公开/公告号CN113063645A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-07-02
原文格式PDF
申请/专利权人 新疆农业科学院核技术生物技术研究所;
申请/专利号CN202110321935.X
申请日2021-03-25
分类号G01N1/30(20060101);G01N1/36(20060101);G01N1/34(20060101);G01N1/44(20060101);G01N1/28(20060101);G01N23/04(20180101);G01N23/20(20180101);G01N23/2202(20180101);G01N23/2251(20180101);G01N23/2206(20180101);
代理机构11491 北京国坤专利代理事务所(普通合伙);
代理人张国栋
地址 830091 新疆维吾尔自治区沙依巴克区南昌路403号
入库时间 2023-06-19 11:42:32
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法。
背景技术
棉花(Gossypium hirsutum)是我国乃至全世界最重要的经济作物之一，是首要的纤维作物和重要的油料作物，棉花纤维是目前为止已知的纯度最高的天然纤维之一，在纺织业中具有非常重要的经济地位，棉花纤维是由胚珠表皮细胞发育而形成的单细胞结构，起始分化后迅速伸长，一般不再分裂，纤维细胞最终纤维长度可达其直径的数千倍，是研究细胞伸长、分化和细胞壁合成等重要生物学现象的理想系统。
苯丙烷途径是棉花纤维发育中的第二大代谢途径，对植物有非常重要的生理意义，肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素代谢途径中第一个被研究的酶，其催化木质素单体合成的最后一步反应，将三种肉桂醛还原生成相应的三种肉桂醇，CAD在调控木质素的含量和组分中发挥着重要的作用，目前已经从许多植物中克隆了CAD基因并通过转基因的方法对基因的功能进行了研究，调控该基因的表达对植物的细胞壁沉积具有很大的影响，因此，筛选对基因后代材料的鉴定筛选标准具有重要意义，因此，我们通过透射电镜方法筛选转GhCAD6基因的转基因后代的棉花纤维细胞壁的沉积来确定品质优良的棉花材料，故而提出了一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，具备确定品质优良的棉花材料等优点，解决了CAD基因的表达对植物的细胞壁沉积具有很大影响的问题。
(二)技术方案
为实现上述确定品质优良的棉花材料的目的，本发明提供如下技术方案：一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，包括以下步骤：
1)固定：取棉纤维样品投到装有4％戊二醛(0.1mol/L的磷酸缓冲液， pH7.2)的医用小瓶中先固定，后放到4℃冰箱保存至全部样品取完；
2)预包埋：将棉纤维进行预包埋，即将棉纤维从4％戊二醛取出在滤纸上拉直，用刀片切取中部长约0.3cm，用镊子放到包埋板中摆直，用3.5％(琼脂粉和0.1mol/L磷酸缓冲液配置)琼脂在包埋板中进行预包埋，凝固后切除多余的部分，只剩下包埋的纤维，再投到医用小瓶中；
3)冲洗：用0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗样品3h；
4)脱水：分别经浓度为30、50、70、80、90、95、100％酒精逐级脱水，每级脱水20min，其中100％需脱水1h；
5)置换：再用1:1(酒精/丙酮)浸1h，1:5(酒精/丙酮)浸80min，纯丙酮浸1h，1:1(环氧树脂/丙酮)浸2h，3:1(环氧树脂/丙酮)浸3h， 5:1(环氧树脂/丙酮)浸4d，纯环氧树脂(Epon812)浸1d进行置换；
6)包埋：用纯环氧树脂在包埋板中包埋材料，放到烘箱里分别在37、45、 60℃下各放置1d；
7)切片：用德国LEICA ULTRACUTR切片机切片；
8)染色及观察拍照：2％醋酸双氧铀和6％柠檬酸铅染色各20min，双蒸水冲洗晾干后即可观察，用日本日立H-600透射电镜观察并拍照。
优选的，分别收集不同发育天数的(10天，15天，20天，25天，30天， 40天)的棉花纤维进行观察。
优选的，分别将转基因株系和对照材料的成熟棉花纤维放入95％乙醇:乙醚(1:1)中脱脂10min后,再将脱脂后的毛样品置于100％乙醇中清洗2min, 取出用滤纸吸干或自然干燥，用IB-5型离子溅射仪喷镀铂金膜,厚度10nm，在SUPRA 55VP型扫描电镜下观察棉花纤维形态并拍照。
优选的，透射电镜和扫描电镜检测转外源GhCAD6基因检测改良棉纤维发育过程中的细胞壁及纤维表皮形态特征，从而得到纤维品质较好的转基因后代材料，可溶性糖含量显著降低的棉花转基因稳定遗传后代材料。
优选的，所述转外源GhCAD6基因需满足透射电子显微镜观察转外源 GhCAD6基因纤维细胞壁变薄，并且紧实度增加。
优选的，所述转外源GhCAD6基因需满足扫描电子显微镜观察转外源 GhCAD6基因的纤维表面变光滑。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，具备以下有益效果：
1、该检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，通过一种透射电镜检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，将收获到的转 GhCAD6基因的后代材料得不同发育时期的棉花纤维，通过透射电镜检测纤维细胞壁厚度的变化，从而得到纤维品质较好的棉花转基因后代材料，所述的综合鉴定方法是通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察成熟转基因后代纤维细胞壁厚度变薄，但紧实度增加，纤维表明变得光滑。
2、该检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，通过从改变棉花纤维细胞壁的结构与性能入手，依据肉桂醇脱氢酶基因(GhCAD6)能够在棉花纤维次生壁增厚期优势表达，并参与棉花纤维中木质素的合成和纤维细胞壁的合成、沉积，通过肉桂醇脱氢酶基因(GhCAD6)的过量表达获得到稳定遗传的后代材料后，对外源肉桂醇脱氢酶基因(GhCAD6)基因的鉴定，该方法实现通过电镜检测GhCAD6基因在棉花纤维发育中的功能，对于推动棉花分子育种与常规育种的结合具有积极意义。
附图说明
图1为本发明一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法转 GhCAD6基因后代植株和对照“新陆早36”棉花纤维细胞壁厚度变化电镜对比图；
图2为本发明一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法转 GhCAD6基因后代植株和对照“新陆早36”棉花纤维细胞壁厚度变化曲线图；
图3为本发明一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法 GhCAD6基因后代植株和对照“新陆早36”棉花成熟纤维表皮扫描电镜对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
1.透射电镜制样与观察
一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，包括以下步骤：
1)固定：取样后立即将棉纤维样品投到装有4％戊二醛(0.1mol/L的磷酸缓冲液，pH7.2)的医用小瓶中先固定，后放到4℃冰箱保存至全部样品取完；
2)预包埋：将棉纤维进行预包埋，即将棉纤维从4％戊二醛取出在滤纸上拉直，用刀片切取中部长约0.3cm，用镊子放到包埋板中摆直，用3.5％(琼脂粉和0.1mol/L磷酸缓冲液配置)琼脂在包埋板中进行预包埋，凝固后切除多余的部分，只剩下包埋的纤维，再投到医用小瓶中；
3)冲洗：用0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗样品3h；
4)脱水：分别经浓度为30、50、70、80、90、95、100％酒精逐级脱水，每级脱水20min，其中100％需脱水1h；
5)置换：再用1:1(酒精/丙酮)浸1h，1:5(酒精/丙酮)浸80min，纯丙酮浸1h，1:1(环氧树脂/丙酮)浸2h，3:1(环氧树脂/丙酮)浸3h， 5:1(环氧树脂/丙酮)浸4d，纯环氧树脂(Epon812)浸1d进行置换；
6)包埋：用纯环氧树脂在包埋板中包埋材料，放到烘箱里分别在37、45、 60℃下各放置1d；
7)切片：用德国LEICA ULTRACUTR切片机切片；
8)染色及观察拍照：2％醋酸双氧铀和6％柠檬酸铅染色各20min，双蒸水冲洗晾干后即可观察，用日本日立H-600透射电镜观察并拍照。
本发明实施例中，需要分别收集不同发育天数的(10天，15天，20天， 25天，30天，40天)的棉花纤维进行观察。
本发明实施例中，需要分别将转基因株系和对照材料的成熟棉花纤维放入95％乙醇:乙醚(1:1)中脱脂10min后,再将脱脂后的毛样品置于100％乙醇中清洗2min,取出用滤纸吸干或自然干燥，用IB-5型离子溅射仪喷镀铂金膜,厚度10nm，在SUPRA 55VP型扫描电镜下观察棉花纤维形态并拍照。
本发明实施例中，根据透射电镜和扫描电镜检测转外源GhCAD6基因检测改良棉纤维发育过程中的细胞壁及纤维表皮形态特征，从而得到纤维品质较好的转基因后代材料，可溶性糖含量显著降低的棉花转基因稳定遗传后代材料。
本发明实施例中，转外源GhCAD6基因需满足透射电子显微镜观察转外源 GhCAD6基因纤维细胞壁变薄，并且紧实度增加。
本发明实施例中，转外源GhCAD6基因需满足扫描电子显微镜观察转外源 GhCAD6基因的纤维表面变光滑。
2.测量细胞次生壁厚度
取10DPA﹑15DPA、20DPA﹑25DPA、30DPA和成熟棉纤维(40DPA) 观察的透射电子显微镜图片。用Adobe Photoshop图像处理软件测量细胞次生壁厚度。每个时期随机取15张图，每个图均匀分布取15个点测量次生壁垂直厚度求平均值。
FT(μm)＝[(x2-x1)2+(y2-y1)2)]1/2/DPμm
式中FT(μm)表示纤维细胞壁次生壁厚度，(x1,y1)为纤维次生壁内围某点坐标，(x2,y2)为某点所对应的次生壁外围垂线点的坐标，DPμm为每微米的像素数。
数据采用Excel软件进行统计分析。
图1为对转基因株系T6及对照材料进行透射电镜观察并拍照的结果，其中a、c、e、g、i、k分别为对照棉花纤维发育10、15、20、25、30DPA和成熟阶段的细胞壁形态；b、d、f、h、j、l分别为转基因后代棉花纤维发育 10、15、20、25、30DPA和成熟阶段的细胞壁形态；PCW为初生壁；SCW为次生壁。
图2中的棉花纤维细胞壁沉积情况分析及成熟纤维观察结果表明，转基因株系在10DPA-15DPA是的细胞壁厚度与对照的厚度无明显差异，从20DPA 到成熟时期细胞壁比同时期的对照更加紧实。
图2为上述透射电镜图片经图像处理软件测量获得的细胞次生壁厚度变化曲线图。
3.扫描电镜制样与观察
分别将转基因株系和对照材料的成熟棉花纤维放入95％乙醇:乙醚(1:1) 中脱脂10min后,再将脱脂后的毛样品置于100％乙醇中清洗2min,取出用滤纸吸干或自然干燥。用IB-5型离子溅射仪喷镀铂金膜,厚度10nm。在SUPRA 55VP型扫描电镜下观察棉花纤维形态并拍照。
对转基因株系T6及对照材料进行上述的电镜扫描后进行观察，结果表明，转基因株系的成熟棉纤维表面要比对照的纤维更加光滑紧致，并且更细，扫描电镜对比结果见图3。
对转基因株系T6及对照材料进行上述的电镜扫描后进行观察，结果表明，转基因株系的成熟棉纤维表面要比对照的纤维更加光滑紧致，并且更细。扫描电镜对比结果见图3。
图3中a为对照棉花成熟纤维电镜扫描图；b为转基因后代棉花成熟纤维电镜扫描图。
本发明在棉花中成功通过电镜方法筛选转GhCAD6基因的转基因后代的棉花纤维细胞壁的沉积和成熟纤维表皮的形态来确定品质优良的棉花材料。
本发明的有益效果是：该检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，通过一种透射电镜检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，将收获到的转GhCAD6基因的后代材料得不同发育时期的棉花纤维，通过透射电镜检测纤维细胞壁厚度的变化，从而得到纤维品质较好的棉花转基因后代材料，所述的综合鉴定方法是通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察成熟转基因后代纤维细胞壁厚度变薄，但紧实度增加，纤维表明变得光滑，通过从改变棉花纤维细胞壁的结构与性能入手，依据肉桂醇脱氢酶基因(GhCAD6)能够在棉花纤维次生壁增厚期优势表达，并参与棉花纤维中木质素的合成和纤维细胞壁的合成、沉积，通过肉桂醇脱氢酶基因(GhCAD6)的过量表达获得到稳定遗传的后代材料后，对外源肉桂醇脱氢酶基因(GhCAD6) 基因的鉴定，该方法实现通过电镜检测GhCAD6基因在棉花纤维发育中的功能，对于推动棉花分子育种与常规育种的结合具有积极意义，解决了CAD基因的表达对植物的细胞壁沉积具有很大影响的问题。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
机译： 植物转基因棉花种子和增加棉花植物收入的方法，从棉花植物生产的棉花纤维的质量。在寒冷的夜晚对光合作用效率的耐受性以及来自植物的作物纤维和种子的产量。植物干重中纤维素对其他成分的权利以及植物细胞壁的厚度，并改变从植物中分离出来的纤维的质量
机译： 分离的寡核苷酸分离的多肽，酸性核酸的构建，转基因细胞，转基因植物，增加植物生物量的方法，增加植物力的方法，增加植物产量的方法，方法用于提高植物对非生物胁迫的耐受性的方法。用于提高纤维质量和/或生产纤维的植物的产量的方法，生产棉纤维的方法，核酸的构建系统，表达目的多肽的方法在植物中，一种在棉花和细胞植物中表达目的多肽If的方法。
机译： 用于检测一种或多种基因差异表达，测量受试物质对一种或多种基因表达的影响的组合，组合物，装置和方法，以及用于筛选预后，操纵预后的方法基因组（genom）对人类或动物而言，而不是动物基因组的表达。调节一种或多种差异表达基因的表达，选择一种或多种动物，并产生抗体，物质，转基因动物，计算机系统，分离和纯化的抗体，试剂盒，用于传达信息的介质。数据和polinucleot u00ecdeo预后者的数据的使用
