一种快速准确筛选植物病原真菌拮抗细菌菌株的方法

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种快速准确筛选植物病原真菌拮抗细菌菌株的方法。

背景技术

生物防治逐渐成为近年来田间病虫害防治的重要手段和研究热点之一，尤其是对于常见田间病害的防治，微生物菌剂的研究与应用成为热门。因此，从田间土壤或者其它供试材料中分离、纯化、筛选、鉴定出对供试病原菌具有较好拮抗作用的拮抗菌株是必不可少的步骤，但是从分离纯化，尤其是大量的筛选过程工作量之巨大，费时费力，往往还会产生一定的误差。

用于植物病害生物防治的生防因子有很多，其中以生防菌株的研究与应用最为广泛，效果最好。拮抗细菌在植物病害防治中发挥了非常重要的作用，筛选和应用拮抗细菌是当前植物病害防治领域研究的热点之一。其中，被开发作为生物农药的细菌菌株主要集中于芽孢杆菌（

但是关于拮抗细菌的前期分离筛选工作量十分巨大，现有的筛选方法是平板对峙培养法，如KB药敏实验法（也叫滤纸片法），牛津杯法,改良的平板对峙培养法，高通量48孔细胞培养板法。定位的方法多是提前在培养皿上用记号笔标记，或者也有技术发明，如定位盘。工作费时费力，有时还会存在一定的误差，不够准确；定位盘的使用也不太方便，不能较好的解决问题。

公开号为CN103013884A的专利 “一种从堆肥中快速、高效筛选拮抗细菌的方法”。该发明先将堆肥悬浮液涂布于平板后，再直接在平板上涂布致病菌菌液，使目标细菌与致病菌直接对峙，待形成抑菌圈后，从抑菌圈内将混合的目标细菌进行划线纯化，纯化后再挑取单个目标细菌进行平板对峙，从而筛选出拮抗细菌。一定程度上减少了分离筛选的工作量，但是后续挑取单个目标菌株可能不纯，纯化拮抗细菌也较为麻烦，甚至不容易得到具有较好抑制效果的原始目标菌株。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种快速准确筛选植物病原真菌拮抗细菌菌株的方法。

本发明采用的技术方案为：

一种快速准确筛选植物病原真菌拮抗细菌菌株的方法，包括以下步骤：

（1）采用梯度稀释法从根际土壤样品或其他供试材料中分离获得细菌菌株，用划线纯化法对分离获得的菌株进行纯化，获得纯培养，并于4℃保存备用；

（2）采用点接法和平板对峙培养法相结合，将培养好的细菌菌种对植物病原菌进行初筛，以获得具有明显抑制效果的拮抗细菌；

（3）将初筛得到的拮抗菌株进行液体发酵培养，然后采用改良的平板对峙培养法和十字定位法，用移液枪吸取5μL发酵液，点在距离中心2.5 cm的对称四点的培养基上，中心位置接种植物病原真菌的5 mm菌柄，在特定的培养条件下对峙培养，测量菌落半径和抑菌带的大小，将最终筛选获得的拮抗细菌菌株保存在灭菌的50%甘油中，-80 ℃长久保存用。

所述的步骤（1）中的采用梯度稀释法从根际土壤样品或其他供试材料中分离获得细菌菌株，指的是：将采回的根际土壤样品平铺于室内阴凉处风干，并挑出残根、石块等杂物，风干土样研磨后用10目的筛子过筛，用四分法收集土壤样品，称取土样10g，加入已盛有90mL无菌水的250mL锥形瓶中，向瓶中加入灭菌后的玻璃珠，封口放置在摇床上180 r/min，30 min，使土样中菌体、芽孢、孢子均匀分散，然后静置30-40s，取上清液分别稀释至10

所述的步骤（1）中对分离的菌株进行纯化，指的是取100μL的10

所述的步骤（2）中将培养好的细菌菌种对植物病原菌进行初筛，指的是，以植物病原菌为靶标，采用平板对峙培养法和点接法选取培养好的病原菌菌落，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，转接至病原菌的特定平板中央，用灭菌牙签分别将分离纯化获得的不同细菌菌株接种到距离病原真菌2.5cm等距的4个点上，注意接种时尽量保证接种量一致，与病原菌对峙培养，以不接细菌只接病原菌为对照，重复3次，正置放入25℃恒温箱培养至病原菌对照组菌落长至7.0±0.5 cm时，测量菌丝半径，计算抑制率。

所述的步骤（3）中的十字定位法，指的是提前在超净工作台上用记号笔画上两条长为5cm垂直平分的线段，使其均分为等距的2.5cm的四个线段或者只接点上离中心等距2.5cm的均匀分布的4个点，直接将倒好的平板放置于定位点上方，调整至合适的位置，然后接种拮抗细菌菌液和病原菌菌饼即可，待实验结束后只需用酒精轻轻擦拭桌面即可恢复原貌。

本发明的有益效果是：本发明操作简单，方法简便，极大减少了工作量，缩短了筛选拮抗菌的时间，提高了筛选效率，同时保证了筛选结果的准确性，与其他现有的方法相比省时省力且更准确，本发明在加快生防菌的开发和应用，促进我国生物防治和可持续农业的发展方面，具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1为本发明的十字定位法的结构示意图；图中，a、两条垂直平分的线段的定位画法，b、距离中间等距均匀分布的四点定位画法，c、a画法的实施例图，d、b画法的实施例图。

图2为本发明的实施例的结构示意图；图中，自左到右分别是CK，LB-9对峙效果图，XM0321对峙效果图；自上到下分别是正面和背面的菌落图, a是CK的正面图，d是CK的背面图，b是LB-9正面图，e是LB-9背面图，c是XM0321正面图，f是XM0321背面图。

具体实施方式

如图1-图2所示，一种快速准确筛选植物病原真菌拮抗细菌菌株的方法，包括以下步骤：

（1）采用梯度稀释法从根际土壤样品或其他供试材料中分离获得细菌菌株，用划线纯化法对分离获得的菌株进行纯化，获得纯培养，并于4℃保存备用；

（2）采用点接法和平板对峙培养法相结合，将培养好的细菌菌种对植物病原菌进行初筛，以获得具有明显抑制效果的拮抗细菌；

（3）将初筛得到的拮抗菌株进行液体发酵培养，然后采用改良的平板对峙培养法和十字定位法，用移液枪吸取5μL发酵液，点在距离中心2.5 cm的对称四点的培养基上，中心位置接种植物病原真菌的5 mm菌柄，在特定的培养条件下对峙培养，测量菌落半径和抑菌带的大小，将最终筛选获得的拮抗细菌菌株保存在灭菌的50%甘油中，-80 ℃长久保存用。

所述的步骤（1）中的采用梯度稀释法从根际土壤样品或其他供试材料中分离获得细菌菌株，指的是：将采回的根际土壤样品平铺于室内阴凉处风干，并挑出残根、石块等杂物，风干土样研磨后用10目的筛子过筛，用四分法收集土壤样品，称取土样10g，加入已盛有90mL无菌水的250mL锥形瓶中，向瓶中加入灭菌后的玻璃珠，封口放置在摇床上180 r/min，30 min，使土样中菌体、芽孢、孢子均匀分散，然后静置30-40s，取上清液分别稀释至10

所述的步骤（1）中对分离的菌株进行纯化，指的是取100μL的10

所述的步骤（2）中将培养好的细菌菌种对植物病原菌进行初筛，指的是，以植物病原菌为靶标，采用平板对峙培养法和点接法选取培养好的病原菌菌落，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，转接至病原菌的特定平板中央，用灭菌牙签分别将分离纯化获得的不同细菌菌株接种到距离病原真菌2.5cm等距的4个点上，注意接种时尽量保证接种量一致，与病原菌对峙培养，以不接细菌只接病原菌为对照，重复3次，正置放入25℃恒温箱培养至病原菌对照组菌落长至7.0±0.5 cm时，测量菌丝半径，计算抑制率。

所述的步骤（3）中的十字定位法，指的是提前在超净工作台上用记号笔画上两条长为5cm垂直平分的线段，使其均分为等距的2.5cm的四个线段或者只接点上离中心等距2.5cm的均匀分布的4个点，直接将倒好的平板放置于定位点上方，调整至合适的位置，然后接种拮抗细菌菌液和病原菌菌饼即可，待实验结束后只需用酒精轻轻擦拭桌面即可恢复原貌。

实施例

(1)以土壤样品为例，将采回的根际土壤样品平铺置于室内阴凉处风干，并挑除残根、石块等杂物。风干土样研磨后用10目（孔径为2mm）的筛子过筛，用四分法收集土壤样品。称取土样10g，加入已盛有90mL无菌水的250mL锥形瓶中。向瓶中加入灭菌后的玻璃珠，封口放置在摇床上180r/min，30min，使土样中菌体、芽孢、孢子等均匀分散。然后静置30-40 s，取上清分别稀释至10

(2)以植物病原菌为靶标，采用平板对峙培养法和点接法选取培养好的病原菌菌落，用直径为5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，转接至病原菌的特定平板中央。用灭菌牙签分别将分离纯化获得的不同细菌菌株接种到距离病原真菌2.5cm等距的4个点上，注意接种时尽量保证接种量一致，与病原真菌对峙培养。以不接细菌只接病原菌为对照，重复3次。正置放入25 ℃恒温箱（取决于病原菌的培养条件）培养至病原菌对照组菌落长至7.0±0.5cm时，测量菌丝半径，计算抑制率。

(3)将初筛获得的具有拮抗效果的细菌菌株进行液体发酵培养（可设定统一标准，如温度30℃，转速180r/min，装液量20/100mL，液体LB震荡培养24 h），然后用移液枪吸取5μL的细菌菌株发酵液（也可根据实验需要，用0.22μm的无菌滤膜过滤，制备无菌发酵滤液进行复筛的对峙实验），自然垂直、轻轻滴加至距离培养皿中心2.5cm的对称4个定位点上，重复3次（也可不设置重复，一个培养皿中已经点了四个相同的细菌发酵液处理，可作为4次重复），静置2-3 min使其自然风干凝结（以不会流动扩散为宜），在中心位置接种植物病原真菌的5 mm菌柄，在特定的培养条件下（以植物病原的最适培养条件为准，一般为PDA，25℃，12/12h恒温光照培养）对峙培养，测量菌落半径和抑菌带的大小。可将最终筛选获得的拮抗细菌菌株保存在灭菌的50%甘油中，-80 ℃长久保存用。

定位点的常规方法为事先在培养皿的背面做好标记，待实验结束后拍照时还需要用酒精棉擦拭，工作量较大；定位盘的使用不方便操作，培养皿不方便拿取。本专利提供如下定位法，命名为“十字定位法”或“五点定位点法”，操作简单，只需要提前在超净工作台上用记号笔画上两条长为5 cm垂直平分的线段，使其均分为等距的2.5 cm的四个线段（或者直接点上离中心等距2.5cm均匀的4个点），如图1中a、b所示。直接将倒好的平板放置于定位点上方，调整至合适的位置，如图1中c、d所示，然后接种拮抗细菌菌液和病原菌菌柄即可，待实验结束后只需用酒精轻轻擦拭桌面即可恢复原貌。

常用培养基配方：

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，自然pH。

LB固体培养基：牛肉膏5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.4-7.6。

LB液体培养基：牛肉膏5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.4-7.6。

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Ba-0321菌株、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）LB-9菌株均由河南省农业科学院烟草研究所菌源库提供。以XM0321设置温度30℃，转速180r/min，装液量20/100mL，液体LB震荡培养24h，OD600：7.284为例；LB-9同样的发酵条件，OD600：1.890为例；用移液枪吸取1-10μL的发酵液（也可是无菌滤液）点在培养基上，3次重复，静置几分钟，待菌液自然风干凝结，测量如下表所示的数据，仅供参考，本专利所举实例均选择5μL（推荐用量），因为不同菌株的黏附度、流动性、生长速度、菌落大小等不一，所以筛选时可制定统一标准，以期筛选出生长速度快，繁殖能力强，抑菌效果好的拮抗菌株；如果后续对筛选的少量拮抗菌株深入研究，可设计预实验选择合适的菌液使用量。

如图2所示，以棘孢木霉（Trichoderma asperellum）Tr-0111菌株为指示菌株（不是病原菌，只是为了直观的帮助理解），LB-9和XM0321为拮抗细菌进行对峙，便于理解。

（1）点接法，只需要用灭菌牙签将纯化好的菌落轻轻点在牙签上，然后再轻轻点在培养皿的定位点上就可以，初筛时一个皿中可以点接4个不一样的纯化细菌，方便快捷，省时省力，帮助快速的分离筛选掉抑制效果较差的菌株。同时也可根据实际情况在培养基上均匀点接1-8个不等的纯化细菌菌株，快速筛选，这也是预保护点之一。

（2）改良的平板对峙培养法，用移液枪直接吸取发酵液点在定位点上，方便快捷，发酵液晾干后自然形成一个圆形的菌落雏形，且培养一定时间后生长为一个圆形细菌菌落。保护点在于移液枪吸取的量。

（3）十字定位法（五点定位法），操作简单，省时省力，节约耗材，保护点在于定位点距中心的距离和定位点的个数。可根据实际情况调节距离的远近，也可调节为等距的三点（四点定位法）、等距的五点（六点定位法）等。