一种1型糖尿病新动物模型的构建方法

技术领域

本发明属于糖尿病动物模型制备领域，具体涉及一种1型糖尿病新动物模型的构建方法。

背景技术

1型糖尿病(T1D)又名胰岛素依赖型糖尿病(Insulin Dependent DiabetesMellitus，IDDM)是由于自身反应T细胞攻击分泌胰岛素的胰岛β细胞而引起的自身免疫疾病。一旦β细胞功能受损，胰岛素的分泌受阻，血糖无法控制在正常水平就会诱发酮酸中毒和严重高血糖，还会诱发失明和晚期肾病等严重并发症。

在环境和易感基因的共同作用下，1型糖尿病患者机体出现明显的免疫异常。控制免疫平衡的调节性T细胞数量或功能失常，导致机体向炎症方向发展。早期的CD8

化学药物诱发的动物模型中，最常用的诱导急性1型糖尿病的化学药物是四氧嘧啶(Alloxan，ALX)和链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，它们属于葡萄糖类似物通过GLUT2葡萄糖转运体预先在胰岛β细胞中积累。胞内存在硫醇的情况下，四氧嘧啶通过反应产物羟基自由基导致β细胞死亡，同时通过抑制葡萄糖激酶来阻止胰岛素的分泌。链脲佐菌素可直接烷基化β细胞DNA，或者损伤线粒体DNA来抑制β细胞的线粒体代谢，从而阻止胰岛素的分泌。但四氧嘧啶除了损伤胰岛，还可能造成其他器官的损伤。不同于1型糖尿病在低龄儿童青少年高发，年长的动物对四氧嘧啶毒性更难敏感。四氧嘧啶不稳定且半衰期很短，在37℃，pH7.4的磷酸盐缓冲液半衰期为1.5分钟，在水溶液中迅速分解为不致糖尿病的阿脲酸。研究表示阿脲酸或者四氧嘧啶其他的转化产物，能够损伤动物的肝组织。所以不稳定的四氧嘧啶更容易损伤其他器官。考虑到这些缺点，四氧嘧啶逐渐被链脲佐菌素所替代。

链脲佐菌素诱导的是的糖尿病模型，有明显的胰岛炎。多次小剂量的链脲佐菌素能促进转基因小鼠局部淋巴细胞增殖以及加强β细胞表面T细胞共刺激分子CD80表达。最新的研究也表示高剂量的链脲佐菌素引起胰岛炎症是由于巨噬细胞吞噬坏死的β而完全不会激起适应性免疫。目前免疫细胞在链脲佐菌素诱导的糖尿病模型中的机制仍不清楚。

给小鼠注射高剂量(150mg/kg)的链脲佐菌素能诱发急性的糖尿病，不引发任何并发症。与人1型糖尿病不同的是，这种急性的糖尿病不是免疫介导的，高剂量链脲佐菌素直接对β细胞产生毒性导致快速且严重的毒性糖尿病。即便根据调节链脲佐菌素剂量能够快速获得所需要的糖尿病模型，但是链脲佐菌素诱导的模型不稳定，容易受实验的动物种类，食物摄取量，实验动物起始体重等外在因素影响。

例如：中国专利201910064657.7公开了一种Ⅰ型糖尿病动物模型的构建方法，选用C57BL/6小鼠首次尾静脉注射，而后连续5天腹腔注射50mg/kg·BW链脲佐菌素试剂，该方法造模简便、成模率高，但是只能满足1型糖尿病发病症状的部分特点(血糖提高)，未能考虑到发病症状免疫学上的一致。

例如：中国专利201610741829.6公开了一种1型糖尿病动物模型的建立方法和用途，利用100mg/kg链脲佐菌素诱导的方法，建立了稳定的食蟹猴1型糖尿病模型，能完全诱导形成1型糖尿病且不引发并发症的发生。该发明不仅对血糖指标进行了评价，也对免疫水平进行了评价，但是该模型选用的动物食蟹猴在实际应用中成本较高，因此需要一种用途更广的动物模型。

NOD(non-obese diabetic)小鼠是一种常用的1型糖尿病动物模型，原因在于其胸腺异常的结构导致胸腺细胞无法分泌自身抗原，使得T细胞在发育过程中无法阴性选择，这些自身反应的T细胞逃离到外周致病。其发病特征表现为多尿，多饮，糖尿高血糖伴随消瘦。雌鼠在2-4周出现胰岛炎症，雄性稍晚为5-7周。无菌环境中，30周龄雌鼠发病率为90％以上，而雄鼠为50％-80％。NOD小鼠早期高血糖和糖尿出现无需胰岛素治疗仍可存活数周。尽管NOD现在作为一个常用的1型糖尿病动物模型来研究人1型糖尿病的发病进程和治疗方法，但是它跟人的1型糖尿病之间有很多差异。组织学上显示发病的NOD小鼠胰岛中心有大量炎症细胞浸润而1型糖尿病患者胰岛中只检测到少量的白细胞。与1型糖尿病临床患者不同，NOD发病背景主要是CD4

尽管有越来越多的1型糖尿病动物模型被开发用于1型糖尿病发病机制的探讨，但是目前的动物模型与人1型糖尿病临床特点很难高度一致，尤其是广泛使用的NOD小鼠由于自然发病的特点，被广为应用于临床前治疗药物的药效评价。不幸的是，在小鼠有效的治疗药物在人体上并无显著效果，甚至加速疾病的发展。这些失败让研究者不断的思考是否NOD小鼠的发病机制与人差异很大。所以，迫切需要开发一个新的且更加接近人类1型糖尿病发病的状态的动物模型。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种1型糖尿病新动物模型的构建方法。

本发明提供的构建方法针对原始动物进行诱导胰岛细胞损伤结合条件性敲除调节性T细胞(Regulatory T cells，Tregs)来诱导1型糖尿病。其具体原理在于利用链脲佐菌素诱导胰岛β细胞损伤产生炎症，同时敲除调节性T细胞造成自身反应性T细胞进一步攻击胰岛β细胞，从而造成类似人类1型糖尿病相同的发病机制。

本发明通过诱导胰岛细胞损伤和条件性敲除调节性T细胞完成1型糖尿病新动物模型构建。

具体地，所述的原始动物包括但不限于原始小鼠。

更具体地，所述的原始小鼠包括但不限于BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠。

进一步具体地，所述的原始小鼠包括但不限于Foxp3-DTR-eGFP小鼠。

具体地，所述的诱导胰岛细胞损伤包括但不限于注射胰岛细胞损伤诱导剂。

进一步具体地，所述的胰岛细胞损伤诱导剂包括但不限于四氧嘧啶和/或链脲佐菌素。进一步优选为链脲佐菌素。

进一步具体地，所述的链脲佐菌素的注射量为20-200mg/kg体重；优选为40-80mg/kg体重；进一步优选为50mg/kg体重。

进一步具体地，所述的四氧嘧啶的注射量为50-500mg/kg体重；优选为80-250mg/kg体重；进一步优选为100-200mg/kg体重。

在一些实施方案中，所述的胰岛细胞损伤诱导剂在上述剂量下连续注射1-5天，每天注射一次；优选为连续3-4天，每天注射一次；进一步优选为连续3天，每天注射一次。

具体地，所述的条件性敲除调节性T细胞包括但不限于注射白喉毒素(DT)。

优选地，所述的白喉毒素的注射量为0.001-0.1mg/kg体重；优选为0.005-0.05mg/kg体重；进一步优选为0.0125mg/kg体重。

进一步具体地，所述的注射方法可以为腹腔注射。也可以为能够达到等同效果的其他注射方式。

具体地，所述的诱导胰岛细胞损伤和条件性敲除调节性T细胞可以同步进行，也可以先后进行。

进一步具体地，所述的注射链脲佐菌素和注射白喉毒素可以同步进行，也可以先后进行。

一些具体的实施例中，所述的注射链脲佐菌素在注射白喉毒素之前进行。

作为一些具体的优选的实施例，所述的构建方法包括以下步骤：

(1)原始动物准备；

(2)药物准备：

配制链脲佐菌素溶液，

配制白喉毒素溶液；

(3)药物注射：

给与原始动物40-80mg链脲佐菌素/kg体重的链脲佐菌素溶液腹腔注射以及0.001-0.1mg白喉毒素/kg体重的白喉毒素溶液注射。

作为一些推荐的构建方法，原始动物准备包括将原始动物在无特殊病原体(specific pathogen free，SPF)环境下常规饲养1-3周。

作为一些推荐的构建方法，链脲佐菌素溶液的浓度可以为10mg/mL。

作为一些推荐的构建方法，链脲佐菌素溶液的缓冲体系可以为柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐溶液、PBS溶液、PB溶液或生理盐水溶液。

作为一些推荐的构建方法，白喉毒素溶液的浓度可以为2.5μg/mL。

作为一些推荐的构建方法，白喉毒素溶液的缓冲体系可以为磷酸盐缓冲液、注射用水、PBS溶液、PB溶液或生理盐水溶液。

作为一些推荐的构建方法，所述的注射采用腹腔注射的方式。

在一些优选的实施方案中，先连续1-5天，每天注射50mg/kg体重的链脲佐菌素；再注射一次0.0125mg/kg体重的白喉毒素。进一步优选为先连续3天，每天注射50mg/kg体重的链脲佐菌素；再注射一次0.0125mg/kg体重的白喉毒素。

根据以上方法建立的小鼠1型糖尿病模型，通过血糖变化检测、糖耐量测试、血清胰岛素测定、C-肽浓度测定、糖化血红蛋白(HbA1c)含量测定、存活率计算、胰腺T细胞的浸润实验、抗原特异性的T细胞免疫反应实验、导致酮症酸中毒的β-羟丁酸水平测定，对比糖尿病动物模型NOD/ShiLtJ小鼠，结果显示，相对于NOD/ShiLtJ小鼠，本发明提供的方法构建的小鼠1型糖尿病模型在构建成功后不仅在血糖变化上与人类1型糖尿病症状相似，并且在模型胰腺组织中存在胰岛抗原特异性的T细胞免疫反应。在本发明提供的方法构建的小鼠模型胰腺中均可发生炎症细胞浸润，该浸润的炎症细胞以CD8 T细胞为主，且有一定数量的CD4 T细胞。该T细胞为胰岛相关抗原特异性T细胞，与人体中发现的特异性T细胞一致，而NOD/ShiLtJ小鼠中不存在此种反应。并且本发明提供的方法构建的小鼠体内β-羟丁酸水平升高，与人类1型糖尿病酮症酸中毒症状一致。另外，NOD/ShiLtJ小鼠在糖耐量实验中表现为发病前期就已经出现了异常的糖代谢，本发明提供的模型构建方法构建出的模型则可以避免此不足。相对于NOD/ShiLtJ小鼠，本发明提供的模型构建方法构建出的模型与人类1型糖尿病症状更为相近。

本发明提供的方法构建出的新型动物模型与人体1型糖尿病发病机制一致，均为自身免疫性疾病，且发病症状与人类1型糖尿病发病症状及指标高度一致。且该动物模型制备方便，发病率高，无性别选择性，发病周期可控。

本发明还提供了通过上述模型构建出的小鼠在1型糖尿病相关研究中的应用。

具体地，所述应用包括但不限于对糖尿病发病机制的研究、胰岛细胞移植技术的评价、1型糖尿病药物的筛选和评价、抗高血糖保健食品评价中的应用。

附图说明

图1为1型糖尿病新动物模型初建立中的各组小鼠的注射方式示意图以及各指标检测结果。

图2为注射不同量链脲佐菌素的Foxp3-DTR-eGFP小鼠的血糖检测结果。

图3为1型糖尿病新动物模型与NOD/ShiLtJ小鼠模型血糖变化和发病率的对比。

图4为1型糖尿病新动物模型与NOD/ShiLtJ小鼠模型糖耐量测试的结果对比。

图5为1型糖尿病新动物模型与NOD/ShiLtJ小鼠模型血清胰岛素和C-肽浓度的比较。

图6为1型糖尿病新动物模型与NOD/ShiLtJ小鼠模型胰腺组织的免疫荧光染色结果和外周血中HbA1c含量变化。

图7为1型糖尿病新动物模型与NOD/ShiLtJ小鼠模型血清β-羟丁酸含量变化。

图8为1型糖尿病新动物模型与NOD/ShiLtJ小鼠模型生存曲线。

图9为1型糖尿病新动物模型与NOD/ShiLtJ小鼠模型胰腺组织的免疫荧光染色结果和流式细胞术检测细胞免疫反应结果。

图10为1型糖尿病新动物模型与NOD/ShiLtJ小鼠模型胰岛抗原特异性T细胞反应实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所有实施例中的实验动物中，6-8周的BALB/c背景的Foxp3-DTR-eGFP小鼠购买自美国Jackson Lab，6-8周的BALB/c小鼠购买自上海杰斯捷实验动物有限公司，10周雌性non-obese diabetic ShiLtJ(NOD/ShiLtJ)小鼠购自北京华阜康生物技术有限公司。小鼠均饲养在SPF环境条件下。所有购买的小鼠进行实验前，均放置在SPF环境适应1周。

血糖测量方法为：小鼠眼眶采集10μL血液，使用血糖仪(北京怡成JPS-5型血糖仪)测量并记录血糖浓度。具体测量方法参照血糖仪使用说明书。

免疫荧光染色方法为：取小鼠整个胰腺组织，至6mL、4％多聚甲醛中固定。进行HE和免疫荧光检测。HE切片用普通显微镜在40倍镜下观察。免疫荧光切片使用共聚焦显微镜油镜下观察。

实施例1 1型糖尿病小鼠模型的构建方法

链脲佐菌素溶液的配制及注射：避光称取链脲佐菌素粉末，用pH4.5的浓度100mM的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液配制为链脲佐菌素浓度为10mg/mL的溶液。每次从溶解开始5分钟内腹腔注射100μL至小鼠体内(即50mg/kg体重的链脲佐菌素剂量)。

白喉毒素溶液的配制及注射：0.25μg白喉毒素溶于100μL pH7.4的浓度100mM的PBS缓冲液中，每次小鼠腹腔注射100μL(即0.0125mg/kg体重的白喉毒素剂量)。

构建过程：

(1)链脲佐菌素注射

选取6-8周体重约20克的BALB/c背景的Foxp3-DTR-eGFP小鼠。以注射白喉毒素溶液当日计为0天，其前1日计为-1天，其后一日计为+1天；以此类推。

小鼠分组：

DT组：第0天注射白喉毒素剂量为0.0125mg/kg体重的的白喉毒素溶液。

1×STZ组：第-1天注射链脲佐菌素剂量为50mg/kg体重的链脲佐菌素溶液，第0天不进行任何药物注射。

2×STZ组：第-2天、-1天每天注射链脲佐菌素剂量为50mg/kg体重的链脲佐菌素溶液，第0天不进行任何药物注射。

3×STZ组：第-3天、-2天、-1天每天注射链脲佐菌素剂量为50mg/kg体重的链脲佐菌素溶液，第0天不进行任何药物注射。

5×STZ组：第-5天、-4天、-3天、-2天、-1天每天注射链脲佐菌素剂量为50mg/kg体重的链脲佐菌素溶液，第0天不进行任何药物注射。

1×STZ+DT组：第-1天注射链脲佐菌素剂量为50mg/kg体重的链脲佐菌素溶液，第0天注射白喉毒素剂量为0.0125mg/kg体重的的白喉毒素溶液。

2×STZ+DT组：第-2天、-1天每天注射链脲佐菌素剂量为50mg/kg体重的链脲佐菌素溶液，第0天注射白喉毒素剂量为0.0125mg/kg体重的的白喉毒素溶液。

3×STZ+DT组：第-3天、-2天、-1天每天注射链脲佐菌素剂量为50mg/kg体重的链脲佐菌素溶液，第0天注射白喉毒素剂量为0.0125mg/kg体重的的白喉毒素溶液。

5×STZ+DT组：第-5天、-4天、-3天、-2天、-1天每天注射链脲佐菌素剂量为50mg/kg体重的链脲佐菌素溶液，第0天注射白喉毒素剂量为0.0125mg/kg体重的的白喉毒素溶液。

PBS组：第-5天、-4天、-3天、-2天、-1天、0天每天注射pH为7.4浓度为100mM的PBS缓冲液。

实验例1 1型糖尿病新动物模型初步建立

针对实施例1中各组小鼠进行相关指标检测

注射方式示意图以及各指标检测结果如图1所示：

图1-A示意1×STZ组、2×STZ组、3×STZ组、5×STZ组小鼠的注射方式以及血糖监测方式。

图1-B为PBS组、组1×STZ组、2×STZ组、3×STZ组、5×STZ组小鼠的血糖变化。

图1-C为PBS组、5×STZ组小鼠的胰岛局部免疫荧光染色。注射结束第+6天取出小鼠胰岛，进行胰岛素(绿色)，CD3(红色)和DAPI(蓝色)染色。

比例尺＝25μm。

图1-D为PBS组、DT组小鼠的外周血Treg细胞比例变化。在第0，+1，+6，+12天分别检测小鼠外周血Treg细胞比例。

图1-E为PBS组、DT组小鼠的血糖变化。

图1-F为PBS组、DT组小鼠的胰岛局部免疫荧光染色。注射结束第+6天取出小鼠胰岛，进行胰岛素(绿色)，CD3(红色)和DAPI(蓝色)染色。比例尺＝25μm。

图1-G示意5×STZ+DT组小鼠的注射方式以及血糖监测方式。

图1-H为PBS组、5×STZ+DT组小鼠的血糖变化。

图1-I为PBS组、5×STZ+DT组小鼠的胰岛局部免疫荧光染色。注射结束第+6天取出小鼠胰岛，进行胰岛素(绿色)，CD3(红色)和DAPI(蓝色)染色。比例尺＝25μm。

结果分析：单独的损伤局部胰岛或者打破免疫平衡不能够引起T细胞参与的高血糖(图1-A、B、C、D、E、F)。将链脲佐菌素和注射白喉毒素联合起来，发现5×STZ+DT后的小鼠在白喉毒素注射后第3天就引起高血糖，并且第6天达到最高，免疫荧光结果显示此时的胰岛有CD3

实验例2 1型糖尿病新动物模型链脲佐菌素剂量筛选

针对实施例1中各组小鼠进行相关指标检测

注射方式示意图以及各指标检测结果如图2所示：

图2-A示意1×STZ+DT组、2×STZ+DT组、3×STZ+DT组、5×STZ+DT组小鼠的注射方式以及血糖监测方式。

图2-B为PBS组、1×STZ+DT组、2×STZ+DT组、3×STZ+DT组、5×STZ+DT组小鼠的血糖变化。

图2-C为PBS组、1×STZ+DT组、2×STZ+DT组、3×STZ+DT组、5×STZ+DT组小鼠的存活百分数。

5×STZ+DT组在第3天就能够引起小鼠急剧高血糖，而3×STZ+DT组在2周左右引起小鼠持续的高血糖，并且发病率与5×STZ+DT接近，而2×STZ+DT组和1×STZ+DT组小鼠几乎不发生高血糖。1×STZ+DT组、2×STZ+DT组、3×STZ+DT组、5×STZ+DT组的注射方式均能一定程度引起小鼠高血糖，因此都能用来建立1型糖尿病动物模型；但3×STZ+DT组的构建方式为一种优选的建立1型糖尿病动物模型的方法。

实验例3 1型糖尿病新动物模型与NOD小鼠血糖变化的比较

为了验证3×STZ+DT能够成功建立新的1型糖尿病模型，通过检测1型糖尿病临床症状来评价动物模型是否成功，同时与自发性动物模型NOD/ShiLtJ小鼠作比较。

针对实施例1中各组小鼠进行相关指标检测。

注射方式示意图以及各指标检测结果如图3所示：

图3-A示意3×STZ+DT组小鼠的注射方式以及血糖监测方式，以及NOD/ShiLtJ小鼠的血糖监测方式。

图3-B为PBS组、DT组、3×STZ组、3×STZ+DT组小鼠的血糖变化。

图3-C为PBS组、DT组、3×STZ组、3×STZ+DT组小鼠的发病率情况。

图3-D为NOD/ShiLtJ小鼠的血糖变化。

图3-E为NOD/ShiLtJ小鼠的发病率情况。

血糖结果显示3×STZ+DT小鼠白喉毒素注射后第9天发生高血糖，2周左右发病率达到80％以上，而仅仅注射3×STZ，敲除Treg细胞不引起小鼠高血糖。NOD/ShiLtJ小鼠从第12周开始陆续产生高血糖，第27周发病率达到75％。以上结果表示3×STZ+DT与NOD/ShiLtJ模型均能产生高血糖。

实验例4 1型糖尿病新动物模型与NOD/ShiLtJ小鼠口服糖耐量(OGTT)的比较

临床上通过2小时口服糖耐量测试患者对于外源性葡萄糖的利用能力，以此评价患者胰岛β细胞功能。小鼠的口服糖耐量测试采用禁食6小时后，小鼠给予2g/kg葡萄糖，分别于30min、60min、90min、120min检测血糖。

针对实施例1中各组小鼠进行口服糖耐量实验。

注射方式示意图以及各指标检测结果如图4所示：

图4-A示意3×STZ+DT组小鼠的注射方式以及给与葡萄糖方式，以及NOD/ShiLtJ小鼠的给与葡萄糖方式。

图4-B为PBS组、DT组、3×STZ组、3×STZ+DT组小鼠的血糖变化。

图4-C为NOD/ShiLtJ小鼠的血糖变化。

对照组小鼠在口服葡萄糖30分钟后血糖达到最高，60分钟后血糖回到起始状态，整个血糖的波动处于正常血糖范围(<16.7mmol/L)，而3×STZ+DT组小鼠的血糖在饮用高糖30分钟高于16.7mmol/L，且120分钟后仍处于高血糖状态。表明3×STZ+DT组小鼠无法正常利用外源葡萄糖。在NOD/ShiLtJ小鼠中，发病前期(血糖在150-250mg/dL)的小鼠在饮用高糖后，30分钟达到顶峰且高于正常水平，而无糖尿病的NOD/ShiLtJ小鼠血糖30分钟达到最高，直到120分钟，血糖波动均在正常范围内。此结果表示NOD/ShiLtJ小鼠在发病前期已经出现了异常的糖代谢。

实施例5 1型糖尿病新动物模型与NOD/ShiLtJ小鼠血清胰岛素和C-肽浓度的比较

1型糖尿病患者血清胰岛素和C-肽水平是临床上反应胰岛β细胞分泌胰岛素功能的常用诊断指标。为了进一步验证胰岛β细胞的功能，采集小鼠的空腹血清，检测血清胰岛素和C-肽含量。空腹血清需将小鼠断粮6小时后采血。

针对实施例1中各组小鼠进行相关指标检测。

注射方式示意图以及各指标检测结果如图5所示：

图5-A示意3×STZ+DT组小鼠的注射方式以及血清采集方式，以及NOD/ShiLtJ小鼠的血清采集方式。

图5-B为PBS组、DT组、3×STZ组、3×STZ+DT组小鼠的血清胰岛素变化。

图5-C为NOD/ShiLtJ小鼠的血清胰岛素的变化。

图5-D为PBS组、DT组、3×STZ组、3×STZ+DT组小鼠的血清C-肽含量变化。

图5-E为NOD/ShiLtJ小鼠的血清C-肽含量变化。

结果显示，3×STZ+DT组小鼠的血清胰岛素随着血糖的升高逐渐下降，在2周后显著低于3×STZ和DT组。同时检测发病后NOD/ShiLtJ小鼠血清胰岛素，随着病程推移小鼠血清胰岛素逐渐降低显著低于健康的NOD/ShiLtJ小鼠，并且在发病2周后几乎检测不到血清胰岛素的表达。血清C-肽的数据显示在注射白喉毒素后第7天左右，3×STZ+DT组小鼠血清C-肽水平有代偿性升高，后持续下降显著低于对照组。与此同时检测发病NOD/ShiLtJ小鼠血清C-肽，也发现随着高血糖的发展，C-肽逐渐减少并显著低于健康NOD/ShiLtJ小鼠。

为了进一步证明链脲佐菌素联合白喉毒素引起的高血糖是β细胞损伤引起的，第9天取出小鼠胰腺组织进行免疫荧光染色。

图5-F为PBS组、DT组、3×STZ组、3×STZ+DT组和NOD/ShiLtJ小鼠胰腺组织的免疫荧光染色结果。

对照组小鼠胰腺中能看到分泌胰岛素的β细胞，而3×STZ+DT小鼠中几乎看不到分泌胰岛素的细胞，3×STZ+DT和3×STZ小鼠胰岛中观察到表达胰高血糖素的细胞的增多。同时观察NOD/ShiLtJ小鼠，发现2周大NOD/ShiLtJ小鼠的胰腺组织中有明显的表达胰岛素的细胞，随着小鼠增长到10周龄，小鼠仍然有明显的胰岛素分泌，且胰岛周围有致密细胞核，预示着炎症细胞的存在，小鼠17周发生高血糖(血糖>16.7mmol/L)后，胰岛中几乎没有表达胰岛素的细胞存在，反而表达胰高血糖素的细胞数目在增加。以上结果证明3×STZ+DT小鼠和NOD/ShiLtJ小鼠发病后β细胞分泌胰岛素的功能受损，并且伴随着表达胰岛素的β细胞团块的消失。

实验例6 1型糖尿病新动物模型和NOD/ShiLtJ小鼠外周血HbA1c含量的比较

患者血液中高浓度的葡萄糖能与血红蛋白结合形成稳定的糖基化血红蛋白(HbA1c)。HbA1c随着红细胞3-4个月的更新而消失，所以这个指标反应3个月左右糖尿病患者对血糖的控制能力。

针对实施例1中各组小鼠进行相关指标检测。

注射方式示意图以及各指标检测结果如图6所示：

图6-A示意3×STZ+DT组小鼠的注射方式以及外周血采集方式，以及NOD/ShiLtJ小鼠的外周血采集方式。

图6-B为PBS组、DT组、3×STZ组、3×STZ+DT组小鼠的外周血糖基化血红蛋白变化。

图6-C为NOD/ShiLtJ小鼠的外周血糖基化血红蛋白的变化。

结果分析：检测结果显示相比对照组小鼠，3×STZ+DT小鼠血液中糖基化血红蛋白水平显著升高。同样的检测NOD/ShiLtJ小鼠外周血液糖基化血红蛋白，与健康NOD/ShiLtJ小鼠对比，结果显示NOD/ShiLtJ小鼠发病1-8周后糖基化血红蛋白均显著高于对照组。且第4周达到高峰，第8周略微下降。以上的结果预示着3×STZ+DT小鼠和NOD/ShiLtJ小鼠发病后都失去了对血糖的控制。

实验例7 1型糖尿病新动物模型和NOD/ShiLtJ小鼠血清β-羟丁酸含量的比较

患者长期葡萄糖代谢受阻促使肝脏开始代谢脂肪，形成酮体进入循环导致酮症酸(DKA)中毒。酮体中约80％是β-羟丁酸(β-HB)，所以在高血糖稳定后即第5周检测小鼠血清中β-羟丁酸的含量以判断1型糖尿病小鼠模型是否伴随酮症酸并发症。

针对实施例1中各组小鼠进行相关指标检测。

注射方式示意图以及各指标检测结果如图7所示：

图7-A示意3×STZ+DT组小鼠的注射方式以及外周血采集方式，以及NOD/ShiLtJ小鼠的外周血采集方式。

图7-B为PBS组、DT组、3×STZ组、3×STZ+DT组小鼠的外周血β-羟丁酸变化。

图7-C为NOD/ShiLtJ小鼠的外周血β-羟丁酸的变化。

结果分析：以分别注射3×STZ、DT、PBS和健康的NOD/ShiLtJ小鼠为对照，3×STZ+DT组β-羟丁酸水平显著高于对照组，说明3×STZ+DT小鼠出现了酮症酸中毒。相比较之下，NOD/ShiLtJ小鼠在发展高血糖后任何时间，血清β-羟丁酸的含量与健康NOD/ShiLtJ小鼠没有显著性差异，表明NOD/ShiLtJ小鼠发病不产生酮症酸并发症。表明3×STZ+DT小鼠模型在酮症酸并发症方面更加接近人类1型糖尿病发病症状。

实验例8 1型糖尿病新动物模型和NOD/ShiLtJ小鼠生存曲线的比较

1型糖尿病患者一旦被诊断患病，立即需要外源胰岛素维持血糖的平衡，但是没有任何治疗的情况下，患者出现高血糖，消瘦，酮症酸脱水最终死亡。合适的1型糖尿病动物模型也应当符合该特征。

针对实施例1中的各组小鼠，小鼠模型制备成功后，正常饮食并测量小鼠体重，当小鼠体重为初始体重20％时人道牺牲小鼠并计算该小鼠为死亡状态，从小鼠发病起第0天，记录PBS，DT，3×STZ和3×STZ+DT和NOD/ShiLtJ小鼠存活情况并绘制各组死亡曲线。

图8表明，在没有任何药物治疗的情况下，3×STZ+DT组小鼠和NOD/ShiLtJ小鼠随着疾病发展死亡。

实验例9 1型糖尿病新动物模型和NOD/ShiLtJ小鼠胰腺T细胞的浸润

1型糖尿病作为自主免疫性疾病，在表现出临床高血糖症状前，T细胞为首的适应性免疫细胞进入胰腺中攻击胰岛细胞。检测T细胞是否也参与到3×STZ+DT模型小鼠的发病过程，是衡量小鼠模型是否和人类1型糖尿病发病特征一致的一项标准。

针对实施例1中PBS，DT，3×STZ和3×STZ+DT组小鼠，第9天取出胰岛进行HE染色，分离胰岛细胞进行流式染色。同时取出2周，10周和17周龄NOD/ShiLtJ小鼠的胰腺进行HE染色，12周龄的NOD/ShiLtJ小鼠分离胰岛细胞进行流式染色。

结果如图9所示：

图9-A为PBS组、DT组、3×STZ组、3×STZ+DT组小鼠第9天胰岛HE染色结果。

图9-B为2周，10周和17周龄NOD/ShiLtJ小鼠胰岛HE染色结果。

图9-C为PBS组、DT组、3×STZ组、3×STZ+DT组小鼠第9天胰腺细胞流式染色结果。

图9-D为12周龄的NOD/ShiLtJ小鼠胰腺细胞流式染色结果。

结果分析：HE病理切片结果显示对照组胰岛形态完整，而3×STZ+DT组胰岛萎缩且周围存在炎症细胞的浸润。NOD/ShiLtJ小鼠的HE染色结果显示2周NOD/ShiLtJ小鼠胰岛形态完整，10周后胰岛中有明显的炎症细胞浸润，17周后胰岛萎缩。流式细胞术结果进一步证明3×STZ+DT组小鼠胰腺中浸润的CD8

实验例10 1型糖尿病新动物模型和NOD/ShiLtJ小鼠抗原特异性的T细胞免疫反应

1型糖尿病是由于T细胞攻击自身胰岛引起的自身免疫性疾病，多种胰岛抗原参与到该病的起始。在1型糖尿病患者的外周血单个核细胞(PBMC)中可以检测到针对不同胰岛抗原的T细胞，包括GAD65，Insulin，Proinsulin，ZnT8，IAPP等。

对于实施例1中的各组小鼠，取出第6天的3×STZ+DT小鼠胰腺以及第12周NOD小鼠胰腺研磨后用Ficoll分离淋巴细胞，加上抗原肽(表1)10μg/mL刺激6小时，对照组加无关抗原OVA多肽10μg/mL，阳性对照加入PMA(0.1μg/mL)和IONO(1μg/mL)，体系中加入anti-CD28(0.1μg/mL)和BFA刺激。6小时后流式检测3×STZ+DT小鼠和NOD小鼠CD4

表1 1型糖尿病胰岛抗原多肽

野生型小鼠的脾脏细胞分别孵育GAD65

结果如图10所示：

(1)在3×STZ+DT模型中，InsC17-A1抗原的刺激下相比于OVA

(2)3×STZ+DT的CD8