IFITMs在制备EBV上皮感染抑制剂和上皮型肿瘤防治药物中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及IFITMs在制备EBV上皮感染抑制剂和上皮型肿瘤防治药物中的应用。

背景技术

EB病毒(EBV)属于γ疱疹病毒家族的成员之一，又称4型人疱疹病毒。EBV的感染率极高，有调查显示，超过95％以上的人群在年幼时都感染过EBV，而且EBV的感染人群分布广泛，从婴幼儿到老年人均可致病。EBV主要通过感染口咽部的上皮细胞，随上皮组织中的血管运输到达B淋巴细胞，随后在B淋巴细胞中进入潜伏感染期。EBV感染可诱发多种疾病，如传染性单核细胞增多症、嗜血细胞综合征、口腔毛状粘膜白斑病、慢性活动性EBV感染等非肿瘤性疾病，此外，现有研究表明，EBV感染还可能诱发多种恶性肿瘤的发生：如血液系统肿瘤中的B/T/NK细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等；非血液系统肿瘤中的鼻咽癌、胃癌、肝细胞癌、乳腺癌等。从眼、鼻咽，到皮肤、造血系统、胃、肝、肺、乳腺等全身多器官均可被累及。因此，EBV感染对人类生命健康具有极大的威胁。

IFITMs(interferon-induced transmembrane protein，干扰素诱导性跨膜蛋白)在真核动物和原核动物中普遍表达。IFITMs可根据其功能被分为三类：其中第一类主要包括人类和小鼠的IFITM1，IFITM2和IFITM3以及小鼠的IFITM6和IFITM7分子，前三种蛋白最初分别被命名为CD225(或9-27)、1-8D和1-8U。CD22、1-8D和1-8U在小鼠上又名fragilis2，fragilis3和fragilis。由于三者都具有较强的抗病毒活性，因此又被统称为免疫相关的IFITMs。IFITMs被发现可抑制肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、寨卡病毒(ZIKV)等人类致病病毒的感染，但其在EBV感染及其相关疾病中发挥的作用尚未可知。

发明内容

本发明的目的在于提供干扰素诱导性跨膜蛋白或其过表达细胞在制备EBV感染抑制剂中的应用；

本发明的另一目的在于提供干扰素诱导性跨膜蛋白或其过表达细胞在制备癌症防治药物中的应用；

本发明的另一目的在于提供干扰素诱导性跨膜蛋白或其过表达细胞在制备潜伏膜蛋白LMP1抑制剂中的应用；

本发明的另一目的在于提供干扰素诱导性跨膜蛋白或其过表达细胞在制备EBV受体或促进因子拮抗剂中的应用；

本发明的另一目的在于提供一种药物；

本发明的另一目的在于提供一种细胞系。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

干扰素诱导性跨膜蛋白或其过表达细胞在制备各类EBV感染抑制剂中的应用；

其中，所述干扰素诱导性跨膜蛋白包括IFITM1、IFITM2和IFITM3。

进一步地，上述IFITM1蛋白的氨基酸序列为：

MHKEEHEVAVLGPPPSTILPRSTVINIHSETSVPDHVVWSLFNTLFLNWCCLGFIAFAYSVKSRDRKMVGDVTGAQAYASTAKCLNIWALILGILMTIGFILLLVFGSVTVYHIMLQIIQEKRGY(SEQ ID NO.1)。

进一步地，上述IFITM2蛋白的氨基酸序列为：

MNHIVQTFSPVNSGQPPNYEMLKEEQEVAMLGVPHNPAPPMSTVIHIRSETSVPDHVVWSLFNTLFMNTCCLGFIAFAYSVKSRDRKMVGDVTGAQAYASTAKCLNIWALILGIFMTILLIIIPVLVVQAQR(SEQ IDNO.2)。

进一步地，上述IFITM3蛋白的氨基酸序列为：

MNHTVQTFFSPVNSGQPPNYEMLKEEHEVAVLGAPHNPAPPTSTVIHIRSETSVPDHVVWSLFNTLFMNPCCLGFIAFAYSVKSRDRKMVGDVTGAQAYASTAKCLNIWALILGILMTILLIVIPVLIFQAYG(SEQ IDNO.3)。

更进一步，所述干扰素诱导性跨膜蛋白还包括：上述SEQ ID NO.1或上述SEQ IDNO.2或上述SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后且具有能抑制EB病毒与宿主细胞融合、EB病毒进入宿主细胞或EB病毒在宿主细胞内复制等功能的氨基酸序列。

更进一步地，上述干扰素诱导性跨膜蛋白为IFITM1、IFITM2和IFITM3。

在本发明实施例中，上述干扰素诱导性跨膜蛋白为IFITM1。

EBV主要感染B细胞和上皮细胞。发明人发现，EBV进入上皮细胞的机制与B细胞不同。而研究IFITMs是否作为EBV受体相关蛋白或竞争性结合蛋白影响EBV感染尤其在上皮细胞中感染过程及其机制将有助于攻破EBV相关疾病尤其是恶性上皮型肿瘤预防和治疗的壁垒，为人类健康带来巨大福祉。

进一步地，上述EBV感染抑制剂作用于上皮细胞。

进一步地，上述上皮细胞包括正常上皮细胞(NP69细胞、NP460细胞)和上皮肿瘤细胞(HK1细胞)。

根据实际使用需求，本发明应包括其他EBV可能感染的上皮细胞。

本发明的第二个方面，提供：

干扰素诱导性跨膜蛋白或其过表达细胞在制备癌症防治药物中的应用；其中，所述干扰素诱导性跨膜蛋白包括IFITM1、IFITM2和IFITM3。

进一步地，上述癌症包括鼻咽癌和EBV相关的其它上皮性肿瘤。

本发明中的实施例证明，IFITM1重组蛋白可降低肿瘤的生长速度，因此，还可以基于IFITM1开发针对鼻咽癌的新防治手段。

进一步地，上述癌症防治药物的剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、溶液剂和散剂；当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理采用任意剂型制备得到上述癌症防治药物。

本发明的第三个方面，提供：

干扰素诱导性跨膜蛋白或其过表达细胞在制备潜伏膜蛋白LMP1抑制剂中的应用；

其中，所述干扰素诱导性跨膜蛋白包括IFITM1、IFITM2和IFITM3。

发明人发现，在EBV感染鼻咽上皮细胞并发展成鼻咽癌后，IFITM1可通过降低潜伏期关键癌蛋白LMP1的表达，抑制鼻咽癌增殖，延缓肿瘤进展。

进一步地，上述潜伏膜蛋白LMP1抑制剂的剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、溶液剂和散剂；当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理采用任意剂型制备得到上述潜伏膜蛋白LMP1抑制剂。

本发明的第四个方面，提供：

干扰素诱导性跨膜蛋白或其过表达细胞在制备EBV受体或促进因子拮抗剂中的应用；其中，所述干扰素诱导性跨膜蛋白包括IFITM1、IFITM2和IFITM3。

进一步地，上述EBV受体或促进因子包括MYH9、EGFR、ITGAV和EphA2。

更进一步地，上述EBV受体或促进因子为EphA2。

EphA2是一个跨膜酪氨酸激酶受体，属于酪氨酸激酶受体(receptor tyrosinekinases,RTKs)超家族成员之一。EphA2通过与EBV包膜糖蛋白(gH/gL、gB)结合并促进EBV感染，是EBV进入上皮细胞的主要宿主来源受体。IFITMs在发挥抗病毒作用时，同一家族成员在不同宿主细胞中发挥的作用可能不同，因此，IFITM1可能通过与宿主蛋白相互作用的方式共同影响病毒感染进程。

本发明中的实施例显示，在IFITM1可以抑制EBV感染上皮的基础上，IFITM1对EphA2的作用机制为：IFITM1通过与EphA2结合，抑制或削弱了后者与EBV糖蛋白(gH/gL、gB)之间的结合，从而降低EBV感染上皮细胞的能力。

本发明的第五个方面，提供：

一种药物，该药物含有干扰素诱导性跨膜蛋白或其过表达细胞；其中，所述干扰素诱导性跨膜蛋白包括IFITM1、IFITM2和IFITM3，所述药物用于预防EBV感染。

进一步地，上述药物还含有其他药学上可接受的辅料。

进一步地，上述药物的剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、溶液剂、散剂以及外泌体制剂、AAV制剂。

本发明的第六个方面，提供：

一种细胞系，该细胞系表达IFITM1、IFITM2或IFITM3中的一种或多种。

本发明构建得到一种过表达IFITM1细胞系，构建得到的细胞均能有效且稳定的表达出IFITM1。

本发明的有益效果是：

1.本发明通过构建干扰素诱导性跨膜蛋白过表达和敲低细胞系，首次确切证实了IFITM1在EBV感染过程中发挥抑制性作用，且这种抑制作用在正常上皮(NP69、HEK293)和肿瘤细胞(HK1)中均存在。同时，本发明描述了IFITM2、IFITM3在EBV感染过程中可能发挥抑制性作用，为抗EBV感染药物的开发提供了理论依据。

2.本发明还揭示了IFITM1在EBV阳性鼻咽癌中发挥的作用及其与LMP1的关系，证实了在EBV感染鼻咽上皮细胞并发展成鼻咽癌之后，IFITM1可通过降低潜伏期关键癌蛋白LMP1的表达，抑制鼻咽癌增殖，延缓肿瘤进展。

3.本发明还指出了IFITM1在EBV暴露状态下可减少EBV感染上皮细胞，基于IFITM1可开发有效预防EBV感染的手段；而IFITM1重组蛋白可降低肿瘤的生长速度，基于IFITM1可开发针对鼻咽癌的新防治手段。

附图说明

图1为根据EBV感染上皮细胞受体或促进因子及IFITMs表达差异绘制的热图；

图2为NP69(A)、HEK293(B)和HK1(C)稳定过表达IFITM1细胞株的IFITM1表达情况；

图3为敲低IFITM1后NP69(A)、HEK293(B)和HK1(C)细胞株的IFITM1表达情况；

图4为稳定过表达IFITM1的NP69、HEK293和HK1细胞株的EBV-GFP感染效率流式图(A、B和C)以及代表性的荧光照片(D)；

图5为IFITM1的NP69、HEK293和HK1细胞株的EBV-GFP感染效率流式图(A、B和C)以及代表性的荧光照片(D)；

图6为IFITM1与EphA2的荧光共定位实验(6A)和双向免疫共沉淀(6B)；

图7为HEK293细胞株中过表达EphA2对过表达IFITM1细胞株EBV感染的效率流式图(A)以及代表性的荧光照片(B)；

图8为IFITM1抑制EBV+肿瘤增殖的体外和体内实验，其中，A为IFITM1体外抑制肿瘤增殖的对比图；B为体内实验中肿瘤体积变化照片；C为体内实验中的肿瘤体积增长曲线；

图9为IFIMT1过表达(A)和敲低(B)对LMP1表达的影响的免疫印迹图谱。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

上皮细胞中IFITMs表达情况检测

本实施例分别选取B细胞系(Daudi)、鼻咽癌细胞系(HK1)、鼻咽癌EBV阳性细胞系(HK1-EBV和C666-1)、人胚肾239细胞(HEK293)、永生化的正常人鼻咽上皮细胞系(NP69)、永生化的正常人鼻咽上皮细胞系(NP460)和EBV阳性鼻咽上皮细胞系(NP460-EBV)作为检测对象，检测各检测对象中的IFITMs表达情况。

(1)细胞培养：

B细胞系(Daudi)、鼻咽癌细胞系(HK1)和鼻咽癌EBV阳性细胞系(HK1-EBV和C666-1)均采用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养。

人胚肾239细胞(HEK293)采用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养。

永生化的正常人鼻咽上皮细胞系(NP69)采用无血清的Defined keratinocyte-SFM培养基(DKSFM)培养，培养期间补充上皮生长因子。

永生化的正常人鼻咽上皮细胞系(NP460)和EBV阳性鼻咽上皮细胞系(NP460-EBV)均采用混合培养基(1:1混合的DKSFM培养基和无血清的

上述所有细胞在培养时均添加1％的青霉素和链霉素，培养环境为37℃、5％二氧化碳。

(2)RNA提取和质量鉴定：

RNA提取采用酚-氯仿抽提法，Nanodrop

(3)转录组测序建库：

转录组测序建库采用

(4)IFITMs差异表达分析

将NP69、NP460、HK1、HEK293细胞作为EBV(-)上皮细胞组(EBV.N)，将NP460-EBV、HK1-EBV、C666-1作为EBV(+)上皮细胞组(EBV.P)。分别筛选各组与B细胞系组(B_Cells)的差异表达基因(每组3个技术重复)。

计算各组基因表达量的平均值后取Log10的对数，绘制IFITMs(IFITM1、IFITM2、IFITM3)以及MYH9、EGFR、ITGAV、EphA2等EBV感染相关受体或促进因子的热图(图1)，发现IFITM1、IFITM2、IFITM3不仅在B细胞中具有较低的表达水平，且在EBV.N与EBV.P中与EBV感染相关受体或促进因子基本呈反向表达趋势，提示IFITM1、IFITM2、IFITM3可能在EBV感染上皮细胞过程中发挥特异性抑制性作用。其中，IFITM1在EBV.N与EBV.P中最为明显。说明IFITM1、IFITM2、IFITM3(尤其是IFTM1)可能与抑制EBV感染上皮细胞相关。

IFITM1过表达上皮细胞株的构建

选取了3株细胞进行IFITM1的过表达细胞株构建。其中，选择NP69、HEK293、HK1作为试验对象。原因在于，HEK293属上皮细胞，是病毒感染研究中常用的模式细胞；NP69是永生化的正常人鼻咽上皮细胞系，用于阐释在尚未接触EBV之前IFITM1是否对正常上皮细胞发挥保护作用；HK1是人鼻咽癌细胞系，鼻咽癌属上皮型肿瘤，其发生与进展与EBV感染高度相关。本实施例可以通过HK1来阐释IFITM1在上皮细胞已经发生恶性转化后是否对肿瘤细胞发挥保护作用。

(1)细胞培养：

选择选取HEK293T细胞进行慢病毒构建及扩增，培养方法同HEK293细胞。NP69、HEK293、HK1培养方法同上述实施例。

(2)IFITM1过表达质粒构建及慢病毒包装：

从正常鼻咽细胞中通过PCR扩增得到IFITM1序列，将得到的IFITM1序列克隆至慢病毒pCW57.RFP-P2A-MCS质粒(购自AddGene)中，质粒经测序确认后，与慢病毒包装质粒VSVG和psPAX2(购自AddGene)一起转染HEK293T细胞，收集细胞中的IFITM1高表达病毒与未克隆IFITM1的对照病毒后进行浓缩，用于细胞感染或保存于-80℃备用。

(3)IFITM1过表达慢病毒感染细胞：

将上述步骤获得的MSCV-IFITM1-ires-hCD2与对照病毒MSCV-ires-hCD2优化感染效率后，分别感染上述步骤培养的NP69、HEK293、HK1细胞。感染72小时后观察荧光表达强度及比例，并进一步用700μg/mL嘌呤霉素剔除未感染细胞(或通过流式细胞术分选已感染细胞)。当荧光比率在90％以上时采用荧光定量聚合酶链反应法(PCR)检测过表达效果。

结果：

与对照病毒感染的细胞的IFITM1表达情况相比，IFITM1稳定过表达细胞系均有效表达出IFITM1，说明IFITM1稳定过表达细胞系构建成功(如图2)。

IFITM1敲低上皮细胞株的构建

选择NP69、HEK293、HK1细胞进行IFITM1的敲低细胞株构建，理由同上。

(1)细胞培养：

选择选取HEK293T细胞进行慢病毒构建及扩增，培养方法同HEK293细胞。NP69、HEK293、HK1培养方法同上述实施例。

(2)IFITM1敲低质粒构建及慢病毒包装：

设计靶向IFITM1的短发卡RNA(shRNA)870-hushIFITM1(序列：5’-TGTCTACAGTGTCATTCAAT-3’(SEQ ID NO.4))和642-hushIFITM1(序列：5’-TGTGACAGTCTACCATATTA-3’(SEQ ID NO.5))。将shRNA克隆至Tet-pLKO-puro载体(购自AddGene)，随后与psPAX2和pMD2(购自AddGene)一起共转染HEK293T细胞，72小时后收集含组装慢病毒的细胞上清进行浓缩，以用于细胞感染或保存于-80℃备用。

(3)IFITM1敲低慢病毒感染细胞：

含642-shIFITM1的病毒、含870-shIFITM1的病毒与对照慢病毒sh-LacZ优化感染效率后，分别感染NP69、HEK293、HK1细胞；24小时后换液，继续培养1-2天后加入1μg/mL嘌呤霉素(puro)筛选2天，然后再用3μg/mL puro筛选2-3天，即得。得到的感染细胞保存于-80备用或接着加入2.5μg/mL多西环素(Dox)诱导48小时进行IFITM1敲低效果检测。

结果：

与对照慢病毒sh-LacZ感染的细胞的IFITM1表达量相比，含642-shIFITM1的病毒和含870-shIFITM1的病毒感染的细胞的IFITM1表达量显著降低，说明IFITM1敲低细胞系构建成功(图3)。

过表达IFITM1抑制EBV感染上皮细胞验证

(1)制备EBV-GFP：

EBV-GFP具体指携带有GFP荧光标记序列的EBV，制备方法参考Zhang H,et,al.NatMicrobiol.2018Feb；3(2):1-8。

(2)感染过表达IFITM1细胞：

将上述实施例构建的过表达IFITM1细胞(NP69、HEK293、HK1细胞)，以合适的密度接种于6cm培养皿中，孵育过夜。待细胞生长至汇合率约为50％时，更换新鲜培养基孵育1小时。将上述步骤制备得到的EBV-GFP按相应的感染复数(MOI＝10

如图4所示，在上皮细胞过表达IFITM1后，EBV-GFP的感染效率较对照组下降50％左右，说明过表达IFITM1能有效抑制EBV的感染。

敲低IFITM1抑制EBV感染上皮细胞验证

EBV-GFP的制备方法和感染细胞的方法同上述实施例。

结果如图5所示，在上皮细胞敲低IFITM1后，EBV-GFP的感染效率较对照组上升63％-119％，说明IFITM1能有效抑制EBV的感染。

IFITM1对EBV感染机制的影响

1.IFITM1对上皮细胞EBV感染受体EphA2的影响。

EphA2是一个跨膜酪氨酸激酶受体，属于酪氨酸激酶受体(receptor tyrosinekinases,RTKs)超家族成员之一。EphA2通过与EBV包膜糖蛋白(gH/gL、gB)结合并促进EBV感染，是EBV进入上皮细胞的主要宿主来源受体。IFITMs在发挥抗病毒作用时，同一家族成员在不同宿主细胞中发挥的作用可能不同，因此，IFITM1可能通过与宿主蛋白相互作用的方式共同影响病毒感染进程。

(1)细胞培养：

本实施例选择NP69、HEK293、HK1细胞作为实验对象，细胞培养方法如上述实施例所示。

(2)将上述培养的NP69、HEK293、HK1细胞分别在35cm共聚焦皿中进行培养，待生长至50-60％时，PBS洗涤一次后加4％多聚甲醛固定细胞10分钟，随后洗去固定液，加入0.2％TritonX-100透化处理10分钟。

(3)用5％山羊血清室温封闭1小时，随即加入IFITM1和EphA2的一抗孵育过夜，次日洗去一抗，加入荧光二抗(Alexa

结果：

染色后，IFITM1会显绿色荧光，EphA2会显红色荧光，两者重叠会显现为黄色(即表示IFITM1和EphA2存在共定位)。由图6A(仅展示NP69结果)可以看出，IFITM1和EphA2在细胞膜部位存在明显的共定位。

2.IFITM1与EphA2的相互作用

采用上述实施例中的细胞培养方法制备NP69、HEK293、HK1细胞，制备NP69、HEK293、HK1细胞的蛋白裂解液。

分别取1毫克上述步骤制备的NP69、HEK293、HK1铣槽蛋白裂解液，加入IFITM1，以等量的非特异免疫的同源抗体(IgG)作为对照，4℃轻柔混合过夜。按免疫共沉淀试剂盒(爱必信，abs955)说明书，加入5μL Protein A和5μL Protein G，4℃轻柔混合3小时，得到免疫复合物沉淀。

清洗免疫复合物沉淀，加入上样缓冲液，95℃加热变性5分钟，然后14000g瞬时离心1分钟，取适量(10～30μL)进行蛋白质免疫印迹检测。

结果如图6B所示(仅展示NP69结果)，蛋白质免疫印迹检测结果显示，与非特异免疫IgG对照组相比，IFITM1能特异性的沉淀EphA2，反之亦然。说明二者存在相互作用。

3.IFITM1部分逆转高表达EphA2对EBV感染的促进作用

采用市面上现有的EphA2过表达质粒(本实施例中的EphA2过表达质粒来自中山大学曾木圣课题组)，通过上述实施例中的IFITM1慢病毒构建方法构建EphA2慢病毒。

用制备得到的EphA2慢病毒分别感染NP69、HEK293、HK1细胞，检测EphA2过表达对EBV感染效率的影响。

结果如图7所示，过表达EphA2能显著提高EBV感染效率，从而反向验证了IFITM1能抑制EBV感染的结论。

综上所述，在上述实施例发现IFITM1可抑制EBV感染上皮的基础上，本实施例进一步揭示了其机制：IFITM1通过与EphA2结合，抑制或削弱了后者与EBV糖蛋白(gH/gL、gB)之间的结合，从而降低EBV感染上皮细胞的能力。

IFITM1对EBV阳性上皮型肿瘤增殖的抑制作用

(1)细胞培养：

选择C666-1细胞作为实验对象，C666-1细胞是一株EBV天然阳性的上皮型鼻咽癌细胞系。培养方法如上述实施例所示。

同时，构建IFITM1过表达C666-1细胞株(C666-1-IFITM1-OE)，构建方法如上述实施例所示。

(2)IFITM1抑制肿瘤增殖实验：

a.IFITM1抑制肿瘤增殖体外实验：

IFITM1抑制肿瘤增殖体外实验采用MTT增殖法，具体步骤为：

将处于对数成长期的对照细胞(C666-1-vector)和过表达IFITM1的C666-1-IFITM1-OE分别计数后接种到孔板中，每孔1000个细胞(100μL)。分别在第1-7天进行细胞增殖检测(加入1/10体积的MTT，4h后弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO)震摇10分钟后测吸光度值)，绘制增殖曲线。

b.IFITM1抑制肿瘤增殖体内实验：

IFITM1抑制肿瘤增殖体内实验采用裸鼠成瘤法，具体步骤为：

取对数生长期的C666-1-vector与C666-1-IFITM1-OE消化计数，用预冷PBS清洗之后，以5×10

结果：

结果如图8所示，过表达IFITM1在MTT细胞增殖实验(体外)和裸鼠成瘤实验(体外)中均可有效抑制肿瘤增殖。

IFITM1对EBV潜伏膜蛋白LMP1下调作用

(1)细胞培养：

选择C666-1细胞作为实验对象，培养方法如上述实施例所示。

同时，构建IFITM1过表达C666-1细胞株和IFITM1敲低C666-1细胞株，构建方法如上述实施例所示。

(2)采用免疫印迹法检测IFITM1过表达C666-1细胞株和IFITM1敲低C666-1细胞株中的IFITM1表达量。

免疫印迹法检测步骤如上述实施例所示。

结果如图9所示，过表达IFITM1显著降低LMP1的表达，敲低IFITM1则能显著上调LMP1的表达。

综上所述，在EBV感染鼻咽上皮细胞并发展成鼻咽癌后，IFITM1可通过降低潜伏期关键癌蛋白LMP1的表达，抑制鼻咽癌增殖，延缓肿瘤进展。

IFITM1对EBV感染鼻咽上皮细胞的预防作用

将裸鼠随机分为两组，每组6只，分别腹腔注射IFITM1重组蛋白(实验组)和生理盐水(对照组)，每隔3天注射一次。注射3次后，将过表达EphA2的HEK293、NP69、HK1细胞分别接种到两组裸鼠皮下，然后将携带有荧光标记的EBV-GFP(制备方法如上述实施例所示)接种到同一部位，接种后每12小时，用小动物成像设备拍照，记录接种部位的荧光积累量。连续观察7天后处死裸鼠，取出接种的组织，制成细胞匀浆上流式细胞进行EBV感染效率分析和对比。

结果发现，腹腔注射IFITM1重组蛋白的裸鼠的接种部位荧光积累量和感染效率明显低于注射生理盐水组。说明IFITM1能赋予细胞抵御EBV感染的能力。

IFITM1对鼻咽癌的治疗作用

将裸鼠随机分为两组，每组6只，同时皮下接种C666-1细胞。在接种后第14天，分别每隔3天腹腔注射生理盐水(对照组)和IFITM1重组蛋白(实验组)，此后每3天测量肿瘤

结果发现，与生理盐水组相比，腹腔注射IFITM1重组蛋白明显延缓了裸鼠皮下肿瘤的生长速度。

综上所述，上述实施例证实，IFITM1在EBV暴露状态下可减少EBV感染上皮细胞，因此，可基于IFITM1开发出有效预防EBV的感染的手段。而其，上述实施例还证明，IFITM1重组蛋白可降低肿瘤的生长速度，因此，还可以基于IFITM1开发针对鼻咽癌或EBV相关的其它上皮性肿瘤的新治疗手段。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 李欣

杨英桂

丁腾腾

<120> IFITMs在制备EBV上皮感染抑制剂和上皮型肿瘤防治药物中的应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 125

<212> PRT

<213> IFITM1

<400> 1

Met His Lys Glu Glu His Glu Val Ala Val Leu Gly Pro Pro Pro Ser

1 5 10 15

Thr Ile Leu Pro Arg Ser Thr Val Ile Asn Ile His Ser Glu Thr Ser

20 25 30

Val Pro Asp His Val Val Trp Ser Leu Phe Asn Thr Leu Phe Leu Asn

35 40 45

Trp Cys Cys Leu Gly Phe Ile Ala Phe Ala Tyr Ser Val Lys Ser Arg

50 55 60

Asp Arg Lys Met Val Gly Asp Val Thr Gly Ala Gln Ala Tyr Ala Ser

65 70 75 80

Thr Ala Lys Cys Leu Asn Ile Trp Ala Leu Ile Leu Gly Ile Leu Met

85 90 95

Thr Ile Gly Phe Ile Leu Leu Leu Val Phe Gly Ser Val Thr Val Tyr

100 105 110

His Ile Met Leu Gln Ile Ile Gln Glu Lys Arg Gly Tyr

115 120 125

<210> 2

<211> 132

<212> PRT

<213> IFITM2

<400> 2

Met Asn His Ile Val Gln Thr Phe Ser Pro Val Asn Ser Gly Gln Pro

1 5 10 15

Pro Asn Tyr Glu Met Leu Lys Glu Glu Gln Glu Val Ala Met Leu Gly

20 25 30

Val Pro His Asn Pro Ala Pro Pro Met Ser Thr Val Ile His Ile Arg

35 40 45

Ser Glu Thr Ser Val Pro Asp His Val Val Trp Ser Leu Phe Asn Thr

50 55 60

Leu Phe Met Asn Thr Cys Cys Leu Gly Phe Ile Ala Phe Ala Tyr Ser

65 70 75 80

Val Lys Ser Arg Asp Arg Lys Met Val Gly Asp Val Thr Gly Ala Gln

85 90 95

Ala Tyr Ala Ser Thr Ala Lys Cys Leu Asn Ile Trp Ala Leu Ile Leu

100 105 110

Gly Ile Phe Met Thr Ile Leu Leu Ile Ile Ile Pro Val Leu Val Val

115 120 125

Gln Ala Gln Arg

130

<210> 3

<211> 133

<212> PRT

<213> IFITM3

<400> 3

Met Asn His Thr Val Gln Thr Phe Phe Ser Pro Val Asn Ser Gly Gln

1 5 10 15

Pro Pro Asn Tyr Glu Met Leu Lys Glu Glu His Glu Val Ala Val Leu

20 25 30

Gly Ala Pro His Asn Pro Ala Pro Pro Thr Ser Thr Val Ile His Ile

35 40 45

Arg Ser Glu Thr Ser Val Pro Asp His Val Val Trp Ser Leu Phe Asn

50 55 60

Thr Leu Phe Met Asn Pro Cys Cys Leu Gly Phe Ile Ala Phe Ala Tyr

65 70 75 80

Ser Val Lys Ser Arg Asp Arg Lys Met Val Gly Asp Val Thr Gly Ala

85 90 95

Gln Ala Tyr Ala Ser Thr Ala Lys Cys Leu Asn Ile Trp Ala Leu Ile

100 105 110

Leu Gly Ile Leu Met Thr Ile Leu Leu Ile Val Ile Pro Val Leu Ile

115 120 125

Phe Gln Ala Tyr Gly

130

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgtctacagt gtcattcaat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtgacagtc taccatatta 20