Wnt-7a在制备诊断和预示卵巢癌中的应用及Wnt-7a化学发光检测试剂盒

技术领域

本发明涉及医疗诊断技术领域，具体地说，是Wnt-7a(WNT家族成员7a，Wnt FamilyMember 7A)在制备诊断和预测卵巢癌的试剂或试剂盒中的应用，还涉及Wnt-7a化学发光检测试剂盒。

背景技术

CA125是一种诊断卵巢癌和检测其复发常用的指标之一，但患者发病早期CA125往往检测不到，其临床应用存在一定局限性。鉴于此，研究者希望能发现一种更有效的标志物，用于卵巢癌的诊断和预测。

传统的蛋白标志物检测技术仍为酶联免疫检测技术，存在操作复杂、信号不稳定、结果判定不准确等特点。

中国专利文献CN102735846A公开了一种卵巢癌肿瘤标志物HE4化学发光免疫检测试剂盒，同时还公开了采用该卵巢癌肿瘤标志物HE4化学发光免疫检测试剂盒检测卵巢癌肿瘤标志物HE4的方法。该卵巢癌肿瘤标志物HE4化学发光免疫检测试剂盒包括9F3抗体包被的微孔板、碱性磷酸酶标记的10E1抗体、分析缓冲液、底物工作液、发光底物、洗涤液、质控品。该发明提供的卵巢癌肿瘤标志物HE4化学发光免疫检测试剂盒，线性范围为0.5纳克/毫升～1200纳克/毫升，检测限为0.2纳克/毫升，可用于卵巢癌的临床辅助诊断、疗效观察及预后判断。但是关于Wnt-7a在制备诊断和预测卵巢癌的试剂或试剂盒中的应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供Wnt-7a蛋白在制备诊断和预测卵巢癌的试剂或试剂盒中的应用，阐释新的蛋白标志物Wnt-7a对于卵巢癌的诊断和预测的意义，并采用化学发光法开发蛋白标志物Wnt-7a的检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案：阐释Wnt-7a在制备诊断和预测卵巢癌的试剂或试剂盒中的应用，并依此制备相应的Wnt-7a磁微粒化学发光检测试剂盒。

1、采用自行表达Wnt-7a蛋白和制备Wnt-7a抗体的方式，获得Wnt-7a检测的原材料。

2、采用蛋白偶联到磁珠的方式，将Wnt-7a捕获抗体偶联到磁珠上获得Wnt-7a捕获载体。采用相应的标记方法，将碱性磷酸酶标记到Wnt-7a的检测抗体上，获得Wnt-7a检测抗体。将Wnt-7a标品蛋白进行相应梯度的稀释，获得Wnt-7a的检测标品。

3、采用相应例数的正常人和卵巢癌患者血清作为Wnt-7a的检测样本，用Wnt-7a捕获载体与一定量的样本混匀反应，再用清洗液将样本洗去，加入Wnt-7a检测抗体和Wnt-7a捕获载体的Wnt-7a蛋白结合，然后清洗出去杂蛋白和未结合检测抗体，检测反应底物，在检测仪器上读取检测信号，并将信号值与标曲相对应，获得对应值，比较正常人和卵巢癌患者间的Wnt-7a含量差异。

本发明的第一方面，提供Wnt-7a在制备卵巢癌诊断标志物中的应用。

本发明的第二方面，提供Wnt-7a在制备诊断和预测卵巢癌的试剂或试剂盒中的应用。

进一步的，所述的诊断和预测卵巢癌的试剂或试剂盒是Wnt-7a磁微粒化学发光法检测试剂或试剂盒。

进一步的，所述的诊断试剂或试剂盒是检测血浆中Wnt-7a的表达量的试剂或试剂盒。

更进一步的，所述的诊断试剂或试剂盒是以Wnt-7a作为生物标志物，利用磁微粒化学发光检测试剂盒，检测血浆中Wnt-7a的表达量的诊断试剂或试剂盒。

更进一步的，当磁微粒化学发光检测试剂盒检测血浆中Wnt-7a浓度高于627ng/ml时，提示患者可能患有卵巢癌。

进一步的，所述的诊断试剂或试剂盒是利用Wnt-7a的抗体，制备的磁微粒化学发光检测试剂盒。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

进一步的，所述的诊断试剂盒包括Wnt-7a蛋白、Wnt-7a偶联磁珠、AP标记Wnt-7a检测抗体、样本稀释液、清洗缓冲液和化学发光底物。

本发明的第三方面，提供一种诊断和预测卵巢癌的试剂盒，所述的试剂盒是检测血浆中Wnt-7a的表达量的试剂盒。

进一步的，所述的诊断和预测卵巢癌的试剂盒包括Wnt-7a蛋白、Wnt-7a偶联磁珠、AP标记Wnt-7a检测抗体、样本稀释液、清洗缓冲液和化学发光底物。

本发明优点在于：

1、本发明首次发现Wnt-7a蛋白作为新的卵巢癌诊断标志物，对于卵巢癌的诊断和预测具有关键意义；

2、本发明采用磁微粒化学发光法进行试剂盒开发，相较于酶联免疫技术，有助于提高检测灵敏度和操作便捷性，同时，也有助于后期配套自动化检测仪器的检测产品的开发。

附图说明

图1是Wnt-7a化学发光检测试剂盒的标准曲线。

图2是卵巢癌患者和健康人群的Wnt-7a含量散点图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：

本实施例建立Wnt-7a的双抗夹心体系，采用磁微粒化学发光法。

Wnt-7a偶联磁珠制备：将1mg Wnt-7a抗体用标记缓冲液PBS稀释至1mg/ml，将2mg生物素Sulfo-NHS-Biotin溶于100μl超纯水中，将上述两种溶液混合，室温30min或者冰上2h，过超滤管进行纯化。取纯化液，稀释至0.5mg/ml，体积为200μl，将其与500μl活化好的链霉亲和素磁珠混合、反应，室温震荡10-30min，清洗液洗涤三次，磁珠保存液重悬保存。

Wnt-7a检测抗体的标记：标记物选用碱性磷酸酶AP，采用alkalinephosphataseLabeling kit-NH2标记试剂盒，依据说明书对Wnt-7a抗体进行标记。

将Wnt-7a蛋白标品稀释至2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0ng/ml，八个浓度梯度。

实验步骤：

1、取100μl上述蛋白标品，与50μl的Wnt-7a偶联磁珠重悬，37度，15min；

2、磁力架上吸附磁微粒，15s，加入500μl清洗液，清洗，磁力架吸附磁微粒，15s，清洗三次；

3、加入AP标记Wnt-7a检测抗体100μl重悬，37度，15min；

4、磁力架上吸附磁微粒，15s，加入500μl清洗液，清洗，磁力架吸附磁微粒，15s，清洗三次；

5、加入发光底物100μl，进行信号检测。

标曲如图1，结果显示：Wnt-7a双抗夹心检测效果较好，采用现有标曲进行检测，其R

实施例2：

采用实施例1的检测体系对20例卵巢癌样本和19例正常人样本进行检测。

取100μl血浆样本进行，采用实施例1体系检测，同时制备相对于标曲，标品梯度值为实施例1梯度，实验流程如实施例1。

检测结果浓度值如表1所示：

表1

如图2所示卵巢癌患者的血浆中Wnt-7a的平均含量值979ng/ml，而正常人血浆中Wnt-7a的平均含量值为566ng/ml，患者较正常人升高了73％，具有显著差异，说明Wnt-7a作为卵巢癌检测的标志物具有诊断和区分卵巢癌患者和正常人的作用，对于后期试剂的生产具有重要意义。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。