同时检测小麦抗赤霉病基因与抗白粉病基因的多重PCR标记引物组及其应用

技术领域

本申请涉及分子标记领域，特别是一种同时检测小麦抗赤霉病基因Fhb1与抗白粉病基因Pm21的多重PCR标记及应用。

背景技术

小麦是最重要的粮食作物之一，其生产安全对社会经济稳定具有重要意义。小麦生产易受多种病害影响，由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的赤霉病与禾布氏白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)引起的白粉病严重影响小麦的产量及品质(Parry D W,Jenkinson P,Mcleod L.Fusarium Ear Blight(Scab)in Small GrainCereals-a Review.Plant Pathology,1995,44:207-238；Zhao Z,Sun H,Song W,Lu M,Huang J,Wu L,Wang X,Li H.Genetic analysis and detection of the geneMlLX99onchromosome 2BL conferring resistance to powdery mildew in the wheat cultivarLiangxing 99.Theoretical&Applied Genetics,2013,126:3081-3089.)。在我国，小麦赤霉病过去主要发生于长江中下游麦区、华南冬麦区和东北春麦区，近年来扩展至黄淮麦区、北方麦区、西南麦区和西北麦区，而小麦白粉病在我国的大多数冬小麦产区均有发生。

抗赤霉病基因Fhb1是目前公认的抗性稳定且效应最大的位点，在小麦抗赤霉病育种中应用最为广泛，也最为成功(Xie GQ,Zhang MC,Chakraborty S,Liu CJ.The effectof 3BS locus of Sumai 3on Fusarium head blight resistance in Australianwheats.Animal Production Science.2007,47:603-607)，目前其基因克隆工作已经完成(Li G,Zhou J,Jia H,Gao Z,Fan M,Luo Y,Zhao P,Xue S,Li N,Yuan Y,Ma S,Kong Z,JiaL,An X,Jiang G,Liu W,Cao W,Zhang R,Fan J,Xu X,Liu Y,Kong Q,Zheng S,Wang Y,QinB,Cao S,Ding Y,Shi J,Yan H,Wang X,Ran C,Ma Z.Mutation of a Histidine-RichCalcium-Binding-Protein Gene in Wheat Confers Resistance to Fusarium HeadBlight.Nature Genetics,2019,51:1106-1112；Su Z,Bernardo A,Tian B,Chen H,WangS,Ma H,Cai S,Liu D,Zhang D,Li T,Trick H,St.Amand P,Yu J,Zhang Z,Bai G.ADeletion Mutation in Tahrc Confers Fhb1 Resistance to Fusarium Head Blight inWheat.Nature Genetics,2019,51:1099-1105)，诊断标记得到广泛应用(朱展望,徐登安,程顺和,高春保,夏先春,郝元峰,何中虎.中国小麦品种抗赤霉病基因fhb1的鉴定与溯源.作物学报,2018,44:473-482)。南京农业大学细胞遗传研究所通过染色体工程技术创制了高抗白粉病的小麦-簇毛麦T6VS/6AL整臂易位系，该易位系携带来源于簇毛麦的抗白粉病基因被命名为Pm21，它是目前国际上公认的抗性最强、抗谱最广的抗白粉病基因(Cao A,Xing L,Wang X,Yang X,Wang W,Sun Y,Qian C,Ni J,Chen Y,Liu D,Wang X,ChenP.Serine/threonine kinase gene Stpk-V,a key member of powdery mildewresistance gene Pm21,confers powdery mildew resistance in wheat.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,108:7727-7732；Chen PD,Qi LL,Zhou B,Zhang SZ,Liu DJ.Development and molecularcytogenetic analysis of wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation linesspecifying resistance to powdery mildew.Theoretical&Applied Genetics,1995,91:1125-1128)，其克隆工作也已完(He H,Zhu S,Zhao R,Jiang Z,Ji Y,Ji J,Qiu D,Li H,Bie T.Pm21,Encoding a Typical Cc-Nbs-Lrr Protein,Confers Broad-SpectrumResistance to Wheat Powdery Mildew Disease.Molecular Plant,2018,11:879-882；Xing L,Hu P,Liu J,Witek K,Zhou S,Xu J,Zhou W,Gao L,Huang Z,Rui-qi Z,Wang X,Chen P,Wang H,Jones J,Havrankova M,Vrána J,

多重PCR能在同一反应体系中鉴定多个基因位点，大大节约时间和试剂，具有高效、经济的特点(许立奎,潘彬荣,岳高红,梅喜雪,刘永安,张宗宸,周志辉.抗白粉病糯性小麦的多重PCR分子鉴定技术[J].核农学报,2014,28:1203-1207)。但目前在小麦中成功应用的多重PCR引物较少，这是因为多重PCR的引物不是单个PCR引物的简单混合，引物组合的设计时需要考虑：(1)避免引物间形成二聚体，影响目的片段扩增与检测；(2)各引物与其他扩增片段和模板不存在较大的互补性，扩增片段间同源性不能太高；(3)引物的退火温度尽可能接近，长度差异不能太大；(4)扩增片段大小存在一定差异，以便电泳检测等问题，而同时满足这些要求的多重PCR引物较难获得,进而影响了多重PCR引物的应用。目前尚未见同时鉴定Fhb1与Pm21两个基因的多重PCR标记报道。

发明内容

针对上述问题，本申请提供一种可以同时检测小麦抗赤霉病基因Fhb1与抗白粉病基因Pm21的多重PCR标记，以提高小麦育种选择效率。

具体而言，本申请是通过如下技术方案实现的：

首先，本申请提供了一种可以同时检测小麦抗赤霉病基因Fhb1与抗白粉病基因Pm21的多重PCR标记引物组，该引物组包括4组引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的前引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的前引物F2、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的后引物R1、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的后引物R2。

其次，本申请还提供了上述多重PCR标记引物组在同时检测小麦抗赤霉病基因Fhb1与抗白粉病基因Pm21中的应用。其具体步骤如下：以小麦基因组DNA为模板，以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的引物组进行PCR扩增后电泳，若电泳产物出现大小为454bp的条带，则判定该小麦携带小麦抗赤霉病基因Fhb1；若出现大小为267bp的条带，则判定该小麦携带抗白粉病基因Pm21；同时若出现大小为454bp和267bp两个条带，则判定该小麦同时携带小麦抗赤霉病基因Fhb1与抗白粉病基因Pm21，其中，454bp条带对应基因Fhb1，267bp条带对应基因Pm21。

进一步而言，上述PCR扩增体系(10μL)：2×Rapid Taq Master Mix 5μl，浓度为10μM的引物各0.25μl，浓度为50ngμL

PCR扩增程序：第一步：94℃，3min；第二步：94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 30s延伸，35个循环；第三步：72℃延伸5min；扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

小麦抗病育种中，在早期世代即可以通过本分子标记的检测结果对小麦的抗性进行选择，加快育种进程。本发明引物组首次实现对小麦抗赤霉病基因Fhb1与抗白粉病基因Pm21的多重PCR标记的同时检测，提高分子标记辅助选择效率。此外，本发明中的分子标记引物对通过人工比对和校正而获得，扩增效率较高，扩增结果特异性好，进一步提高分子标记辅助选择的准确性。

附图说明

图1为实施例1三组多重引物检测电泳图。

图2为实施例1中MFP引物组检测比较电泳图。

图3为实施例2中92份高代品系材料检测电泳图。

具体实施方式

以下实施例中涉及的扬麦18、扬麦158和宁麦9号由江苏省农业科学院麦类作物研究室保存并提供，92份高代品系来源于江苏省农业科学院麦类作物研究室田间产量鉴定圃(F7世代)。

实施例1

1、材料方法

试验材料包含扬麦18(同时携带Fhb1和Pm21)、扬麦158(不携带Fhb1和Pm21)、宁麦9号(仅携带Fhb1)及92份高代品系(F

抗赤霉病基因Fhb1的诊断标记JAASM395与抗白粉病基因Pm21的诊断标记MBH1分别根据吴磊等(参见中国专利ZL201811515195.8)与Bie等(Bie T,Zhao R,Zhu S,Chen S,Cen B,Zhang B,Gao D,Jiang Z,Chen T,Wang L,Wu R,He H.Development andcharacterization of marker MBH1 simultaneously tagging genes Pm21 and PmVconferring resistance to powdery mildew in wheat.Molecular Breeding,2015,35：189)的报道进行合成。利用Primer 6.0引物设计软件进行多重PCR引物的设计。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

将所有试验材料种子室温萌发7d左右，剪取幼嫩叶片，采用CTAB法提取基因组DNA(该提取方法参见文献“Porebski S,Bailey L,Baum B.Modification of Ctab DNAExtraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and PolyphenolComponents.Plant Molecular Biology Reporter,1997,15:8-15”)。

电泳检测标记的PCR扩增体系(10μL)：2×Rapid Taq Master Mix 5μl(P222-AA，Vazyme)，浓度为10μM的前后引物各0.25μl，浓度为50ngμL

PCR扩增程序：第一步：94℃，3min；第二步：94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 30s延伸，35个循环；第三步：72℃延伸5min。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

2、多重PCR标记的开发与验证

利用现有软件设计引物时，通常是针对单个标记进行标记开发，然后将引物进行混合，但该方法易出现引物发生结合而无法有效扩增的问题。因此本实施例在引物设计过程中，在软件提供的结果基础上，人工进一步对各条引物进行调整和评估，避免不同引物间的特异性结合，增加目的片段扩增效率。

依照以上设计思路设计引物，其中3组多重引物(P1/P2/P3)如下表1所示，每组均包含2条前引物(F1、F2)与2条后引物(R1、R2)：

表1三组多重引物

表1引物扩增结果如图1所示。图1中，M为DL2000 marker，1-9为随机选择的高代品系，10为宁麦9号，11为扬麦158，12为扬麦18。扬麦158不携带Fhb1和Pm21，应当无法扩增出两个目的条带，引物组P1与P3均存在弱阳性条带，不利于基因型分析。而引物组P2的3个对照符合预期带型，申请人将其自命名为MFP，并进一步与Fhb1的诊断标记JAASM395及Pm21的诊断标记MBH1进行电泳检测比较。

比较检测结果如图2所示，A为Fhb1诊断标记JAASM395的扩增(SEQ IDNO.13,引物F：GTCTCCGTTCAATTCGGTGAGT；SEQ IDNO.14引物R：GACAATGTGAAGGCGTTGTCTA)，B为Pm21诊断标记MBH1的扩增(SEQ IDNO.15引物F：GCCATTATAGTCAAGAGTGCACTAGCTGT；SEQ IDNO.16引物R：AGCTCCTCTCGTTCTCCAATGCT)，C为多重PCR标记MFP的扩增，1为扬麦18,2为扬麦158,3为宁麦9号，M为DL2000 marker，4～18为随机挑选的高代品系。454bp条带对应Fhb1，267bp条带对应Pm21，扩增结果完全一致(表2)。

表2

实施例2多重PCR标记的应用

对92份高代品系材料进行快速鉴定，检测结果如图3及表3所示。

表3

由表3和图3可见，92份高代品系材料中，携带Fbh1的材料有24份，携带Pm21的有9份，同时携带2个位点的材料有4份。这些鉴定结果充分说明本申请提供的多重PCR标记引物组可以有效的同时检测小麦抗赤霉病基因Fhb1与抗白粉病基因Pm21，为小麦抗病育种提供支持。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 同时检测小麦抗赤霉病基因与抗白粉病基因的多重PCR标记引物组及其应用

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