用于快速辅助鉴别原发性多发肺癌与肺内转移癌的标记物组合物及其应用

技术领域

本发明属于恶性肿瘤检测领域。具体而言，涉及一种用于鉴别原发性多发肺癌与肺内转移癌的标记物组合物。

背景技术

肺癌是一种复杂的异质性疾病，在生化水平(基因、蛋白质和代谢物)上、组织水平、生物体和人群水平、基因组和表型水平存在明显差异。流行病学调查显示，肺癌在各种肿瘤中的发生率以及死亡率均占据首位。原发性多发肺癌(multiple primary lungcancer,MPLC)是指在同一患者肺内同时或先后发生2个或2个以上原发性恶性肿瘤。一项大型队列研究表明多达15％的肺癌患者表现出两个或两个以上水平的病变，随着疾病谱变化和检查技术进步，临床上对肺部多发结节、肿物进行检查时，MPLC的检出率有逐渐增多的趋势，患病率也越来越高。MPLC与其他肺部癌变，例如肺内转移癌(IPM)相比，在治疗及预后上有明显差异，多建议尽早手术，MPLC大多为早期癌，术后5年生存率较高，而IPM手术机会较少，远期生存率较低，因此需术前或治疗过程中对MPLC做出准确判断(参见，孙岑玲等，“多原发性肺癌诊疗研究进展”，中国胸心血管外科临床杂志，网络首发时间：2021年03月12日)。

但是，当前的临床或放射学特征很难鉴别MPLC和IPM。Martini和Melamed在1975年提出了诊断MPLC的原始标准，后来被证明不足以分期多灶性病变，因为最新的TNM分期系统已给出癌症分期的详细信息。但是，此分期系统几乎没有针对IPM，这可能会导致对MPLC的患者进行不正确的评估和治疗。尽管组织病理学差异是鉴别MPLC和IPM的可靠指标，但是这种诊断方法容易较多掺杂诊断者的主管因素，对诊断者的经验有较高要求，且临床上经常会遇到仅从组织病理学角度难以判断的样品，因而难以快速、准确、简便且大规模地进行检测。

鉴于存在上述临床上未满足的需求，此前至本医疗科技(上海)有限公司开发了一种基于综合分子算法的肺癌多病灶诊断系统(参见CN111304330A)。尽管该方法评估结果直观准确，但是由于该方法采用了能够对多种癌症相关基因普遍进行检测的大规模新一代测序(NGS)技术，价格十分昂贵，普通工薪阶层的患者难以承受，使得这种方法很难在临床上大规模推广。

本发明结合临床实际需求，在上述基于综合分子算法的肺癌多病灶诊断系统的基础上进行进一步研究和优化，筛选出了一组在MPLC、IPM和中国肺腺癌(LUAD)人群中突变频率较高的基因，并将其作为标记物组合物。该标记物组合物能够快速辅助鉴别原发性多发肺癌与肺内转移癌，极大地降低了临床检测成本，并提高了检测效率。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于快速辅助鉴别原发性多发肺癌(MPLC)与肺内转移癌(IPM)的标记物组合物及其应用。

具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：

在第一个方面中，本发明提供了一种用于快速辅助鉴别原发性多发肺癌与肺内转移癌的标记物组合物，所述标记物为EGFR、KRAS、TP53和RBM10基因突变的组合，所述标记物用于通过新一代测序(NGS)方法对待测对象的样品进行检测，所述样品为肺癌的各个病灶。

在一个优选实施方式中，所述肺癌的各个病灶选自癌组织活检样品或癌组织手术切除样品。

在一个更优选实施方式中，所述待测对象为华裔非混血人种。

在第二个方面中，本发明提供了一种用于快速辅助鉴别原发性多发肺癌与肺内转移癌的试剂盒，所述试剂盒包含上述第一个方面中所述的标记物组合物，以及检测试剂和说明书。

在第三个方面中，所述待测对象的原发性多发肺癌与肺内转移癌的快速辅助鉴别方法包括以下步骤：

(1)提供来源于待测对象的样品，对样品中的标记物进行检测，所述标记物为EGFR、KRAS、TP53和RBM10基因突变的组合，所述样品为肺癌的各个病灶；

(2)如果所述肺癌的各个病灶存在一种或多种EGFR、KRAS、TP53和RBM10基因突变，但是所述肺癌的各个病灶不存在EGFR、KRAS、TP53和RBM10基因的共突变，则确定所述待测对象患有原发性多发肺癌的可能性较高；和

(3)如果所述肺癌的各个病灶存在一种或多种EGFR、KRAS、TP53和RBM10基因突变，且所述肺癌的各个病灶存在两个或两个以上EGFR、KRAS、TP53和RBM10基因的共突变，则确定所述待测对象患有肺内转移癌的可能性较高，

其中，在步骤(1)中，所述标记物用于通过通过新一代测序(NGS)方法对样品进行检测。

在一个优选实施方式中，在步骤(1)中，所述肺癌的各个病灶选自癌组织活检样品或癌组织手术切除样品。

在一个更优选实施方式中，在步骤(1)中，所述待测对象为华裔非混血人种。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

本发明所提供的用于快速辅助鉴别原发性多发肺癌与肺内转移癌的标记物组合物及其试剂盒与大规模NGS测序相比操作简单、检测成本低廉，可以快速、准确地对肺癌多病灶人群进行合理的辅助鉴别，使得部分患者经此鉴别并结合组织病理学诊断即可确诊，从而可以省去进行昂贵且繁琐的大规模NGS测序步骤。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：采用基于综合分子算法的肺癌多病灶诊断系统，使用包含450多种癌症相关基因的NSG分析对多种肺癌进行分类的流程示意图。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例：

(1)基因组检测分析：

所有切除的标本均经过福尔马林固定和石蜡包埋，样品在中山大学孙逸仙纪念医院实验室中进行了测序。NGS使用Cancer Sequencing YS第30组进行，这是针对450多种癌症相关基因的定制组。对于NGS，提取了50-250ng DNA。在Illumina测序平台上构建和测序文库，平均覆盖率至少为700×。检测到所有单核苷酸变异(SNV)，插入/缺失，拷贝数变异和基因重排/融合。

(2)分子演算：

分子算法考虑了等位基因变异分数(VAF)≥1％的体细胞变异。成对的病变，驱动基因和致癌突变热点的同时发生之间共享的突变被考虑到了这个管道中(参见图1)。

如果病变包括以下患者，则将其分类为MPLC：在配对病变之间共有2个以上的突变。对于配对肿瘤之间仅有一个共同像差的患者，对共有突变进行了回顾。

如果共享的像差是包含在58个驱动基因列表中的基因(参见表1)，则检查不同人群中特定突变的普遍性，将突变频率低于10％的热点视为相应人群IPM。对于鉴定出具有一个热点突变(突变频率≥10％)的患者，应进一步考虑突变的VAF，以确定病例是否为MPLC或如管线所示尚未确定。

表1：40例多发同时性肺腺癌的临床及组织学特征分析

为了计算偶然发生的几率，使用包含2,471例中国肺腺癌(LUAD)的数据库对单个突变的患病率进行了计数。手动计算2个配对的肿瘤共有一个共同突变的概率，计算公式如下：我们用i表示人群中特定突变(例如EGFR L858R)的患病率，用P表示偶然发生的几率在两个不相关的肿瘤中突变的概率为P＝i2。对于具有两个以上病变的患者，以成对方式比较肿瘤：如果患者的所有肿瘤对均为MPLC，则将患者分类为MPLC。如果该患者的所有肿瘤对均是IPM，则将该患者分类为IPM；如果存在未确定的肿瘤对，则将患者分类为未确定的病例。

对于克隆性测试，根据先前的报告计算了克隆相关性的概率。总共在所有40例患者中检测到751个遗传改变(530个独特突变)，在所有84个肿瘤中至少发现了一个突变。在这些改变中，有491个是替换/插入，74个是缺失，142个是基因扩增，44个是融合/重排。比较了MPLC和IPM之间驱动基因的频率的差异(参见表2)。

表2：比较MPLC、IPM和中国LUAD人群驱动基因突变频率

本研究是关于使用宽版NGS鉴别中国人群MPLC的最大研究，在这项研究中首次鉴别得到了一组在MPLC、IPM和中国肺腺癌(LUAD)人群中突变频率较高的基因，并将其作为标记物组合物。

在此基础上，本发明人发明了一种应用于对待测对象的原发性多发肺癌与肺内转移癌进行快速辅助鉴别的由EGFR、KRAS、TP53和RBM10基因突变组成的生物标记物组合物及其试剂盒。发明人相信，本发明将为诊断鉴别多种肺癌提供更为可靠的临床依据，这对于多原发性肺癌的诊断和指导治疗具有十分重要的意义。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。