一种用于白术药材中白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种用于白术药材中白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定方法。

背景技术

白术是菊科多年生的草本植物白术的根茎，是中医临床极常用的补益中药，有“南术北参”之美称，最早记载在《山海经》、《尔雅》这些古籍里。白术性温，味甘、微辛带苦，入脾经和胃经，临床上主要用于补脾气，功能是健脾益气、燥湿利水、止汗安胎，用于脾虚食少、腹胀泄泻、痰饮、眩悸、自汗、胎动不安等症。近十几年来研究表明白术在利尿、抗肿瘤、抗菌、抗炎、治疗糖尿病、抗衰老等方面都有一些作用，对神经系统、消化道、子宫平滑肌也有一定的作用，还能够调节免疫功能。白术在健脾益气、调节盲肠运动的功能方面，可以促进空肠的平滑肌的收缩运动，同时对盲肠的自律性收缩活动有显著的抑制作用。白术对免疫系统的作用主要是抗炎、抗肿瘤、抗氧化。白术能有效的抑制肿瘤细胞的生长，其中白术内酯和挥发油是有效的抗肿瘤的活性成分。白术的抗氧化作用，能有效抑制脂质的过氧化作用，降低组织脂质过氧化物的含量，避免有害物质对组织细胞结构和功能的进一步的破坏。临床上常用的炮制品主要是生白术和炒白术，用于健脾是以炒白术为主，根据症状不同，还可以选用麸炒白术和土炒白术。

白术具有较强的临床应用价值，市场需求广阔，但《中国药典》2015年版白术药材没有收载含量测定项，并不能全面地评价白术质量。目前文献研究报道的关于白术中白术内酯含量多采用HPLC法，采用梯度洗脱程序进行分离，梯度洗脱就是将两种或两种以上不同极性但可以互溶的溶剂，随着时间改变使按一定比例混合，以连续改变冲洗液的极性，使复杂组分得到良好的分离，但该梯度洗脱程序结果存在的以下技术问题：出峰时间长、分离度差、峰形不好，重现性差，稳定性差、溶剂消耗较大、精确度低等。

申请号CN201910299616.6，发明名称为白术药材UPLC特征图谱的构建方法和检测方法，公开了以绿原酸为对照品制备对照品参照物溶液；以白术对照药材制备对照药材参照物溶液；分别取白术药材、白术饮片、麸炒白术饮片、白术标准汤剂和麸炒白术标准汤剂，加入提取溶剂提取，滤过，取续滤液分别作为供试品溶液；以流动相A为乙腈，流动相B为0.05-0.15％磷酸溶液，进行梯度洗脱：0-4min，流动相A的体积分数由1％上升到6％，流动相B的体积分数由99％降低至94％；4-10min，流动相A的体积分数由6％上升到9％，流动相B的体积分数由94％降低至91％；10-16min，流动相A的体积分数由9％上升到18％，流动相B的体积分数由91％降低至82％；16-22min，流动相A的体积分数由18％上升到20％，流动相B的体积分数由82％降低至80％；22-23min，流动相A的体积分数由20％上升到90％，流动相B的体积分数由80％降低至10％。以柱温为(25±3)℃；流速为(0.25±0.1)ml/min；检测波长为(325±40)nm，进行测定。

申请号CN201910299616.6存在的技术问题：是针对白术饮片、麸炒白术饮片、白术标准汤剂和麸炒白术标准汤剂的特征图谱进行研究，未针对白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ含量测定作分析，且该方法出峰时间长，峰形不好，分离度差、稳定性差。

申请号CN201910725324.4，发明名称为一种检测白术药材中白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ的UPLC方法，公开了将白术粉碎后置于三角瓶中，加入甲醇后放置于超声波仪中进行超声、离心，最后过滤；将标准白术样品溶液注入超高效液相色谱仪中，以色谱柱：BEH C18柱(2.1μm×100mm，1.7mm)；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：5μL；紫外检测波长：221nm；流动相：乙腈和水，其中乙腈和水的体积比为54:46进行测定，通过得到的标准白术样品的UPLC特征图谱和待测白术样品的UPLC特征图谱对制备得到的待测白术样品进行定量。

申请号CN201910725324.4存在的技术问题：本申请针对白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ的检测，未对白术内酯Ⅱ进行分析，且该方法目标峰分离度不好，重现性差、精确度低。

申请号CN202010678723.2，发明名称为白术中有效成分白术内酯Ⅲ、Ⅰ含量测定方法，公开了取白术粉末加乙酸乙酯浸泡；抽滤后蒸干，加甲醇溶解；用滤膜滤过，取续滤液即得；精密称取白术内酯Ⅲ、Ⅰ对照品；加甲醇制成每1ml中含0.1mg的溶液，即得；精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪测定；以色谱柱：C18柱(150mm×4.6)；柱温：35℃；流动相：甲醇和水，甲醇和水的比例为72：28；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；进样量：10μL记录色谱图，以外标法计算白术内酯Ⅲ、Ⅰ的含量。

申请号CN202010678723.2存在的技术问题：本申请针对白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ的检测，未对白术内酯Ⅱ进行分析，且该方法操作复杂，色谱峰分离不好，出峰时间慢，稳定性差、溶剂消耗较大、精确度低。

针对以上问题，发明人参照本公司产品泽泻汤中白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ含量的检测方法，通过优化流动相梯度、检测波长、提取溶剂、提取方式、提取时间以及色谱柱的系列的研究，得到了一种检测白术药材白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ含量的检测方法，该方法峰形好，分离度和峰纯度均合格，且精确性高，出峰时间短，操作简单，完善了白术药材的质量检测方法，使质量得到更好的控制。

发明内容

本发明提供一种用于白术药材中白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定方法，所述含量测定方法为：

(1)供试品溶液的制备：取本品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30-70％甲醇50ml，称定重量，超声或回流处理，放冷，再称定重量，用30-70％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心2-8min，滤过，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

(3)色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温为39-41℃；以乙腈为流动相A,以0.09-0.11％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为210-230nm；流速为0.34-0.36ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

优选的，所述含量测定方法为：

(1)供试品溶液的制备：取本品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声或回流处理，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心5min，滤过，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

(3)色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温为40℃；以乙腈为流动相A,以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为220nm；流速为0.35ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

所述步骤(1)所述的甲醇，还可以为乙腈或乙醇的任一种。

所述乙腈和乙醇浓度分别为50％。

所述离心频率为8000-12000r/min。

优选的，所述离心频率为10000r/min。

所述超声或回流处理时间为10-30min。

所述超声或回流处理时间为10min。

所述含量测定方法为：

(1)供试品溶液的制备：取本品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理10min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，以频率为10000r/min离心5min，滤过，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

(3)色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：40℃；以乙腈为流动相A,以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为220nm；流速为0.35ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

所述含量测定方法在白术药材、白术炮制品以及含白术药材的制剂中检测的应用。

本发明具有以下优点：

1、本发明含量测定方法，峰形好，分离度和峰纯度均合格，且精确性高，出峰时间短，重现性好、操作简单。

2、本发明在泽泻汤检测方法的基础上，通过优化流动相比例梯度、检测波长、提取溶剂、提取方式、提取时间以及色谱柱的系列的研究，进上步说明了该方法的可靠性、合理性，保证了所述药材的质量检测方法更科学完善，药材质量得到更好的控制。

3、本发明含量测定方法通过优选前及优选方法一、优选方法二、优选方法三、优选方法四进行了色谱条件及梯度洗脱的筛选，得到了白术药材中白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定方法了色谱条件与系统适用性试验的优选方案为：以色谱柱为CORTECS UPLC T31.6um；柱温：40℃；以乙腈为流动相A,以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为220nm；流速为0.35ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；进一步证明该方法的合理性、可靠性。

4、方法学验证试验中，系统适用性试验结果表明本方法主峰(白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ)面积的相对标准偏差(RSD)小于2.0％；保留时间的相对标准偏差(RSD)小于1.0％；理论塔板数均大于4500；分离度均大于1.5；故白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ含量测定方法符合系统适用性要求。

5、方法学验证试验中，专属性考察结果表明空白溶剂对各峰出峰位置处无干扰，本方法测定白术药材中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ的含量具有专属性；按照规定色谱条件以PDA检测器进行210nm～400nm扫描检测，计算峰纯度，结果显示各待测峰的纯度角均小于纯度阈值，纯度符合要求。

6、方法学验证试验中，精密度考察结果表明白术内酯Ⅲ对照品平均回收率为105％，九份样品测定结果的RSD为1.0％；白术内酯Ⅱ对照品平均回收率为102％，九份样品测定结果的RSD为0.69％，均符合要求。

7、方法学验证试验中，线性关系关系考察结果表明白术内酯Ⅱ浓度范围0.4212ug/ml-52.65ug/ml和白术内酯Ⅲ浓度范围0.4164ug/ml-52.05ug/ml即可涵盖最高和最低批次含量测定响应值范围，表明白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ高低限浓度范围在上述范围是时可达到精密度、准确度和线性要求。

8、方法学验证试验中，通过了流动相组成变化、柱温变化、流速变化、不同色谱柱、被测溶液的稳定性的耐用性进行了考察，结果显示经试验ACQUITY UPLC HSS T3 1.8um(100×2.1mm)色谱柱不适用该方法，CORTECS UPLC T3 1.6um(100×2.1mm)与ACQUITYUPLC BEH C18 1.7um(100×2.1mm)色谱柱适用于该方法；其余测定条件小的变动能满足系统适用性试验要求；被测溶液白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ峰面积24h内RSD均小于2％，故被测溶液在24h内均稳定。

9、本发明白术药材中白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ含量检测方法通过了优化前和优化后的对比试验，结果显示优化方案中白术内酯Ⅱ、Ⅲ峰与相邻峰的分离度均大于2.0，达到基线分离，且对称因子明显降低，峰形较好，白术内酯Ⅱ、Ⅲ峰的纯度角度均小于纯度阈值，故更适用于不同产地白术药材白术内酯Ⅱ、Ⅲ的含量检测，提高产品质量。

说明书附图

图1优化前白术药材含量方法UPLC图谱；

图2白术药材含量方法UPLC图谱(优化方法一)；

图3白术药材含量方法UPLC图谱(优化方法二)；

图4白术药材含量方法UPLC图谱(优化方法三)；

图5白术药材含量方法UPLC图谱(优化方法四)；

图6白术药材白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ最大吸收图；

图7白术药材白术内酯II和白术内酯III含量UPLC图谱；

图8白术药材白术内酯II和白术内酯III含量UPLC图谱(溶剂为70％甲醇)；

图9白术药材白术内酯II和白术内酯III含量UPLC图谱(溶剂为50％甲醇)；

图10白术药材白术内酯II和白术内酯III含量UPLC图谱(溶剂为30％甲醇)；

图11白术药材白术内酯II和白术内酯III含量UPLC图谱(溶剂为50％乙腈)；

图12白术药材白术内酯II和白术内酯III含量UPLC图谱(溶剂为50％乙醇)；

图13白术药材白术内酯II和白术内酯III的HPLC图谱(超声提取10min)；

图14白术药材白术内酯II和白术内酯III的HPLC图谱(超声提取20min)；

图15白术药材白术内酯II和白术内酯III的HPLC图谱(超声提取30min)；

图16白术药材白术内酯II和白术内酯III的HPLC图谱(回流提取10min)；

图17白术药材白术内酯II和白术内酯III的HPLC图谱(回流提取20min)；

图18白术药材白术内酯II和白术内酯III的HPLC图谱(回流提取30min)；

图19白术药材白术内酯II和白术内酯III含量HPLC图谱【色谱柱为ACQUITY UPLCHSS T3(100mm×2.1mm,1.8μm)MVK】；

图20白术药材白术内酯II和白术内酯III含量HPLC图谱【ACQUITY UPLC BEH(100mm×2.1mm,1.7μm)】；

图21白术药材白术内酯II和白术内酯III含量HPLC图谱【CORTECS UPLC T3(100mm×2.1mm,1.6μm)】；

图22不同产地白术药材含量方法色谱图(优化前)；

图23不同产地白术药材含量方法色谱图(优化后)；

图24含量测定专属性考察图；

图25对照溶液中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ的光谱图；

图26供试品溶液中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ的光谱图

图27白术内酯Ⅱ含量测定方法的线性关系；

图28白术内酯Ⅲ含量测定方法的线性关系；

图29不同流动相考察色谱图；

图30不同柱温考察色谱图；

图31不同流速变化考察色谱图；

图32不同色谱柱考察色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理10min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，以频率为10000r/min离心5min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：40℃；以乙腈为流动相A,以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为220nm；流速为0.35ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例2

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇50ml，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，以频率为8000r/min离心2min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：39℃；以乙腈为流动相A,以0.09％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为210nm；流速为0.34ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例3

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，以频率为12000r/min离心8min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：41℃；以乙腈为流动相A,以0.11％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为230nm；流速为0.36ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例4

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，回流提取10min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，以频率为10000r/min离心5min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：40℃；以乙腈为流动相A,以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为220nm；流速为0.35ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例5

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇50ml，称定重量，回流提取20min，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，以频率为8000r/min离心2min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：39℃；以乙腈为流动相A,以0.09％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为210nm；流速为0.34ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例6

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，回流提取30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，以频率为12000r/min离心8min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：41℃；以乙腈为流动相A,以0.11％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为230nm；流速为0.36ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例7

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙腈50ml，称定重量，超声处理10min，放冷，再称定重量，用50％乙腈补足减失的重量，摇匀，以频率为10000r/min离心5min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：40℃；以乙腈为流动相A,以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为220nm；流速为0.35ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例8

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙腈50ml，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，用50％乙腈补足减失的重量，摇匀，以频率为8000r/min离心2min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：39℃；以乙腈为流动相A,以0.09％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为210nm；流速为0.34ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例9

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙腈50ml，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用50％乙腈补足减失的重量，摇匀，以频率为12000r/min离心8min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：41℃；以乙腈为流动相A,以0.11％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为230nm；流速为0.36ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例10

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，超声处理10min，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，以频率为10000r/min离心5min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：40℃；以乙腈为流动相A,以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为220nm；流速为0.35ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例11

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，以频率为8000r/min离心2min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：39℃；以乙腈为流动相A,以0.09％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为210nm；流速为0.34ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例12

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，以频率为12000r/min离心8min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：41℃；以乙腈为流动相A,以0.11％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为230nm；流速为0.36ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例13

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙腈50ml，称定重量，超声处理10min，放冷，再称定重量，用50％乙腈补足减失的重量，摇匀，以频率为10000r/min离心5min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：40℃；以乙腈为流动相A,以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为220nm；流速为0.35ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例14

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙腈50ml，称定重量，回流提取20min，放冷，再称定重量，用50％乙腈补足减失的重量，摇匀，以频率为8000r/min离心2min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：39℃；以乙腈为流动相A,以0.09％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为210nm；流速为0.34ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例15

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙腈50ml，称定重量，回流提取30min，放冷，再称定重量，用50％乙腈补足减失的重量，摇匀，以频率为12000r/min离心8min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：41℃；以乙腈为流动相A,以0.11％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为230nm；流速为0.36ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例16

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，回流提取10min，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，以频率为10000r/min离心5min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：40℃；以乙腈为流动相A,以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为220nm；流速为0.35ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例17

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，回流提取20min，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，以频率为8000r/min离心2min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：39℃；以乙腈为流动相A,以0.09％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为210nm；流速为0.34ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例18

【白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定

供试品溶液的制备：取白术粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，回流提取30min，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，以频率为12000r/min离心8min，滤过，取续滤液，即得；

对照品溶液的制备：取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：41℃；以乙腈为流动相A,以0.11％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为230nm；流速为0.36ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实验例：为证明本发明的科学性与合理性，进行了以下方法学实验研究：

1材料、设备、试剂及对照品

1.1材料

1.2设备

1.3试剂

1.4对照品

2白术药材含量检测方法的筛选

2.1白术药材含量方法流动相及梯度的选择

2.1.1优化前参考我公司泽泻汤白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ含量色谱条件，色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 1.8um(100×2.1mm)，采用乙腈-0.1％磷酸水系统洗脱，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，柱温：30℃；进样体积：5μl；流速：0.30ml/min；按表1的规定进行梯度洗脱，结果见图1。

表1梯度洗脱表

结果：根据图1可知，用泽泻汤的梯度洗脱程序检测白术药材中的白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ含量时，发现峰分离度差，峰形不好、精确度差、稳定性差等问题。

2.1.2针对“2.1.1”的问题，对白术药材白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ含量方法中流速、柱温、流动相梯度比例及色谱柱等进行考察，具体如下：

优化方法一：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 1.8um(100×2.1mm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B；柱温：30℃；进样体积：5μl；流速：0.30ml/min；按表2的规定进行梯度洗脱，结果见图2。

表2梯度洗脱表(优化方法一)

结果：根据图2可知，该方法峰形，峰纯度均良好，但考察不同产地白术药材白术内酯Ⅱ、Ⅲ含量时，该方法稳定性差，个别出现相邻峰分离度不好的情况。

优化方法二：色谱柱：CORTECS UPLC T3 1.6um(100×2.1mm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，柱温：40℃；进样体积：5μl；流速：0.35ml/min；按表3的规定进行梯度洗脱，结果见图3。

表3梯度洗脱表(优化方法二)

结果：改变柱温、流速及流动相梯度，白术内酯Ⅱ与相邻峰成M峰，分离度差。

优化方法三：色谱柱：CORTECS UPLC T3 1.6um(100×2.1mm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，柱温：30℃；进样体积：5μl；流速：0.35ml/min；按表4的规定进行梯度洗脱，结果见图4。

表4梯度洗脱表(优化方法三)

结果：改变流动相比例，发现白术内酯Ⅱ、Ⅲ均未能与相邻峰达到基线分离。

优化方法四：色谱柱：CORTECS UPLC T3 1.6um(100×2.1mm)；乙腈流动相A，0.1％磷酸水为流动相B；柱温：40℃；流速：0.35mL/min；进样体积：5μL；优化后梯度见表5，检测结果见图5。

表5梯度洗脱表(优化方法四)

结果：“优化方法四”检测白术药材白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ含量，分离度、峰形，峰纯度均良好，且适用于不同产地白术药材的检验，故“优化方法四”作为白术药材白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ含量检测色谱条件的最佳方案。

2.2白术药材含量方法检测波长的确定

根据2.1.2“优化方法四”选择检测波长

精密称取白术药材(批号：BZY02)粉末0.4056g置锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，超声处理10min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，以频率为10000r/min离心5min，滤过，取续滤液，即得，记录190～400nm范围内的吸收光谱，见图6、图7。

结果:在220nm左右，泽泻汤白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ有最大吸收，峰响应高，基线平稳，因此选择220nm为泽泻汤白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ含量检测波长。

2.3白术药材含量方法提取溶剂考察

根据2.1.2“优化方法一”选择提取溶剂

精密称定白术药材(批号：BZY02)粉末0.4056g，0.4014g，0.4040g，0.4045g，0.4001g，0.4042g，0.4000g，0.4006g，0.4000g，0.3944g分别置50ml锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇，50％甲醇，30％甲醇，50％乙腈，50％乙醇各50ml，超声处理20min，放冷，再称定重量，用相同的溶剂补足减失的重量，摇匀，以频率为10000r/min离心5min，滤过，取续滤液，即得，按上述色谱条件进行测定，见图8、图9、图10、图11、图12、表6。

表6白术药材含量方法溶剂考察表

结果：用70％甲醇，50％乙腈和50％乙醇处理样品，峰面积相差不大，采用70％甲醇与泽泻汤白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ含量方法保持一致，因此选择70％甲醇作为白术药材含量方法的供试品处理溶剂。

2.4白术药材含量方法溶剂提取方式及提取时间的考察

根据2.1.2“优化方法一”选择溶剂提取方式及提取时间

精密称定白术药材(批号：BZY02)粉末0.4003g，0.4062g，0.4073g，0.4099g，0.4032g，0.4023g，0.4005g，0.4054g，0.4031g，0.4014g，0.4003g，0.4010g分别置锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，分别超声处理10min，20min，30min，回流提取10min，20min，30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，以频率为10000r/min离心5min，滤过，取续滤液，即得，按上述色谱条件进行测定，见图13、图14、图15、

图16、图17、图18：表7。

表7白术药材含量方法溶剂考察表

结果：采用超声处理10min，20min，30min，回流提取10min，20min，30min中，回流提取30min所得的白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的结果无明显差异，所以选择超声10min处理白术药材含量供试品处理。

2.5白术药材含量方法色谱柱的考察

根据2.1.2“优化方法一”选择色谱柱

密称定白术药材(批号：BZY02)粉末0.4012g置锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，超声提取10min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，以频率为10000r/min离心5min，滤过，取续滤液，即得，分别用：

CORTECS UPLC T3(100mm×2.1mm,1.6μm)；

ACQUITY UPLC BEH(100mm×2.1mm,1.7μm)；

ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm,1.8μm)MVK，按上述色谱条件进行测定：结果见图19、图20、图21；表8、表9、表10。

表8白术药材含量色谱柱考察

表9白术药材含量色谱柱考察

表10白术药材含量色谱柱考察

结果：用不同规格的色谱柱考察优化中的白术药材含量色谱条件，色谱柱CORTECSUPLC T3(2.1*100mm，1.6um)，峰形较好，分离度和峰纯度均合格，所以白术药材含量检测方法用CORTECS UPLC T3(2.1*100mm，1.6um)色谱柱。

结论：经过以上筛选实验，得出白术药材中白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定的优选方法如下：

色谱条件与系统适用性试验验优选方法为：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温为40℃；以乙腈为流动相A,以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为220nm；流速为0.35ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％。

供试品溶液的制备优选方法为：取本品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理10min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，以频率为10000r/min离心5min，滤过，取续滤液，即得。

2.6白术药材白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ含量检测方法优化前和优化后的对比试验

取不同产地的白术药材12批次，分别按“2.1.1”优化前和“2.2.2优化方法四”优化后的方法进行含量检测，结果如图22、图23；表11、表12。

表11白术药材含量方法优化前后结果对比考察表一

表12白术药材含量方法优化前后结果对比考察表二

结论：“2.1.1”优化前方法中白术内酯Ⅱ、Ⅲ峰与相邻峰的分离度均大于1.5，但白术内酯Ⅱ未能与相邻峰达到基线分离，且不同产地白术药材的白术内酯Ⅱ、Ⅲ峰的纯度角度未均小于纯度阈值；“2.2.2优化方法四”中白术内酯Ⅱ、Ⅲ峰与相邻峰的分离度均大于2.0，达到基线分离，且对称因子明显降低，峰形较好，白术内酯Ⅱ、Ⅲ峰的纯度角度均小于纯度阈值，所以，“优化方法四”更适用于不同产地白术药材白术内酯Ⅱ、Ⅲ的含量检测。

3白术药材含量检测方法学验证考察

3.1白术药材白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ含量测定样品制备与方法

色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：40℃；以乙腈为流动相A,以0.1％磷酸溶液为流动相B,按表13中规定进行梯度洗脱；检测波长为220nm；流速为0.35ml/min。理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500。

表13梯度洗脱表

Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品粉末(过三号筛)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理10min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心(10000r/min，5min)滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl、供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

3.2高效液相色谱系统适用性确认

3.2.1白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ含量测定方法的系统适用性确认方法：

分别精密吸取3.1项下对照品溶液5μl连续6次进样；供试品溶液5μl 1次进样测定，记录色谱图。

3.2.2白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ含量测定方法系统适用性确认接受标准：

3.2.2.1主峰(白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ)面积的相对标准偏差(RSD)不得过2.0％；

3.2.2.2主峰(白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ)保留时间的相对标准偏差(RSD)不得过1.0％；

3.2.2.3主峰(白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ)的理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应大于4500；

3.2.2.4主峰(白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ)的分离度应大于1.5；

3.2.3系统适用性确认结果，见表14、表15。

表14系统适用性确认结果信息表

表15系统适用性确认结果信息表

结果：主峰(白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ)面积的相对标准偏差(RSD)小于2.0％；保留时间的相对标准偏差(RSD)小于1.0％；理论塔板数均大于4500；分离度均大于1.5；故白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ含量测定方法符合系统适用性要求。

3.3专属性考察

3.3.1白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ含量测定方法的专属性确认方法：

精密吸取3.1项下白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ对照品溶液5ul，供试品溶液及样品提取溶剂各5ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另采用PDA检测器对对照品溶液、供试品溶液中的白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ色谱峰进行峰光谱扫描和纯度检测。

3.3.2方法确认接受标准：

3.3.2.1供试品溶液主峰保留时间与白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ对照品溶液主峰保留时间一致；

3.3.2.2样品提取溶剂在白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ峰保留时间处均应为平直基线，无吸收峰；

3.3.2.3白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ对照品溶液峰、供试品溶液待测峰纯度角度应小于纯度阈值。

3.3.3专属性考察结果，见表16、图24。

表16专属性实验结果

3.3.4色谱峰纯度考察结果，见表17、图25、图26。

表17色谱峰纯度角度和纯度阈值列表

结果：结果表明空白溶剂对各峰出峰位置处无干扰，本方法测定白术药材中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ的含量具有专属性；按照规定色谱条件以PDA检测器进行210nm～400nm扫描检测，计算峰纯度，结果显示各待测峰的纯度角均小于纯度阈值，纯

度符合要求。

3.4精密度

3.4.1重复性考察

由同一人分别称取6份样品，按3.1项下供试品溶液制备方法制成样品供试液，以既定色谱条件测定含量，并计算RSD，RSD应不大于3％。结果见表18：

表18重复性实验结果

3.4.2中间精密度考察

由两个实验员分别称取6份样品，按3.1项下供试品溶液制备方法制成样品供试液，在不同天同一实验室同仪器上分别进样5μl，测定其峰面积值，计算含量及RSD，RSD应不大于6％。结果见表19。

表19中间精密度实验结果

结果：结果表明重复性考察、中间精密度均符合要求。

3.5.准确度(加样回收率试验)

3.5.1白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ含量测定方法的准确度确认方法：

精密称取本品粉末0.25g，置50ml容量瓶中，精密加入白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ对照品溶液适量(对照品溶液加入量与所取供试品中待测定成分量之比为1.5:1,1:1，0.5:1；每种浓度分别制备3份供试品溶液)，加70％甲醇适量，超声处理10min，放冷定容并摇匀，离心(10000r/min，5min)滤过，取续滤液，精密吸取5μl注入液相色谱仪，按既定方法进行测定，用9份样品的测定结果计算RSD进行评价，RSD应小于2.0％。

计算公式：

式中：A

C为对照品溶液的浓度(ug/ml)；

A

V

V

3.5.2准确度(加样回收率试验)测定结果见表20、表21。

表20白术内酯Ⅲ准确度(加样回收)测定结果

表21白术内酯Ⅱ准确度(加样回收)测定结果

结果：白术内酯Ⅲ对照品平均回收率为105％，九份样品测定结果的RSD为1.0％；白术内酯Ⅱ对照品平均回收率为102％，九份样品测定结果的RSD为0.69％，均符合要求。

3.6.线性关系的考察

3.6.1白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ含量测定方法的线性关系与线性范围确认方法：

3.6.1.1线性关系测试溶液制备：

白术内酯Ⅲ对照品线性溶液：精密称定白术内酯Ⅲ对照品0.01042g，加70％甲醇制成104.1ug/ml的白术内酯Ⅲ对照品溶液(贮)，精密移取白术内酯Ⅲ对照品溶液(贮)10ml置100ml容量瓶中，加70％甲醇定容至刻度，制成溶液①；分别精密移取白术内酯Ⅲ对照品溶液(贮)3ml、5ml置10ml容量瓶中，加70％甲醇定容至刻度，制成溶液②③；分别精密移取溶液①1ml、5ml置25ml容量瓶中，加70％甲醇定容至刻度，制成溶液④⑤。取上述①②③④⑤溶液连续进样2针，测定白术内酯Ⅲ峰面积平均值。

白术内酯Ⅱ对照品线性溶液：精密称定白术内酯Ⅱ对照品0.01054g，加70％甲醇制成105.3ug/ml的白术内酯Ⅱ对照品溶液(贮)，精密移取白术内酯Ⅱ对照品溶液(贮)10ml置100ml容量瓶中，加70％甲醇定容至刻度，制成溶液①；分别精密移取白术内酯Ⅱ对照品溶液(贮)3ml、5ml置10ml容量瓶中，加70％甲醇定容至刻度，制成溶液②③；分别精密移取溶液①1ml、5ml置25ml容量瓶中，加70％甲醇定容至刻度，制成溶液④⑤。取上述①②③④⑤溶液连续进样2针，测定白术内酯Ⅱ峰面积平均值。

3.6.1.2计算出各个测试溶液的白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ浓度，以浓度为横坐标，白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ峰面积平均值为纵坐标，计算线性回归方程、回归系数R

3.6.2方法确认接受标准：

3.6.2.1测试溶液的白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ浓度与峰面积之间呈良好线性关系，回归系数R

3.6.2.2白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ浓度范围：范围应达到精密度、准确度和线性要求。

3.6.3线性关系试验结果，见图27、图28；表22、表23。

表22白术内酯Ⅱ含量测定方法--线性关系与线性范围确认结果

表23白术内酯Ⅲ含量测定方法--线性关系与线性范围确认结果

结果：线性关系白术内酯Ⅱ浓度范围0.4212ug/ml-52.65ug/ml和白术内酯Ⅲ浓度范围0.4164ug/ml-52.05ug/ml即可涵盖最高和最低批次含量测定响应值范围，表明白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ高低限浓度范围在上述范围是时可达到精密度、准确度和线性要求。

3.7白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ含量测定方法耐用性考察

3.7.1流动相组成变化试验：按3.1项下含量测定方法制备样品，配制不同浓度流动相进行检测，证明流动相组成小变动能满足系统适用性试验要求，结果见表24；图29。

表24流动相组成变化试验结果

3.7.2柱温变化试验：按3.1项下含量测定方法制备样品，改变柱温进行检测，证明柱温的小变动能满足系统适用性试验要求。结果见表25，图30。

表25柱温变化试验结果

3.7.3流速变化试验：按3.1项下含量测定方法制备样品，改变流速进行检测，证明流速的小变动，能满足系统适用性试验要求。结果见表26，图31。

表26流速变化试验结果

3.7.4不同色谱柱试验：按3.1项下含量测定方法制备样品，用不同型号及不同批次的色谱柱进行检测，证明不同批次色谱柱能满足系统适用性试要求。结果见表27，图32。

表27不同色谱柱类型变化

3.7.5被测溶液的稳定性试验：按3.1项下含量测定方法制备样品，测试不同时间点被测溶液的峰面积，计算RSD考察被测溶液的稳定性。结果见表28。

表28溶液稳定性考察

结果：经试验ACQUITY UPLC HSS T3 1.8um(100×2.1mm)色谱柱不适用该方法，CORTECS UPLC T3 1.6um(100×2.1mm)与ACQUITY UPLC BEH C18 1.7um(100×2.1mm)色谱柱适用于该方法；其余测定条件小的变动能满足系统适用性试验要求；被测溶液白术内酯Ⅱ白术内酯Ⅲ峰面积24h内RSD均小于2％，故被测溶液在24h内均稳定。

结论：经过上述方法学实验研究，白术药材中白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量测定优选方法为：取本品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理10min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，以频率为10000r/min离心5min，滤过，取续滤液，即得。取白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1ml含白术内酯Ⅱ10ug、白术内酯Ⅲ10ug的溶液，即得。以色谱柱为CORTECS UPLC T3 1.6um；柱温：40℃；以乙腈为流动相A,以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为220nm；流速为0.35ml/min，理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500；所述梯度洗脱具体为：0-1min，流动相A为44％，流动相B为56％；1-2min，流动相A为44→36％，流动相B为56→64％；2-3.5min，流动相A为36％，流动相B为64％；3.5-4.0min，流动相A为36→43％，流动相B为64→57％；4-8min，流动相A为43％，流动相B为57％；8-9min，流动相A为43→90％，流动相B为57→10％；9-12min，流动相A为90％，流动相B为10％；12-13min，流动相A为90→44％，流动相B为10→56％；13-16min，流动相A为44％，流动相B为56％。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。该方法出峰时间快、峰形好，分离度、峰纯度均合格，且准确度高，稳定性好，操作简便快捷。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。