带者小鼠中CD11b+外周血液单核细胞(PBMC)的活化状态。相比于经Ctrl IgG治疗的小鼠，抗CD11b抗体的施予导致CD11b+PBMC中MHC II及CD86表达水平的增加(图2)。这些结果指示用抗CD11b抗体治疗可增强CD11b+免疫细胞的抗原呈递能力，其将有利于先天性及过继性免疫活化(adoptive immune activation)以消除HBV携带者小鼠中的病毒。因此，抗CD11b抗体可能为治疗HBV感染的适用治疗剂。

抗CD11b抗体治疗导致HBV感染清除加速

检查HBV携带者小鼠中抗CD11b抗体抗慢性HBV感染的治疗效果。相比于ctrl IgG治疗组，经抗CD11b抗体治疗在抗体注射之后两周显著抑制血清HBsAg水平(图3)。抗CD11b抗体治疗也在初次抗体注射之后两周显著降低HBV复制水平(通过较低DNA水平证明)(图4)。在接受抗CD11b抗体数周的小鼠中观测到持续病毒抑制。此外，血清HBsAg及HBV DNA反弹并未在经抗CD11b抗体治疗的大部分小鼠中出现(图3及图4)。没有发生感染反弹指示病毒通过经增强的免疫反应消除，而非暂时抑制。这些结果显示抗CD11b抗体治疗可诱导HBV清除加速且不出现感染复发。

通过抗CD11b抗体治疗增强的抗原呈递能力与HBV感染的清除相关联

如上所述，用抗CD11b抗体治疗可增强CD11b+免疫细胞的抗原呈递能力，从而导致增强的免疫反应。为了研究在HBV感染的清除与CD11b+免疫细胞的抗原呈递能力之间是否存在关系，评定CD11b+PBMC中血清HBV DNA、MHC II与CD86表达之间的相关性。

如图5中所示，CD11b+PBMC中MHCII及CD86的表面表达增加与血清HBV DNA水平负相关。这些结果指示通过抗CD11b抗体治疗增强的抗原呈递能力与HBV感染清除增强相关联。

抗CD11b抗体抑制经HBV转染的人类肝癌HepG2细胞系的HBsAg生产且诱导DNA脱氨酶，包括可降解HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的载脂蛋白B mRNA编辑酶、催化性多肽样(APOBEC)蛋白质

除了以上HBV小鼠模型以外，也使用感染人类HBV的HepG2细胞研究抗CD11b抗体在治疗HBV感染中的功效。细胞表面上的CD11b表达是通过流式细胞计分析。如图6A中所示，HepG2细胞上的CD11b表达比人类单核球上的CD11b表达低得多。人类HepG2细胞经HBV质粒转染，且培养液中HBsAg的滴度是用HBsAg定量ELISA试剂盒分析。在抗CD11b抗体处理3天之后，经HBV转染的HepG2细胞的HBsAg的滴度快速且显著降低(图6B)。

APOBEC3B为胞嘧啶核苷脱氨酶，已发现其为HBV的细胞限制因子，因为APOBEC3B可编辑细胞核中的HBV cccDNA，从而导致其降解。(Chen等人,Antiviral Res.,2018年1月；149:16-25)。在经抗CD11b抗体处理的经HBV转染的HepG2细胞中，APOBEC3B表达的RNA增加(图6C)。这些结果显示，在抗CD11b抗体处理后，至少由非溶细胞机制部分负责HBsAg清除。此外，使用抗CD11b抗体处理可能涉及功能抑制及/或降解HBV cccDNA，其可由抗CD11b抗体通过表观遗传修饰、DNA脱氨酶APOBEC蛋白质诱导、microRNAs、抑制从松弛环状DNA(rcDNA)转化为cccDNA、阻断rcDNA运输至细胞核中及/或抑制cccDNA转录，来达成目标。

使用抗CD11b抗体治疗诱导肝脏中的HBV DNA减少

以上结果显示，抗CD11b抗体可显著降低HBsAg及DNA水平。此是否归因于暂时性抑制HBV(例如，使病毒休眠)或长期作用(例如，减少或消除来自肝脏的HBV)则是通过经过治疗很久之后的肝脏中的HBV DNA水平来进一步研究。举例而言，在抗CD11b抗体治疗后36周，定量肝脏中的常驻HBV DNA。简言之，在液氮中研磨肝脏且提取总肝脏基因组DNA(gDNA)。HBV DNA是采用实时PCR，使用HBx特异性引物(正向引物：5'-CCGATCCATACTGCGGAAC-3'，SEQID NO:33；反向引物：5'-GCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA-3'，SEQ ID NO:34)来检测。

图7显示来自此研究的结果。HBV DNA是以1μg小鼠gDNA中拷贝的数目表示。CtrlIgG及抗CD11b抗体处理组中的HBV DNA平均值分别为1.01×10

基于流体动力注射的HBV携带者小鼠及治疗方案

将总共10μg溶解于8％体重PBS中的pAAV/HBV1.2注入至6至8周龄的CBA/caJ小鼠的尾部静脉中。总体积在5-7秒内递送。(Chou等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A.,2015；112(7):2175-80)。pAAV/HBV1.2含有一个HBV片段，其跨度为1400-3182/1-1987核苷酸两侧为AAV的反向末端重复序列。(Huang等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A.,2006,103(47):17862-17867)。四周后，小鼠经5mg/kg抗CD11b Ab或同型对照物Ab腹膜内(i.p.)治疗。每3-4天重复注射持续4次。在“台湾大学医学院(College of Medicine)动物实验中心(Laboratory of Animal Center)”中，所有小鼠均维持在特定的无病原体条件下。实验根据由“台湾大学医学院”指定的实验动物使用准则实施。

血清HBsAg及HBV DNA分析

使用

肝脏HBV DNA分析

为了检测肝脏HBV DNA，在液氮中研磨肝脏且使用商购试剂盒提取总肝脏基因组DNA(gDNA)。HBV DNA用实时PCR使用HBx特异性引物检测(上文所描述)。

流式细胞计分析

检查CD11b+PBMC的抗原呈递能力以用于MHC II及CD86标记的表达。将PBMC与荧光结合的抗CD11b(M1/70,ICRF44)、CD86(GL-1)、MHC II(M5/114.15.2)或适当同型对照抗体一起孵育20min。在Beckman Coulter(Indianapolis,IN,USA)CytoFLEX流式细胞仪上操作样品，且使用来自Beckman Coulter的Kaluza分析软件版本2.0执行数据采集及分析。

HepG2细胞感染测定

HepG2细胞是用10％DMEM培养基维持及使用Lipofectamine3000持续8小时孵育来转染有pAAV/HBV1.2质粒(由台湾大学的Dr.PEI-JER CHEN提供)。在转染之后，细胞经PBS冲洗三次且用具有/不具有抗人类CD11b抗体(10μg/ml)的10％DMEM培养基不断培养。每天收集细胞培养液且HBsAg的滴度是通过HBsAg定量ELISA试剂盒Rapid-II(Beacle Inc.,Kyoto,Japan)测量。HepG2细胞的RNA是通过RNeasy Mini Kit提取且经DNase治疗以移除基因组DNA污染。APOBEC3的基因表达通过如先前所描述的实时PCR评估(J.Lucifora等人,Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis B virus,Science.2014年3月14日；343(6176):1221-8)。

统计分析

数据是使用Prism 6.0(GraphPad)分析且以平均值±SEM表示。各组之间的比较是使用斯氏t检验执行。相关性是使用皮尔森相关系数测定。小于0.05的p值视为显著的。

序列表

<110> 先知生物科技股份有限公司

<120> 抑制B型肝炎病毒复制及B型肝炎表面抗原分泌的方法

<130> ASD141HBV

<150> US 62/716,375

<151> 2018-09-09

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR1

<400> 1

Asn Tyr Trp Ile Asn

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR1

<400> 2

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn Ser Ile Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR2

<400> 3

Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Thr Tyr Ile Asn His Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR2

<400> 4

Ala Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Asp Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR3

<400> 5

Ser Ala Tyr Ala Asn Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR3

<400> 6

Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR1

<400> 7

Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser Ile His

1 5 10

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR1

<400> 8

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Glu Asn Gln Glu Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR2

<400> 9

Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

1 5

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR2

<400> 10

Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR3

<400> 11

Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr Leu Thr

1 5 10

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR3

<400> 12

Gln Gln Tyr Tyr Asp Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 13

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-VH1的重链可变区

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Thr Tyr Ile Asn His Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Tyr Ala Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-VH2的重链可变区

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Thr Tyr Ile Asn His Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ser Ala Tyr Ala Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-VH3的重链可变区

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Thr Tyr Ile Asn His Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Tyr Ala Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-VH4的重链可变区

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Thr Tyr Ile Asn His Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Tyr Ala Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-VH5的重链可变区

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Thr Tyr Ile Asn His Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Tyr Ala Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Arg

115

<210> 18

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-HC1的重链可变区

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn

20 25 30

Ser Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Asp Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 19

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-HC2的重链可变区

<400> 19

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn

20 25 30

Ser Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Asp Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-HC3的重链可变区

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn

20 25 30

Ser Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Asp Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 21

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-HC4的重链可变区

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn

20 25 30

Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Asp Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-HC5的重链可变区

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn

20 25 30

Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Asp Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-VL1的轻链可变区

<400> 23

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 24

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-VL2的轻链可变区

<400> 24

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 25

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-VL3的轻链可变区

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 26

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-VL4的轻链可变区

<400> 26

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 27

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-VL5的轻链可变区

<400> 27

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 28

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-LC1的轻链可变区

<400> 28

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Glu Asn Gln Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Asp Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 29

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-LC2的轻链可变区

<400> 29

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Glu Asn Gln Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Asp Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 30

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-LC3的轻链可变区

<400> 30

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Glu Asn Gln Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Asp Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 31

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-LC4的轻链可变区

<400> 31

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Glu Asn Gln Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Asp Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 32

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗CD11b抗体-LC5的轻链可变区

<400> 32

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Glu Asn Gln Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Asp Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBx正向引物

<400> 33

ccgatccata ctgcggaac 19

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBx反向引物

<400> 34

gcagaggtga agcgaagtgc a 21