基于性染色体鉴别河南斗鸡品种的单倍体标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，涉及一种基于性染色体鉴别河南斗鸡品种的单倍体标记及其应用。

背景技术

河南斗鸡又名中原斗鸡，属玩赏型品种，是中国古老鸡种之一。由于其具有较强的斗性和抗击打能力，是我国极其宝贵的家禽遗传资源之一。在市场需求的条件下，斗鸡潜在的商品价值被开发利用，越来越受到人们重视。除去其观赏性和娱乐性之外，其肉用性能突出，生长快，肉质鲜美，且具有食补作用，利用价值极大。不论从娱乐观赏角度还是食用角度分析，都需要对河南斗鸡品种进行鉴定和分类。

常规方法，都是以形态学标记分析手段进行动物品种分类和真伪鉴定。虽然形态学标记分析经济、简便，但是形态学特征容易受到环境因素的影响，具有表型可塑性和遗传可变性，容易导致不正确的鉴别结果出现。随着分子生物学的不断深入发展，采用基因手段深入研究动物品种的群体特性已经成为一种趋势。目前单个SNP用于鉴别动物群体的方法已经存在，但是在国内家禽配套系越来越丰富，目标定位越来越精细的行业背景下，无论是纯系品种的鉴别还是配套商品系鉴别，单个的SNP已经不能满足基本的群体需求。而鸡的性染色体属于雄性纯合系统(雄性ZZ，雌性ZW)，W染色体为Z染色体高度浓缩后的拷贝，一般认为W染色体上存留下来的基因对机体的生长发育发挥重要的作用。因此，以W染色体为目标，筛选出河南斗鸡特异的单核苷酸多态性(SNP)变异位点，并组建成单倍型，用于河南斗鸡的品种鉴别对于解决现存的技术问题具有重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于性染色体鉴别河南斗鸡品种的单倍体标记及其应用，通过不同鸡品种间的基因序列对比，筛选出W染色体上特异性SNP位点，并以该位点为靶向位点设计探针，再通过重新测序验证这些SNP位点，以在不同鸡品种中鉴别出河南斗鸡。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一种基于性染色体鉴别河南斗鸡品种的单倍型标记，所述单倍型标记由6个SNP位点组成，其中，

SNP1位点所在基因组位置为235114bp，该处存在G/A多态性；

SNP2位点所在基因组位置为853983bp，该处存在C/T多态性；

SNP3位点所在基因组位置为1656289bp，该处存在A/G多态性；

SNP4位点所在基因组位置为3099985bp，该处存在G/A多态性；

SNP5位点所在基因组位置为3099987bp，该处存在G/A多态性；

SNP6位点所在基因组位置为3109021bp，该处存在A/G多态性；

所述基因组的核苷酸序列为Genbank上的登录号NC_006126.4(登陆网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_006126.4)。

优选的是，当SNP1-SNP6 6个位点组成单倍型为GACTAGGAGAAG时，对应鸡品种为河南斗鸡。

本发明还提供一种基于性染色体鉴别河南斗鸡品种的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所示，所述探针是以所述的6个SNP位点为靶向位点设计。

本发明还提供一种基于性染色体鉴别河南斗鸡品种用的检测试剂盒，包括所述的探针。

本发明还提供一种基于性染色体鉴别河南斗鸡品种用的检测方法，采用所述的探针，或所述的检测试剂盒进行检测。

本发明还提供一种所述的单倍型标记或所述的检测试剂盒在河南斗鸡品种鉴别中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过不同鸡品种序列比对，筛选出6个河南斗鸡群体中特有的变异位点SNP，将其按在W染色体上所处位置顺序排列，组建成单倍型GACTAAGAGAAG，用于鉴别河南斗鸡血统。上述6个多态性位点的突变基因组合构成的单倍型组合可以作为鉴别河南斗鸡的单倍体标记，为河南斗鸡品种的准确鉴别提供了一个新的分子标记和鉴定工具。此外，用单倍型标记进行品种鉴别的容错率高于单个SNP，即如果选择到的单个样本的特定SNP发生变异时，单个的SNP鉴定结果将直接发生是或否的鉴别转变，而单倍型判别时，如本发明对于河南斗鸡的特异性单倍型判别时，只是由概率100％减少为83.4％，基本不影响判定的结果。相对的，在其他非特异群体中，具有高特异性，即1个SNP的改变，鉴别概率是从0升高至16.6％，基本不影响判别结果。因此，本发明公开的单倍型标记具有高特异性和高容错率，利于满足育种或者观赏娱乐用河南斗鸡品种的准确鉴别。

具体实施方式

现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

以下是本发明筛选的河南斗鸡品种的6个特异性SNP位点以及所设计的特异性探针(表1)。

表1河南斗鸡品种的特异性SNP位点

本发明的技术方案是：通过已知的鸡SNP数据库(NCBI和前期研究成果)利用液相芯片捕获测序技术寻找存在于不同鸡品种上的SNP位点并对这些位点进行特异性筛选，找到河南斗鸡品种中特异性存在的SNP位点，根据筛选结果构建单一品种的特异性单倍型以得到鉴定河南斗鸡品种特异性的单倍型标记。

实施例1基于性染色体鉴别河南斗鸡品种的单倍型标记的筛选

1、实验材料

选择10个各具特色的地方鸡品种河南斗鸡、边鸡、茶花鸡、藏鸡、东乡绿壳蛋鸡、大围山微型鸡、寿光鸡、丝羽乌骨鸡、文昌鸡和瓦灰鸡共100个个体母鸡血样，这些鸡品种均来自江苏省家禽科学研究所国家地方种质资源基因库。

通过比对NCBI上的W染色体序列信息，共设计设计特异性探针10950条，覆盖W染色体95％区域。探针为RNA探针，亲和能力比DNA探针更强，根据碱基互补配对原则，对目标基因组DNA设计与之互补配对的寡核苷酸探针，在设计时采用叠瓦式设计，采用高通量电化学合成方式合成探针模板，合成错误率低于1/200。

2、基因文库构建

采用动物DNA提取试剂盒(天根生物科技(北京)有限公司)提取每个鸡品种样品血样DNA，送华普奥科生物科技(北京)有限公司液相芯片捕获测序技术进行全基因组测序。针对鸡W染色体设计目标区域和带接头引物(接头用试剂盒：华大测序平台的双端index接头系统；扩增试剂盒Ada&Index Kit(Dual for BGI)，货号：TIND，试剂组分：Adapter(15μM，Dual for BGI)，Dual 1.0Index(20μM，for BGI)-20℃，Dual 2.0Index(20μM，for BGI)。

扩增接头引物如表2：

表2

连接体系如表3：

表3

使用移液器吸打混匀(避免剧烈震荡混匀)，短暂离心；运行PCR仪程序(关闭热盖)，设置PCR仪参数如下：关闭热盖；20℃，15min；4℃，∞。

3、利用pre-PCR构建DNA文库

1)从-20℃冰箱中取出PCR Master Mix、index扩增引物，置于冰盒上溶解，混匀后置于冰上待用；

2)根据所选择的index类型的不同，按照对应体系在冰盒上进行配制PCR反应体系(如表4)，记录好所使用的index号：引物浓度20μM。

表4

该扩增体系中，所用引物为任意随机引物，将随机引物按照上述的华大测序平台的双端index接头系统连接接头，目的是给每个样本加一段特征性序列，以便于后续试验数据的分析。

3)涡旋震荡混匀或吸打混匀，然后短暂离心；

4)将样品置于PCR仪上，启动PCR程序，如下：热盖温度105℃；98℃ 2min；98℃20s，60℃ 30s，72℃ 30s，4个循环；72℃，1min；4℃，保持。延伸过程设计4个循环，是因为反复试验发现太多会导致重复量上升，有效的数据量的比例减少。

4、文库DNA与探针杂交以及目标区域捕获

(1)文库DNA与探针杂交

将上述3中构建的DNA文库与如表1中设计的特异性检测河南斗鸡的6条探针进行杂交。杂交体系如下表5所示：

表5杂交反应体系

具体操作步骤如下：

将加好的反应体系轻轻吸打混匀，并进行短暂离心。

设置PCR仪参数如下：热盖温度85℃；80℃ 5min；50℃孵育过夜。

(2)磁珠捕获

将捕获磁珠(Cap beads)加入PCR管中，过程中保持PCR管在PCR仪上。探针与磁珠结合室温孵育30min，使用混匀仪避免磁珠沉降，转数不宜过高，建议不超过10转/min。具体操作步骤如下：

①保持杂交产物在PCR仪上，将步骤Step 2中第6步重悬后的180μL Cap beads加入到杂交产物中，用移液器吸打混匀，置于旋转混匀仪上室温结合30min；

②将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清液；

③加入150μL 50℃预热的TargetSeq

④短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清。

⑤重复步骤3-4两次，共清洗磁珠3次；

⑥保持样品在磁力架上，向PCR管内加入150μL 80％乙醇，静置30s后彻底移除乙醇溶液(可用10μL移液器移除残留)，室温晾干；

⑦向PCR管加入24μL Nuclease-free Water，从磁力架上取下PCR管，用移液器轻轻吸打重悬混匀磁珠待用。

5、捕获后post-PCR扩增

1)从-20℃冰箱中取出Post PCR Master Mix、Post PCR Primer，放置于冰盒上融化，融化后混匀置于冰上或4℃待用。引物如表6：

表6

试剂盒选用的是华大测序平台的TargetSeq

2)捕获后需要对DNA文库进行PCR扩增，根据下表配制反应体系如表7：

表7

3)将移液器调至40μL，轻轻吸打混匀6次，然后立即置于PCR仪上。

4)运行PCR仪程序：热盖温度105℃；95℃ 1min，98℃ 20s，60℃ 30s，28个循环；72℃ 30s；72℃ 5min。

6、数据统计

对上述5的文库进行测序后，共筛选出河南斗鸡W染色体上SNP位点72个，特异性在80％以上。通过优化组合，最后筛选出特异性的6个SNP位点构建品种特异性单倍型。之后利用液相芯片捕获测序技术在不同鸡品种中进行群体验证。

实施例2单倍型标记的应用

选择30只河南斗鸡母鸡、30只寿光鸡母鸡和30只藏鸡母鸡，按照实施例1中提取DNA的方法，提取各样本的血样DNA，用相应的探针信息再次利用实施例1中液相芯片捕获测序技术进行品种检测。

结果如表8所示，用单倍型鉴别出的鸡品种都是河南斗鸡，说明该单倍型判别河南斗鸡品种的正确率为100％。

表8

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 江苏省家禽科学研究所

<120> 基于性染色体鉴别河南斗鸡品种的单倍体标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccatcttgt acccctttac tctctaagac tgagccccag gggactcccc ctactcatct 60

tctgaacaat tcaaagtccg ccctccggaa gtccaaggta 100

<210> 2

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatgggtgcg tggaccaccg aagacaggcc aggacacgga cccggcaaca cagccgttac 60

tgcccacacc gagaaatttg gttctatctc tgctaatgtg 100

<210> 3

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggaacctgg gaagttattc ctggcaaatc cactggttaa attgcagcta ggaaagcagg 60

ataaagaggt ttattttctg gtgggcacgg gtgcctctta 100

<210> 4

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggggttatt gtggccaaag tgcaggaccc ggcgtttggt cttgttgaat ctcatcccat 60

tggcttcagc ccagctattc agcctatcca gatccctctg 100

<210> 5

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggggttatt gtggccaaag tgcaggaccc ggcgtttggt cttgttgaat ctcatcccat 60

tggcttcagc ccagctattc agcctatcca gatccctctg 100

<210> 6

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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agctcagcaa gaagagcccc gaggacgccg aggccatctg 100