一种永生化麝鼠香腺成纤维细胞的构建方法

技术领域

本发明涉及一种永生化麝鼠香腺成纤维细胞的构建方法。

背景技术

麝香是传统中药的重要成分。《中国药典》2020年版记载，麝香具有开窍醒神，活血通经，消肿止痛的功效。现代药学著作均视麝香为药材之珍品。在中成药及成药的实际应用中，麝香常居牛黄、犀角、熊胆等名贵动物药材之首。《全国中成药处方集》收载的2621个处方中，含麝香的处方就有295个。但是天然麝香的产量极低，每头雄性林麝每年只能产15克左右，因此麝香就显得极其珍贵，市场价格在黄金的3倍以上。

近年来，由于天然麝香等动物药资源不足，国内外都在寻找新的资源。麝鼠香是麝香鼠分泌的麝香，可入药使用。主要是由麝鼠香中含有与天然麝香相同的麝香酮、降麝香酮、烷酮等主要成分，其减慢心率的作用更明显，具有抗炎耐缺氧、降血压、消炎、抗应敏、雄性激素等作用。麝鼠香资源分布广，数量较大，易饲养，好管理，并含有类似麝香的特性和成分，已引起学术界的广泛关注。

本申请人发现现有技术至少存在以下技术问题：

1、现有技术中麝鼠香腺成纤维细胞体外培养最多到第6代的时候就凋亡，远低于动物细胞体外培养平均传代数。

发明内容

本发明的目的在于提供一种永生化麝鼠香腺成纤维细胞的构建方法，以解决现有技术中香腺成纤维细胞易凋亡的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供的一种永生化麝鼠香腺成纤维细胞的构建方法，包括下述步骤：

(1)在8月份麝鼠泌香盛期，采集雄性成年麝鼠香腺组织，将香腺组织剪碎并进行体外培养，获得麝鼠香腺成纤维细胞，将麝鼠香腺成纤维细胞进行慢病毒转染，获得转染的麝鼠香腺成纤维细胞；

(2)将步骤(1)中得到的转染的麝鼠香腺成纤维细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞；

(3)对筛选出的转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞进行扩增培养，即可获得永生化麝鼠香腺成纤维细胞。

进一步的，所述步骤(1)中，所述慢病毒转染为SV40病毒转染。

进一步的，所述步骤(1)中，将麝鼠香腺成纤维细胞进行慢病毒转染的具体步骤为：

A1、将麝鼠香腺成纤维细胞接种于6孔板上，每孔细胞数为0.8×10

A2、20-30h后，待细胞贴壁后，更换新的成纤维完全培养基；

A3、加入1mL成纤维完全培养基，再加20μL SV40过表达慢病毒，混匀后继续培养；

A4、12h后观察细胞状态，并更换为新鲜的成纤维完全培养基，当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中，细胞扩增3-4代，获得转染的麝鼠香腺成纤维细胞。

进一步的，所述步骤(2)中，将转染的麝鼠香腺成纤维细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞的具体步骤为：

B1、确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/mL，作用时间为2d；

B2、通过步骤B1确定的嘌呤霉素使用浓度和作用时间筛选出转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞。

进一步的，所述步骤B1中，确定嘌呤霉素的使用浓度和作用时间的具体步骤为：

①将未转染的麝鼠香腺成纤维细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育；培养基为成纤维完全培养基；

②24-26h后，除去步骤①中24孔板中的培养基，

③将含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基分别加入已铺有细胞的24孔板，48h对应更换一次新鲜培养基，并每天观察细胞的存活比例；所述嘌呤霉素的浓度分别为1ug/mL、2ug/mL、3ug/mL、4ug/mL、5ug/mL、6ug/mL和7ug/mL；培养基为成纤维完全培养基；

④最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度；结果确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/mL，作用时间为2d。

进一步的，所述步骤B2中，筛选出转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞的具体步骤为：

①将步骤(1)中转染的麝鼠香腺成纤维细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育；培养基为成纤维完全培养基；

②24-26h后，除去步骤①中24孔板中的培养基，

③加入筛选培养基，孵育，筛选培养基为成纤维完全培养基，加入有嘌呤霉素，浓度为2ug/mL；48h更换一次新鲜的筛选培养基，并每天观察细胞的存活比例；

④在同一时间点存活的细胞，即为转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞。

基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：

本发明提供的永生化麝鼠香腺成纤维细胞的构建方法，采用慢病毒转染的方式永生化麝鼠香腺成纤维细胞，克服了体外培养麝鼠香腺成纤维细胞凋亡的缺点，麝鼠香腺成纤维细胞进行体外培养不会发生凋亡，培养14代以后完全能保持成纤维细胞的特性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中麝鼠香腺成纤维细胞通过荧光倒置显微镜(100X)检测的细胞结构示意图；

图2是本发明实施例1中麝鼠香腺成纤维细胞通过荧光倒置显微镜(200X)检测的细胞结构示意图；

图3是本发明实施例1中转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞通过荧光倒置显微镜(100X)检测的细胞结构示意图；

图4是本发明实施例1中转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞通过荧光倒置显微镜(200X)检测的细胞结构示意图；

图5是本发明实施例1中永生化麝鼠香腺成纤维细胞通过荧光倒置显微镜(100X)检测的细胞结构示意图；

图6是本发明实施例1中永生化麝鼠香腺成纤维细胞通过荧光倒置显微镜(200X)检测的细胞结构示意图；

图7是本发明实施例中使用的SV40过表达慢病毒载体图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例1-实施例3中：

使用的成纤维完全培养基为：Primed-icell-003，赛百慷(上海)生物技术股份有限公司；

使用的SV40过表达慢病毒(如图7所示)购买于汉尹生物；载体目的序列信息如下：

Gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattc(atggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaatgaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaacaagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgtttaaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgccaacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggatataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaaaatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtggggggaaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggaggggagtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaaagaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagattatttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagtttgctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattggagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcagggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaa)tctagacacagtgcagcactctcaacgttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc；括号区域为目的序列区。

实施例1：

一种永生化麝鼠香腺成纤维细胞的构建方法，包括下述步骤：

(1)在8月份麝鼠泌香盛期，采集雄性成年麝鼠香腺组织，将香腺组织剪碎并进行体外培养，获得麝鼠香腺成纤维细胞，将麝鼠香腺成纤维细胞(如图1和图2所示)进行慢病毒转染，获得转染的麝鼠香腺成纤维细胞；

A1、将麝鼠香腺成纤维细胞接种于6孔板上，每孔细胞数为1.0×10

A2、24h后，待细胞贴壁后，更换新的成纤维完全培养基；

A3、加入1mL成纤维完全培养基，再加20μL SV40过表达慢病毒，混匀后继续培养；

A4、12h后观察细胞状态，并更换为新鲜的成纤维完全培养基，当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中，细胞扩增3-4代，获得转染的麝鼠香腺成纤维细胞；

(2)将步骤(1)中得到的转染的麝鼠香腺成纤维细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞；

B1、确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/mL，作用时间为2d；

①将未转染的麝鼠香腺成纤维细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育；培养基为成纤维完全培养基；

②24h后，除去步骤①中24孔板中的培养基，

③将含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基分别加入已铺有细胞的24孔板，48h对应更换一次新鲜培养基，并每天观察细胞的存活比例；所述嘌呤霉素的浓度分别为1ug/mL、2ug/mL、3ug/mL、4ug/mL、5ug/mL、6ug/mL和7ug/mL；培养基为成纤维完全培养基；

④最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度；结果确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/mL，作用时间为2d

B2、通过步骤B1确定的嘌呤霉素使用浓度和作用时间筛选出转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞；

①将步骤(1)中转染的麝鼠香腺成纤维细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育；培养基为成纤维完全培养基；

②24h后，除去步骤①中24孔板中的培养基，

③加入筛选培养基，孵育，筛选培养基为成纤维完全培养基，加入有嘌呤霉素，浓度为2ug/mL；48h更换一次新鲜的筛选培养基，并每天观察细胞的存活比例；

④在同一时间点存活的细胞，即为转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞(如图3和图4所示)；

(3)对筛选出的转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞进行扩增培养，即可获得永生化麝鼠香腺成纤维细胞(如图5和图6所示，为扩增14代后的细胞图)。

实施例2：

一种永生化麝鼠香腺成纤维细胞的构建方法，包括下述步骤：

(1)在8月份麝鼠泌香盛期，采集雄性成年麝鼠香腺组织，将香腺组织剪碎并进行体外培养，获得麝鼠香腺成纤维细胞，将麝鼠香腺成纤维细胞进行慢病毒转染，获得转染的麝鼠香腺成纤维细胞；

A1、将麝鼠香腺成纤维细胞接种于6孔板上，每孔细胞数为0.8×10

A2、30h后，待细胞贴壁后，更换新的成纤维完全培养基；

A3、加入1mL成纤维完全培养基，再加20μL SV40过表达慢病毒，混匀后继续培养；

A4、12h后观察细胞状态，并更换为新鲜的成纤维完全培养基，当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中，细胞扩增3-4代，获得转染的麝鼠香腺成纤维细胞；

(2)将步骤(1)中得到的转染的麝鼠香腺成纤维细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞；

B1、确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/mL，作用时间为2d；

①将未转染的麝鼠香腺成纤维细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育；培养基为成纤维完全培养基；

②26h后，除去步骤①中24孔板中的培养基，

③将含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基分别加入已铺有细胞的24孔板，48h对应更换一次新鲜培养基，并每天观察细胞的存活比例；所述嘌呤霉素的浓度分别为1ug/mL、2ug/mL、3ug/mL、4ug/mL、5ug/mL、6ug/mL和7ug/mL；培养基为成纤维完全培养基；

④最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度；结果确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/mL，作用时间为2d

B2、通过步骤B1确定的嘌呤霉素使用浓度和作用时间筛选出转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞；

①将步骤(1)中转染的麝鼠香腺成纤维细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育；培养基为成纤维完全培养基；

②26h后，除去步骤①中24孔板中的培养基，

③加入筛选培养基，孵育，筛选培养基为成纤维完全培养基，加入有嘌呤霉素，浓度为2ug/mL；48h更换一次新鲜的筛选培养基，并每天观察细胞的存活比例；

④在同一时间点存活的细胞，即为转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞；

(3)对筛选出的转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞进行扩增培养，即可获得永生化麝鼠香腺成纤维细胞。

实施例3：

一种永生化麝鼠香腺成纤维细胞的构建方法，包括下述步骤：

(1)在8月份麝鼠泌香盛期，采集雄性成年麝鼠香腺组织，将香腺组织剪碎并进行体外培养，获得麝鼠香腺成纤维细胞，将麝鼠香腺成纤维细胞进行慢病毒转染，获得转染的麝鼠香腺成纤维细胞；

A1、将麝鼠香腺成纤维细胞接种于6孔板上，每孔细胞数为1.2×10

A2、20h后，待细胞贴壁后，更换新的成纤维完全培养基；

A3、加入1mL成纤维完全培养基，再加20μL SV40过表达慢病毒，混匀后继续培养；

A4、12h后观察细胞状态，并更换为新鲜的成纤维完全培养基，当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中，细胞扩增3-4代，获得转染的麝鼠香腺成纤维细胞；

(2)将步骤(1)中得到的转染的麝鼠香腺成纤维细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞；

B1、确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/mL，作用时间为2d；

①将未转染的麝鼠香腺成纤维细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育；培养基为成纤维完全培养基；

②24h后，除去步骤①中24孔板中的培养基，

③将含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基分别加入已铺有细胞的24孔板，48h对应更换一次新鲜培养基，并每天观察细胞的存活比例；所述嘌呤霉素的浓度分别为1ug/mL、2ug/mL、3ug/mL、4ug/mL、5ug/mL、6ug/mL和7ug/mL；培养基为成纤维完全培养基；

④最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度；结果确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/mL，作用时间为2d

B2、通过步骤B1确定的嘌呤霉素使用浓度和作用时间筛选出转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞；

①将步骤(1)中转染的麝鼠香腺成纤维细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育；培养基为成纤维完全培养基；

②24h后，除去步骤①中24孔板中的培养基，

③加入筛选培养基，孵育，筛选培养基为成纤维完全培养基，加入有嘌呤霉素，浓度为2ug/mL；48h更换一次新鲜的筛选培养基，并每天观察细胞的存活比例；

④在同一时间点存活的细胞，即为转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞；

(3)对筛选出的转染成功的麝鼠香腺成纤维细胞进行扩增培养，即可获得永生化麝鼠香腺成纤维细胞。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。