一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型及应用

技术领域

本发明涉及无标记GPCR细胞筛选模型的构建方法，具体地说是一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型及应用。

背景技术

G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptor, GPCR）是细胞信号传导中最重要的一类膜受体，也是小分子药物开发中最受关注的药物靶点之一，约34％的现代药物直接靶向该受体家族[Hauser, A. S., et al., Nature Reviews Drug Discovery 2017, 16,829-842.]。褪黑素膜受体（MT1）属于GPCR家族的一员，于1994年首次从青蛙、羊和人克隆出MT1受体，由350个氨基酸组成[Ebisawa T., et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994,91, 6133–6137；Reppert SM., et al., Neuron 1994, 13, 1177–1185.]。MT1受体在大脑，心血管系统（包括外周血管，主动脉和心脏），免疫系统，睾丸，卵巢，皮肤，肝脏，肾脏，肾上腺皮质，胎盘，乳腺，视网膜，胰腺和脾脏中均有表达[Dubocovich ML., et al.,Endocrine 2005, 27, 101–110；Fischer TW., et al., Exp Dermatol 2008b, 17, 713–730；Pandi-Perumal SR., et al., Prog Neurobiol 2008, 85, 335–353；Slominski A.,et al., Endocrine 2005a, 27, 137–148；Slominski A., et al., Trends EndocrinolMetab 2008, 19, 17–24.]。研究显示，MT1的激活能导致血管收缩[Pandi-Perumal SR.,et al.,Prog Neurobiol 2008, 85, 335–353.]。此外，研究表明MT1受体基因除小鼠表型出异常行为，包括感觉运动门控受损和明显的抑郁情绪，提示MT1受体对正常的大脑和行为功能是非常重要的[Weil ZM., et al., Brain Res Bull 2006, 68, 425-429.]。此外，研究表明乳腺癌细胞中MT1受体的表达与褪黑素的抗肿瘤增殖作用呈正比，表明MT1受体参与调控乳腺癌的增殖过程[Collins A., et al., Cancer Lett 2003, 189, 49-57.]。构建MT1受体的细胞筛选模型，用以发现MT1受体的内源性配体、高活性激动剂、拮抗剂及通路调节剂，对揭示MT1的生物学功能及药理学特征具有重大意义。

目前受体的高通量筛选方法主要有传统的放射性配体受体结合实验法、GTPγS结合实验法、环磷酸腺苷（cAMP）分析法、钙流检测法、报告基因检测法、受体的内吞检测法及β-arrestin的招募检测法等[Bylund, D. B., et al., American Journal ofPhysiology 1993, 265, L421-L429；Harrison, C., et al., Life Sciences 2003, 74,489-508；Zhang, R., et al., Acta Pharmacologica Sinica 2012, 33, 372-384；Emkey, R., et al., in: Janzen, W. P., et al. (Eds.), High ThroughputScreening: Methods and Protocol, Second Edition；Fan, F., et al., Assay andDrug Development Technologies 2007, 5, 127-136；Zanella, F., et al., Trends inBiotechnology 2010, 28, 237-245；Luttrell, L. M., et al., Journal of CellScience 2002, 115, 455-465.]。但这些方法都有一定的局限性，如传统的放射性配体受体结合实验法需要洗涤和过滤，实验周期长及通量低等不足，此技术也不能区分受体的激动剂和拮抗剂；其余的GPCR检测方法主要针对某条信号通路的激活，对多条通路的激活无法区别，需要荧光蛋白标记或者额外加入指示剂，操作繁琐，而且指示剂的加入对细胞也会产生一定的损伤，影响筛选结果的可靠性。

发明内容

本发明的目的是提供一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述目的，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，提供一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型，以高通量筛选MT1受体内源性配体、激动剂、拮抗剂和通路调节剂，及MT1受体参与的失眠、异常生理节律、情绪障碍及肿瘤相关疾病的药物筛选应用。

本发明的技术方案为：

基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达MT1的细胞系CHO-MT1，借助于已知的激动剂和拮抗剂，建立MT1受体的细胞筛选模型。根据待测样品的DMR信号谱与已知激动剂和拮抗剂的DMR特征信号谱的相似性，判断待测样品的激动活性、拮抗活性，或者对下游通路的调节影响。

所述的无标记细胞整合药理学技术为利用共振波导光栅（RWG）生物传感器将药物导致的细胞内成分的动态再分布现象转化为整体的、动态的波长位移响应信号，此信号为波长变化的响应值（pm），通过Epic光学生物传感器384微孔板实现。模型的建立过程为：

1)在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种CHO-MT1细胞，接种的细胞密度为1.0 ~ 4.5 × 10

2)将溶解在HBSS缓冲盐中的MT1受体激动剂褪黑素以浓度为0.01 ~ 50000 nM加入到接种CHO-MT1细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；

3)将溶解在HBSS缓冲盐中的MT1受体拮抗剂Luzindole以浓度为0.01 ~ 100000 nM加入到接种CHO-MT1细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；

4)获得的所有DMR特征信号谱具有浓度-响应依赖关系且具有灵敏性、饱和性及特异性。

其中，所述待测样品具有激动活性的筛选步骤如下：

1)将溶解在HBSS缓冲盐中的MT1受体激动剂褪黑素以浓度为0.01 ~ 50000 nM加入到接种CHO-MT1细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；

2)将待测样品以0.01 nM ~ 100 µM加入到接种CHO-MT1细胞的微孔板中，检测其DMR信号谱；

3)关联分析步骤1）和步骤2）中的DMR信号谱，若步骤2）的DMR信号谱与1）中的DMR特征谱具有轮廓相似性, 则进行下一步骤；

4)将MT1受体拮抗剂Luzindole以浓度0.01 ~ 100000 nM加入到接种CHO-MT1细胞的微孔板中，预处理5 ~ 60 min，加入与步骤2）中相同浓度的待测样品，检测其DMR信号，若此DMR信号强度低于步骤2）中的DMR信号强度，则判断此样品为MT1受体的激动剂。

其中，所述待测样品具有拮抗活性的筛选步骤如下：

1)将待测样品和褪黑素分别加入到接种CHO-MT1细胞的微孔板中，待测样品浓度为0.01 nM ~ 100 µM，褪黑素浓度为0.01 ~ 50000 nM，检测DMR信号谱；

2)若步骤1）中待测样品不引起DMR信号谱，再向步骤1）中加入了待测样品的细胞板中继续加入与步骤1）中相同浓度的褪黑素，检测DMR信号谱；若此DMR信号比步骤1）中褪黑素的信号弱，可判断待测样品是MT1受体的拮抗剂。

其中，所述待测样品对MT1通路有调节活性的步骤如下：

1)将待测样品和MT1受体激动剂褪黑素分别加入到接种CHO-MT1细胞的微孔板中，待测样品浓度为0.01 nM ~ 100 µM，褪黑素浓度为0.01 ~ 50000 nM，检测DMR信号谱；

2)再向步骤1）中加入了待测样品的细胞板中继续加入与步骤1）中相同浓度的褪黑素，检测DMR信号谱，检测时间为1 ~ 60 min；若此DMR信号比步骤1）中褪黑素的信号在上升期、平台期和延滞期某一个阶段不同；

3)将MT1受体拮抗剂Luzindole以浓度0.1 ~ 1000 nM加入到接种CHO-MT1细胞的微孔板中，预处理5 ~ 60 min，加入与步骤1）中相同浓度的待测样品，检测其DMR信号，若此DMR信号谱与步骤1）中的样品的DMR信号谱一致，可判断待测样品是MT1受体下游信号通路的调节剂。

其中，所述上升期为1 ~ 10 min、平台期为10 ~ 20 min和延滞期为20 ~ 60 min。

本发明建立的一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型，可为对商品化的小分子库、自主制备的天然产物提取物、组分或化合物库及化学修饰物进行高通量筛选，获得MT1受体的激动剂、拮抗剂和通路调节剂。此外，根据靶点与疾病的相关性，发现MT1受体在失眠、异常生理节律、情绪障碍及肿瘤中发挥重要作用，也可开展相关疾病的药物筛选。

附图说明

图 1（A）不同浓度的褪黑素在CHO-MT1细胞上的DMR特征信号谱；（B）不同浓度的褪黑素在CHO-MT1细胞上的浓度-响应依赖曲线；其中褪黑素的浓度单位为nM。

图2 不同浓度的Luzindole在CHO-MT1细胞上的DMR特征信号谱；其中Luzindole的浓度单位为nM。

图 3 （A）不同浓度的褪黑素预处理CHO-MT1细胞1 h后，固定浓度褪黑素的DMR信号谱；（B）不同浓度的褪黑素预处理CHO-MT1细胞1 h后，固定浓度褪黑素的DMR信号谱对应的浓度-响应依赖曲线；其中褪黑素的浓度单位为nM。

图 4 （A）不同浓度的Luzindole预处理CHO-MT1细胞1 h后，固定浓度褪黑素的DMR信号谱；（B）不同浓度的Luzindole预处理CHO-MT1细胞1 h后，固定浓度褪黑素的DMR信号谱对应的浓度-响应依赖曲线；其中褪黑素和Luzindole的浓度单位为nM。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：MT1受体激动剂褪黑素在CHO-MT1细胞上的DMR特征信号谱

中国仓鼠卵巢细胞CHO-MT1细胞来源于中国科学院大连化学物理研究所，倒置显微镜购于OLYMPUS，褪黑素和Luzindole分别购于AMQUAR和Sigma公司。细胞培养板为Epic光学生物传感384微孔板，购于康宁公司，检测平台为康宁第三代Epic®成像仪，检测的信号为细胞动态质量重置（DMR）引起的波长位移。

将处于对数生长期的CHO-MT1细胞，接种于细胞兼容的384微孔板中，每孔的接种体积为40 µL，每孔接种的细胞数目为1.0×10

研究表明褪黑素呈剂量依赖地激活MT1受体，剂量响应曲线呈单相“S”型且都达到饱和响应，最高的DMR响应值达100 pm，其EC

实施例2：MT1受体拮抗剂Luzindole在CHO-MT1细胞上的DMR特征信号谱

将处于对数生长期的CHO-MT1细胞，接种于细胞兼容的384微孔板中，每孔的接种体积为40 µL，每孔接种的细胞数目为1.0×10

研究表明不同浓度的Luzindole的DMR响应信号接近于零。

实施例3：CHO-MT1细胞的脱敏DMR特征信号谱

将处于对数生长期的CHO-MT1细胞，接种于细胞兼容的384微孔板中，每孔的接种体积为40 µL，每孔接种的细胞数目为1.0×10

研究表明褪黑素呈剂量依赖地脱敏MT1受体，剂量响应曲线呈单相“S”型且都达到饱和响应，其的IC

实施例4： CHO-MT1细胞的拮抗DMR特征信号谱

将处于对数生长期的CHO-MT1细胞，接种于细胞兼容的384微孔板中，每孔的接种体积为40 µL，每孔接种的细胞数目为1.0×10

研究表明Luzindole呈剂量依赖的拮抗MT1受体，剂量响应曲线呈单相“S”型且都达到饱和响应，其IC

本发明基于无标记细胞整合药理学技术，建立了MT1无标记筛选模型，此模型具有不需要荧光标记且检测过程无需额外添加指示剂的优势，高效可靠的筛选商品化的小分子库、自主制备的天然产物提取物、组分或化合物库及化学修饰物，以获得MT1受体的激动剂、拮抗剂和通路调节剂及MT1受体调控的失眠、异常生理节律、情绪障碍及肿瘤相关疾病的药物。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限。