高效液相色谱-串联质谱结合液液萃取法定量检测甲钴胺的方法

技术领域

本发明属于微量化合物检测技术领域，具体涉及一种用于高效液相色谱-串联质谱法定量检测甲钴胺的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

维生素B12又叫钴胺素，是唯一一类含有金属元素的维生素，自然界中的维生素B12都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素B12。维生素B12是需要一种肠道分泌物(内源因子)帮助才能被吸收的惟一的一种维生素。有的人由于肠胃异常，缺乏这种内源因子，即使膳食中来源充足也会患恶性贫血。植物性食物中基本上没有维生素B12.它在肠道内停留时间长，大约需要三小时(大多数水溶性维生素只需要几秒钟)才能被吸收。维生素B12的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏。

维生素B12的家族成员主要包括：氰钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺和甲钴胺。氰钴胺也被泛称为维生素B12。人体只能直接利用两种维生素B12—甲钴胺和腺苷钴胺，二者是体内维生素B12的两种活性辅酶形式。其它钴胺素则要在细胞的细胞器中转化为这两种形式后才能被人体利用。

甲钴胺属于辅酶型的一种维生素，甲钴胺甲基化的官能团能够参与到体内甲基转移作用中，从而对体内神经组织核酸、蛋白质和脂肪的新陈代谢等都具有良好促进作用。在人体代谢中，甲钴胺和腺苷钴胺能够直接参与体内代谢，对疾病起到直接治疗作用。

甲钴胺对神经组织具有良好的传递性，可促进核酸-蛋白-脂肪代谢，修复受损的神经组织，在临床上对有糖尿病引起的神经障碍、多发性神经炎等周围神经病，尤其对麻木、疼痛和麻痹有明显的疗效。在治疗周围神经病变方面，甲钴胺临床应用的安全性及疗效均优于腺苷钴胺和氰钴胺。《2013糖尿病周围神经病变诊断和治疗共识》推荐补充B族维生素可以改善糖尿病神经病变，针对神经营养修复治疗推荐甲钴胺作为辅助治疗。所以人体内甲钴胺的含量检测对于评价VB12的营养情况以及药物浓度监测方面有重要作用。

血清维生素B12的测定是最直接的鉴定方法。目前血清检测方法主要有化学发光法、液相色谱-串联质谱法、液相色谱-电感耦合等离子体法等。其中液相色谱-串联质谱法只单一检测VB12中的氰钴胺，并不包含甲钴胺的检测。有研究发现：甲钴胺极不稳定，尤其在水溶液条件下，见光迅速分解，因此，需要对于甲钴胺在检测中的稳定性进行研究。

发明内容

为了克服上述问题，本发明建立了一种高效液相色谱－质谱联用法(HPLC－MS/MS)测定血清中甲钴胺浓度的方法，用于临床上甲钴胺的浓度监测。将血清经过液液萃取的前处理后，用质谱扫描甲钴胺离子对，对其进行浓度定量。从特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、回收率和稳定性等方面对甲钴胺在人血清中的测定进行了充分的验证。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种高效液相色谱-串联质谱结合液液萃取法定量检测甲钴胺的方法，包括：

取甲钴胺标准品配制甲钴胺储备液，在避光条件下进行；

以氰钴胺内标成品作为内标溶液；

在避光条件下，取血清样品，加入内标溶液，预处理后，采用正己烷进行液液萃取，均质、离心，取上清液，吹干，再用甲醇复溶，取上清溶液，进行HPLC－MS/MS分析，以内标法测定血清样品中甲钴胺浓度。

本发明介绍了一种高效液相色谱-串联质谱法检测血清中甲钴胺含量的方法，用于临床上甲钴胺的浓度监测。

本发明首次将液液萃取法应用于甲钴胺的前处理中，大大提高了提取效率，结合高效液相色谱-串联质谱法的高灵敏度，可对人体中低含量的甲钴胺进行药物浓度检测，也可用该指标反映人体内维生素B12的营养状况，解决了质谱法单一检测氰钴胺代表维生素B12的片面性。

本发明的第二个方面，提供了液液萃取在高效液相色谱-串联质谱法定量检测甲钴胺中的应用。

与已有高效液相色谱－质谱联用法(HPLC－MS/MS)检测甲钴胺浓度的方法相比，我们在样本提取方法上做了改进，对比蛋白沉淀的方法，液液萃取的前处理方法能更好的将甲钴胺提取出来，这样大大提高了甲钴胺的提取效率，降低了检测甲钴胺的定量限，同时节省了仪器成本。

本发明的有益效果在于：

(1)对比常规蛋白沉淀法,常规蛋白沉淀法提取液为甲醇。如表1所示，液液萃取法可以明显提高的甲钴胺的提取效果，这对于血清中浓度水平为纳克级的物质来说非常重要，甲钴胺的信号(用峰面积表示)提高了10倍，且基线明显降低，信噪比更优。峰面积对比结果见下表，色谱峰图如图1。

(2)本发明首次将液液萃取法应用于甲钴胺的前处理中，大大提高了提取效率，结合高效液相色谱-串联质谱法的高灵敏度，可对人体中低含量的甲钴胺进行药物浓度检测，也可用该指标反映人体内维生素B12的营养状况，解决了质谱法单一检测氰钴胺代表维生素B12的片面性。

(3)与已有高效液相色谱－质谱联用法(HPLC－MS/MS)检测甲钴胺浓度的方法相比，我们在样本提取方法上做了改进，对比蛋白沉淀的方法，液液萃取的前处理方法能更好的将甲钴胺提取出来，这样大大提高了甲钴胺的提取效率，降低了检测甲钴胺的定量限，同时节省了仪器成本。

(4)本发明的检测方法简单、操作方便、实用性强，易于推广。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例1中蛋白沉淀法提取甲钴胺色谱图(左)；液液萃取法提取甲钴胺色谱图(右)；

图2是本发明实施例1中甲钴胺、氰钴胺内标色谱图；

图3是本发明实施例1中甲钴胺标准曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

一种高效液相色谱-串联质谱结合液液萃取法定量检测甲钴胺的方法，包括：

取甲钴胺标准品配制甲钴胺储备液，在避光条件下进行；

以氰钴胺内标成品作为内标溶液；

在避光条件下，取血清样品，加入内标溶液，预处理后，采用正己烷进行液液萃取，均质、离心，取上清液，吹干，再用甲醇复溶，取上清溶液，进行HPLC－MS/MS分析，以内标法测定血清样品中甲钴胺浓度。

在一些实施例中，所述预处理的具体步骤包括：均质，沉淀蛋白，以纯化血清，提高检测效果。

在一些实施例中，所述均质的条件为：涡旋30～40s，以降低分散物尺度和提高分散物分布均匀性；

在一些实施例中，采用乙腈溶液沉淀蛋白，以有效地去除蛋白。

在一些实施例中，流动相A:含0.1％甲酸的水溶液；流动相B：含0.1％甲酸的甲醇溶液，以提高HPLC的分析效果。

在一些实施例中，所述色谱柱为C18柱，柱温:40～45℃；流速:0.4～0.6mL/min，以获得较好的HPLC分析效果。

在一些实施例中，梯度洗脱:0～1.0min，1％B相，3.0～6.0min，98％B相，6.5～9min，1％B相，以缩短检测时间，提高检测准确性。

在一些实施例中，甲钴胺和氰钴胺内标的检测离子对分别为m/z673→147和m/z682→154，以获得较好的质谱分析效果。

在一些实施例中，透镜电压分别为60～65V，45～50V；碰撞电压分别为90～95V，40～45V；采用电喷雾ESI源正离子方式，离子源温度350～360℃、正离子电压3500～3600V，以获得较好的质谱分析效果。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1：

甲钴胺(对照品)，纯度:>97％；氰钴胺－d7(内标)，纯度:>99％。

用同位素标记的氰钴胺做内标，其性质与甲钴胺相似，可以减小实验过程中带来的误差，提高准确性，同时也可反映甲钴胺与氰钴胺的分离情况。

仪器：YS EXT 9050MD高效液相色谱串联质谱检测系统。

飞诺美Kinetex polor C18色谱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)；流动相A:含0.1％甲酸的水溶液；流动相B：含0.1％甲酸的甲醇溶液；柱温:40℃；流速:0.4mL/min。梯度洗脱:0～1.0min，1％B，3.0～6.0min，98％B，6.5～9min，1％B。

甲钴胺和氰钴胺内标的检测离子对分别为m/z 673→147和m/z 682→154；透镜电压分别为60V，45V；碰撞电压分别为90V，40V；采用电喷雾ESI源正离子方式，离子源温度350℃、正离子电压3500V。

对照品储备溶液甲钴胺系列标准溶液的配制：取甲钴胺标准品10mg，置于10mL棕色容量瓶中，并加入甲醇10mL溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得1mg/mL甲钴胺储备液，此过程全程避光操作。氰钴胺内标成品即为1μg/mL溶液。临用时，用甲醇稀释至所需浓度。

血清样本处理：取血清样品100μL于棕色玻璃瓶中，加入内标溶液(1μg/mL)1μL，涡旋30s，加入乙腈溶液100μL沉淀蛋白，混匀后，加入1.5mL正己烷进行液液萃取，涡旋10min，离心10min，取出上清液，氮气吹干，再用100μL50％甲醇(甲醇：水＝1：1，v/v)复溶，复溶后转入进样板，进行HPLC－MS/MS分析，所有操作在避光条件下进行。

实验验证：

对比常规蛋白沉淀法，常规蛋白沉淀法提取液为甲醇。如表1所示，液液萃取法可以明显提高的甲钴胺的提取效果，这对于血清中浓度水平为纳克级的物质来说非常重要，甲钴胺的信号(用峰面积表示)提高了10倍，且基线明显降低，信噪比更优。峰面积对比结果见下表，色谱峰图如图1。

表1蛋白沉淀与液液萃取提取甲钴胺峰面积对比表

对建立的高效液相串联质谱的方法可行性进行考察的方法包括对检测限、定量限、精密度、准确度、提取回收率。

线性关系及检测限、定量限：取甲钴胺标准溶液与牛血清白蛋白(BSA)精确配制10ng/mL，用BSA倍比稀释一系列不同浓度的标准曲线浓度。提取方法与样本相同，以甲钴胺/氰钴胺内标与浓度的峰面积比构建校准曲线，得到回归方程和相关系数。以信噪比(S/N)≥3对应的浓度为检出限，(S/N)≥10对应的浓度作为定量限，得到甲钴胺的检出限和定量限，结果见表2。

表2人血清中测定甲钴胺含量方法的线性、检测限和定量限

精密度：在同一天对四种浓度(0.1、0.5、2.0和5.0ng/mL)的六个重复的定量限(LLOQ)样本和质控(QC)样本进行分析，以评估日内精密度和准确度。通过连续三天分析LLOQ和QC样本来评估日间精密度和准确度。方法的精密度和准确度分别用相对标准偏差(RSD)和相对误差(RE)表示。RSD和RE均不得超过15％。然而，在LLOQ，RE和RSD<±20％是可以接受的。LLOQ和QC样品中甲钴胺的精密度和准确度结果见表3。甲钴胺各样品水平的精密度(RSD)均小于15％。对甲钴胺各样品水平的准确度在85％到115％之间。测定值均在可接受范围内。

表3人血清中测定甲钴胺含量方法的精密度和准确度

提取回收率：选择临床样品，将其分为体积相同的3份，每份100μL。在其中1份样本中加入5μL不含待测物的空白试剂(甲醇色谱级或以上)，作为基础样本；而在另2份样本中各加入5μL不同浓度的待测物标准品溶液，加入后样本中的标准液浓度见表4，制成2个不同加入浓度的回收样本。要求加入标准液后低水平样本中的待测物在参考范围中间值附近，而高水平样本中的待测物达到参考范围上限。不同浓度下甲钴胺的提取回收率结果准确、重现性好。

表4人血清中测定甲钴胺含量方法的提取回收率

稳定性试验：对甲钴胺标准品溶液在不同条件下的稳定性进行了分析，每个条件分析三个浓度：(1)分别用水、甲醇稀释甲钴胺标准品溶液，放置10天后，将不同浓度溶液提取后进行检测；(2)全程避光提取或见光提取；(3)全程低温操作或室温操作。通过比较储存的甲钴胺标准品溶液和经过处理后的溶液的平均浓度来评估溶液的稳定性，与标称浓度的偏差在±15.0％以内。所有稳定性试验样品在6个重复中进行分析。甲钴胺用水稀释或用甲醇稀释在避光条件下储存稳定性没有明显区别；避光操作是必要的，可避免甲钴胺的降解；低温与常温条件下提取对甲钴胺的稳定性没有影响。结果见表5。

表5甲钴胺溶液的稳定性(n＝6，以Mean±R.E.％表示)

由图1可知，甲钴胺的保留时间为5.70min，氰钴胺内标出峰时间为5.36min，甲钴胺与氰钴胺的色谱峰已经分开，两种物质不会互相干扰。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。