自噬基因ATG9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用

技术领域

本发明属于植物学和生物技术领域，具体涉及自噬基因ATG9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用。

背景技术

水稻是世界上种植范围最为广泛也是最为重要的粮食作物之一，也是植物基因组学研究的模式生物之一，为全球超过30亿人口提供食物及能量。随着人口的日益增长，全球气候变化和环境胁迫等，培育高产优质水稻新品种显得尤为重要。水稻的籽粒大小是影响其产量和品质的最重要因素之一。发掘调控籽粒大小的新基因和分子机制，可为将来遗传改良水稻产量品质提供重要的理论基础。

细胞自噬是一种生物进化过程中高度保守的降解机制，主要是将细胞内的组分如受损的细胞器、变性或未折叠的蛋白等转运至液泡或溶酶体中进行降解，继而促使营养物质得以循环利用，达到协助植物在逆境中生存和生长发育的目的。已有的研究表明，细胞自噬广泛参与了植物各个方面的调控，包括花粉育性，水稻分蘖，氮利用和各种胁迫等。值得一提的是，目前尚未发现细胞自噬直接参与产量性状的调控，如籽粒大小。现在有关自噬的研究进展基本上是关于自噬基因的抗衰老、抗逆性和促进植物氮素循环的功能。但有关自噬基因ATG9对于水稻粒型的调控并未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供自噬基因ATG9的应用，特别是自噬基因ATG9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

自噬基因ATG9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用。

所述的自噬基因ATG9的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

所述的自噬基因ATG9的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的水稻育种优选包括对水稻粒型改良的调控。

所述的调控为正调控。

所述的正调控是指在水稻中过表达自噬基因ATG9，促进水稻ATG9过表达植株株高和穗长显著提高，粒宽、粒长以及百粒重明显增加。自噬基因ATG9正调控了籽粒等水稻各组织的大小变化，因此，自噬基因ATG9过表达对增加籽粒大小具有重要意义，为水稻产量的提高提供了重要的基因资源。

所述的水稻优选为粳稻。

所述的粳稻优选为中花11。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明利用PCR的方法从水稻中克隆出自噬基因ATG9(所对应基因座位号与Rice Genome Annotation Project中公布的LOC_Os10g07994相对应)。自噬基因ATG9对提高水稻产量和品质具有非凡的意义，可以作为水稻籽粒品质改良的新靶点。

(2)本发明通过CRISPR/Cas9敲除ATG9，获得atg9突变体植株。对atg9突变体植株的表型进行详细分析。结果表明，与野生型(WT)相比，atg9突变体植株的株高明显降低，穗长变短、籽粒变小以及百粒重减少。通过深入研究，构建了ATG9过表达植株，发现与WT相比，ATG9过表达植株株高和穗长显著提高，粒宽粒长以及百粒重亦明显增加，ATG9正调控了籽粒等水稻各组织的大小变化。

(3)本发明可以通过深入的研究探索ATG9基因的表达调控，结合基因编辑技术，有望创制优异的ATG9等位基因，如敲除该基因的沉默子进而提高其表达水平，最终产生与ATG9过表达类似的表型(籽粒变大，产量提高)。此外，还可以通过分子操作粒长基因和ATG9(如基因聚合)，进一步培育超长粒高产优质水稻。鉴于以往研究，可能可以提高植株的抗逆性，提高水稻对环境的适应性，尤其是对不良环境的适应性。综上所述，我们认为ATG9基因是一个潜在的协同水稻产量和抗逆的候选新靶点。

附图说明

图1为ATG9的基因编辑：野生型(WT)和突变体(atg9)的序列分析图；其中，该序列分析图通过chromas软件查看比对，GAGTGGAAGCGCTCGAGTC代表靶位点，PAM代表crRNA互补序列邻近基序，箭头所指代表突变位点，箭头所指字体T代表插入碱基T。

图2为ATG9表型分析结果图；其中，图A从左到右，分别为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株的株高结果图，标尺等于15cm；图B从左到右，分别为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株的穗型结果图，标尺等于2cm；图C从上到下，分别为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株的粒宽结果图，标尺等于0.5cm；图D从上到下，分别为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株的粒长结果图，标尺等于0.5cm；图E从左到右，分别为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株的百粒重结果图，标尺等于1cm。

图3分别为WT、atg9和ATG9过表达表型数据统计结果图；其中，图A为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达(OE)植株的株高结果图；图B为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达(OE)植株的穗长结果图；图C为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达(OE)植株的粒宽结果图；图D为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达(OE)植株的粒长结果图；图E为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达(OE)植株的百粒重结果图。图中数据为平均值±标准差，a、b、c分别代表互相具有显著性差异。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中所使用的实验方法如无说明，均为常规方法。

植物材料：本研究供试材料为粳稻背景(Oryza sativa L.)。野生型(WT)为中花11(ZH11)(公开使用的水稻品种，市售)。atg9突变体植株由本实验室联合中国水稻研究所王克剑课题组利用CRISPR/Cas9方法所创制(具体CRISPR/Cas9方法见参考文献Wang C,ShenL,Fu Y,et al.A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice[J].Journal of Genetics and Genomics,2015,42(12):703-706.)。ATG9过表达植株OE水稻由百格基因科技(江苏)有限公司构建。菌株和质粒：实验所用的菌株大肠杆菌DH5α购自广州春泥有限公司；植物过表达载体pRHVcGFP由中国农业科学院王国梁课题组提供(植物过表达载体pRHVcGFP在He F,Zhang F,Sun W,et al.A Versatile Vector Toolkit forFunctional Analysis of Rice Genes[J].Rice,2018,11(1):27.的补充数据中已公开)；pC1300-Cas9和SK-gRNA载体由中国水稻研究所王克剑课题组提供(pC1300-Cas9载体和SK-gRNA载体已在申请号为：2015104855732，名称为：植物多基因敲除载体的构建及应用的发明专利中公开)。

化学试剂：限制性核酸内切酶KpnI、NotI、BamHI、BglII和T4DNA连接酶购自NewEngland Biolabs公司；限制性核酸内切酶AarI购自Ferment公司；高保真酶KOD FX购自TOYOBO公司；abm反转录试剂盒购自爱必梦生物科技有限公司；胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自济凡生物科技(北京)有限公司；2×Taq PCR StarMix购自北京康润诚业生物科技有限公司。

实施例1：水稻atg9突变体的获得

atg9突变体是根据Wang C,Shen L,Fu Y,et al.A simple CRISPR/Cas9 systemfor multiplex genome editing in rice[J].Journal of Genetics and Genomics,2015,42(12):703-706.中记载的CRISPR/Cas9技术构建的。

1、靶序列选择及引物设计

以野生型植株ATG9基因取19bp大小GAGTGGAAGCGCTCGAGTC为靶位点，根据靶位点设计引物，如表1。

表1：靶位点引物

2、中间载体构建

ATG9-2-g++与ATG9-2-g--引物用水稀释至浓度100μM，前引物和后引物各20μL，混合在一起，引物混合后变性退火，100℃变性5分钟，室温冷却，形成带有粘性末端的片段。中间载体SK-gRNA进行AarI酶切，37℃酶切3-6h，试剂盒纯化酶切产物，形成带有粘性末端的载体，酶切体系如表2所示。

表2：AarI酶切SK-gRNA载体体系

将带有粘性末端的载体和带有粘性末端的片段进行连接(摩尔浓度1:3-10)，得到重组质粒1，命名为SK-gRNA-ATG9重组载体。如表3配制体系完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底，置于室温0.5-1h。反应产物转化感受态细胞DH5α，将菌液涂布棒在含有Amp抗性的平板上轻轻涂匀，将平板倒置，于37℃过夜培养。

表3：重组反应体系

克隆鉴定可用公共引物T3与ATG9-2-g--搭配进行菌落PCR阳性检测，利用公共引物T7或T3进行测序检测，验证是否正确。

T7：5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’

T3：5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’

3、构建至最终载体

pC1300-Cas9载体用KpnI和BamHI进行酶切回收。SK-gRNA-ATG9重组载体用KpnI和BglII进行酶切并回收片段。pC1300-Cas9和SK-gRNA-ATG9载体各反应体系如表4-1和4-2所示，37℃双酶切1h。

表4-1：pC1300-Cas9载体酶切反应体系

表4-2：SK-gRNA-ATG9重组载体酶切反应体系

并将回收片段连接到线性化的pC1300-Cas9载体上，得到重组载体2。连接体系如表5所示，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底，置于室温0.5-1h。反应产物转化感受态细胞DH5α，将菌液涂布棒在含有Kan抗性的平板上轻轻涂匀，将平板倒置，于37℃过夜培养。

表5：终载体连接体系

利用测序引物pC1300-F进行测序检测，验证重组载体是否正确。

pC1300-F：5’-ACACTTTATGCTTCCGGCTC-3’

4、转农杆菌转化水稻愈伤，获得转基因植株

转农杆菌转化水稻愈伤，获得转基因植株T

5、水稻基因组总DNA的提取

提取待测水稻植株叶片基因组DNA，在敲除靶位点序列附近设计引物，经PCR扩增后，产物进行测序分析，鉴定其基因靶序列是否发生了改变。

(1)取少量叶片置2mL管子中，加入钢珠，加入400-500μLTPS溶液；

(2)粉碎机粉碎，75℃水浴30min；

(3)12000rpm离心10min；

(4)取上清(500μL)至1.5mL管子中，加冰冻的等体积无水乙醇，上下混匀；

(5)放置-20℃0.5h以上；

(6)12000rpm离心5min，去上清；

(7)静置0.5h以上，去酒精，干燥；

(8)加100μL ddH

6、PCR扩增鉴定

以提取的DNA为模板，引物为表6的ATG9-F/R，进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如表7所示。

表6：PCR扩增的目的片段引物

表7：PCR反应体系

扩增程序为：94℃预变性5min；98℃变性10s、55℃退火30s、68℃延伸60s/1kb，25个循环；68℃总延伸5min，16℃保持1min。反应结束后，取5μL扩增产物加到含核酸染料的1％琼脂糖凝胶中电泳；电泳结束后在紫外成像仪上照胶，检测条带是否扩增出来，如果条带扩增出来，说明该片段是可能包含突变点的目的基因片段。其余PCR产物则送去测序公司进行测序(测序由广州睿博生物技术有限公司完成)。

7、测序比对

将测序结果放入华南农业大学刘耀光院士DSDecodeM(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)网站进行比对，根据峰图判断纯杂合位点，单峰则代表纯合位点，双峰则代表杂合位点。结果如图1所示，突变位点插入T的并为单峰则表示该植株即纯合的atg9突变体植株。

实施例2：ATG9过表达植株的构建

植物过表达载体pRHVcGFP由中国农业科学院王国梁课题组提供(植物过表达载体pRHVcGFP已在He F,Zhang F,Sun W,et al.A Versatile Vector Toolkit forFunctional Analysis of Rice Genes[J].Rice,2018,11(1):27.的补充数据中公开)

1、pRHVcGFP-ATG9过表达载体的构建

(1)目的基因扩增

取WT叶片的cDNA为模板(根据abm反转录试剂盒说明书操作)，根据目的基因设计引物(表8)，经过PCR扩增得到目的基因，扩增PCR体系如表9所示：

表8：PCR扩增的目的片段引物

表9：目的基因PCR反应体系

扩增程序为：94℃预变性5min；98℃变性10s、55℃退火30s、68℃延伸60s，32个循环；68℃总延伸5min，16℃保持1min。反应结束后，取50μL扩增产物加到含核酸染料的1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在紫外成像仪上照胶，检测条带是否扩增出来。如果目的条带扩增出来，说明扩增片段中可能含有目的基因。将目的条带切割起来，继续胶回收纯化产物(根据胶回收试剂盒说明书操作)以及浓度测定。

(2)制备线性化载体

分别取过表达载体pRHVcGFP和目的基因各3μg(根据质粒抽提试剂盒说明书操作)，两个反应体系都加入相应限制性核酸内切酶37℃双酶切20min。过表达载体pRHVcGFP和目的基因各反应体系如表10所示：

表10：酶切反应体系

取50μL反应产物加到含核酸染料的1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在紫外成像仪上照胶，目的条带分离出来后，将目的条带切割起来，继续胶回收纯化产物以及浓度测定。

(3)重组反应

用T4 DNA连接酶将插入片段和载体按比例重组在起来，得到pRHVcGFP-ATG9过表达载体。最适载体与插入片段摩尔比为1:(2-3)。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：最适载体使用量X＝[0.02×载体碱基对数]ng(0.03pmol)。最适插入片段使用量Y＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)或＝[0.06×插入片段碱基对数]ng(0.09pmol)。重组反应体系如表11：

表11：重组反应体系

体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底。置于16℃反应6-8h。反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

(4)重组产物转化、涂板

在冰上解冻克隆感受态细胞DH5α。取10μL冷却重组产物(pRHVcGFP-ATG9过表达载体)，加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min；42℃热激60秒，冰浴孵育2min，加入900μL LB培养基，37℃，200rpm，摇菌30min，5000rpm离心3min，弃掉上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有kan抗性的平板上轻轻涂匀。待菌液被吸收，将平板倒置，于37℃过夜培养。

(5)克隆鉴定

最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至500μL LB培养基中混匀，直接取1μL作为PCR模板，剩余菌液后续做测序鉴定。所用引物如表6，进行PCR反应，反应体系如表12：

表12：菌落PCR反应体系

扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，25个循环；72℃总延伸5min，16℃保持1min。反应结束后，取20μL扩增产物加到含核酸染料的1％琼脂糖凝胶中电泳；电泳结束后在紫外成像仪上照胶，检测条带是否扩增出来。如果条带扩增出来，则将克隆送去测序公司进行测序(测序由广州睿博生物技术有限公司完成)。

2、转基因植物遗传转化与鉴定

将构建好的pRHVcGFP-ATG9过表达载体送去百格基因科技(江苏)有限公司做遗传转化，至得到T

表13：HYG鉴定引物

实施例3：ATG9表型分析

本发明人在广东省增城实验基地试验田和广东省广州市华南农业大学农场播种粳稻品种野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株(OE)，在水稻生长过程中统计成熟期的株高、穗长，待到收种时，测量粒宽、粒长和百粒重。

待测植株：野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株(OE)。

分别取待测植株，详细分析成熟期的株高、穗长、粒宽、粒长和百粒重，并对其进一步的测量统计。结果如图2和图3所示。表型分析发现，与野生型(WT)相比，atg9突变体表现出多种生长发育缺陷的表型，包括株型变矮，穗长变短，籽粒长度变短以及百粒重减少。与WT相比，OE的株高和穗长显著提高，粒宽粒长以及百粒重亦明显增加。以上结果表明，ATG9过表达正调控了多个水稻重要农艺性状，是潜在的改良水稻产量和品质的新靶点。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 自噬基因ATG9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2784

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<223> 自噬基因ATG9的核苷酸序列

<400> 1

atgatgtcct tccttccgaa gggcaaaact acacaaacag cgtttaagtg gccatggaga 60

ggtgaatcgc agctatcggc gcatcttctc attgatattc cacctgaaat cgaattgtcg 120

gactaccgaa gattgccaag ccctggtaat gagagcccat cagggctact tcatggagaa 180

gactttaagg aggaggtgat ccctgacttg gatattttct ttgagaggct ctatgagtat 240

ttctgcgcga aaggtctgcg gtgcatcatc accaagtgga taattgagat cctcaatgtg 300

acgtttatgg tttgctgtat cgggtttttc ttcttgtttg ttgattggcc tgcccttggc 360

gatttgaaat gtggagtgga agcgctcgag tcaggggcaa aaccttgtga cctaatgaaa 420

ctcattaagt atcgtcccct agatcctttc acatttacaa agtttatcac tattggatcc 480

atggttatac tctcaactta cggaatcatt aactttgtga agttttttgt aaaactgaga 540

agcacactca aggtccgtga cttctactgt aacagtctca aggttacaga tctcgaaatt 600

cagactatat catggcctag agtagttgag aaggtcgtac ttctgcagaa gtcacaacga 660

ctttgtgtcg ttaaagatct cacggagcat gatataatca tgcgaataat gcgtaaacaa 720

aactacctga ttgggatggt taataaaggt atcatcgcat tgccaatccc ctcttggctt 780

cctggagttg gcccaactgt cagctcacgt atgcatggaa aaaaaagcta tctgatgctt 840

ccaaaggccc tggagtggac attgaattgg tgcatcttcc aaaccatgtt tgataggaaa 900

ttttgtgtta gaaaagacat tctgacaagt ccgtctttat tgaagaaacg gcttgtattt 960

atgggtattg ccatgtttct tctgtcacct tgtcttgtta tcttcccatt ggtataccta 1020

tttctgagat atgcagaaga attctacaat caccccagta cggcatcatc tcgaaaatgg 1080

tcgaatcttt caaagtggat tttgagggaa tacaatgagg ttgaccattt cttcaaacat 1140

aggttgaaca acagtagtgt caactcacta aattatttga agcagtttcc aactccacta 1200

gtatctatta ttgcaaaatt catatcgttt gtatctggtg gattggctgg aattcttctc 1260

atccttggat ttctaggtga atccatcctt gagggtcatg tatttggccg aaatcttctc 1320

tggtatacta ttgtttttgg aacaatagca actgttagtc ggaatgttgt ggttgatgaa 1380

ctccaagtga ttgatccaga aggagctatg tcctttgttc tgcagcagac acactacatg 1440

cctaaaaggt ggcgcggtaa agagggcagt gaacttgtac gaagggactt tgaatctctg 1500

tttcagtata ccataacgat gctactagaa gagatggcct caattttcat cactccatat 1560

ctgctaatat ttgtggttcc aaagcgtgtt gatgatattc tacgcttcat atcagacttc 1620

acagtttatg ttgatggagt gggagatgtg tgcagcttaa gcatgttcga cttaagaaga 1680

catggaaata gaaactacgg ttcaccacat aatgcagtta aaagcatgag aagctcccaa 1740

ggaaaaatgg agaaatcact attaagtttc caaagcacct acacatcatg ggagccaaac 1800

gcagatggca agaaatttat ttgcaacctc cagaaattca aggagaaaca aatccgtcaa 1860

catacctttc aaacaacgga atcatcacag cttgggttga gttgtagagg tcaaactgca 1920

gttttccatc gactgctccc tagaaacatc tatcctggca atggggtcat ttttaacttt 1980

gatccattag gactgctcga cacagatcaa agagcttgtc catatatcct ggattggtat 2040

tacacacacc aacacacaaa tagagaagcg ggctcatctt cccaccttaa tgaagcatca 2100

cctgagcaac aggaggagat atggccacct ctgagcaaac cattaacaga aattgaagat 2160

gagcaaatct gggattctga tttatataga agagctcgaa gctacctgga ggcatcaaca 2220

tcaagtgcat tctttcgaca ggccaccacc ttcaagcgcc atggcaggga acaaaattct 2280

accagccatc aatggtgggc tcaggcctcg aggcagcagg ctgatccacg aaacagtttt 2340

caagggcctc ctcaagacag ttttcttgag cctccggact tccgaaatca tttggaagct 2400

agccatgatt ccagccatca aagtgattgt aggctgacct ccagaaggtc aactgatcca 2460

caagacagct tcgttgagcc tcctgatttt ggtgattaca tgtcctgtca tagctctagc 2520

tatcatggcg atgaaacgtc ggatggaaac tcagaactag atcaaagcaa caatagttgg 2580

cgaagccccc atgccctgtc aaagacaagg tacatgggtg atgatgatct tgacctagaa 2640

caaggcccga gtttccattt tactgatgcc cctcagaagg acagtggaag tgaaggagat 2700

ggacatggtg tagccaatat ttacagctct acgccagcca gccttcctgt acggataata 2760

cctagaagca gtgacccagt ttag 2784

<210> 2

<223> 自噬基因ATG9的氨基酸序列

<400> 2

Met Met Ser Phe Leu Pro Lys Gly Lys Thr Thr Gln Thr Ala Phe Lys

1 5 10 15

Trp Pro Trp Arg Gly Glu Ser Gln Leu Ser Ala His Leu Leu Ile Asp

20 25 30

Ile Pro Pro Glu Ile Glu Leu Ser Asp Tyr Arg Arg Leu Pro Ser Pro

35 40 45

Gly Asn Glu Ser Pro Ser Gly Leu Leu His Gly Glu Asp Phe Lys Glu

50 55 60

Glu Val Ile Pro Asp Leu Asp Ile Phe Phe Glu Arg Leu Tyr Glu Tyr

65 70 75 80

Phe Cys Ala Lys Gly Leu Arg Cys Ile Ile Thr Lys Trp Ile Ile Glu

85 90 95

Ile Leu Asn Val Thr Phe Met Val Cys Cys Ile Gly Phe Phe Phe Leu

100 105 110

Phe Val Asp Trp Pro Ala Leu Gly Asp Leu Lys Cys Gly Val Glu Ala

115 120 125

Leu Glu Ser Gly Ala Lys Pro Cys Asp Leu Met Lys Leu Ile Lys Tyr

130 135 140

Arg Pro Leu Asp Pro Phe Thr Phe Thr Lys Phe Ile Thr Ile Gly Ser

145 150 155 160

Met Val Ile Leu Ser Thr Tyr Gly Ile Ile Asn Phe Val Lys Phe Phe

165 170 175

Val Lys Leu Arg Ser Thr Leu Lys Val Arg Asp Phe Tyr Cys Asn Ser

180 185 190

Leu Lys Val Thr Asp Leu Glu Ile Gln Thr Ile Ser Trp Pro Arg Val

195 200 205

Val Glu Lys Val Val Leu Leu Gln Lys Ser Gln Arg Leu Cys Val Val

210 215 220

Lys Asp Leu Thr Glu His Asp Ile Ile Met Arg Ile Met Arg Lys Gln

225 230 235 240

Asn Tyr Leu Ile Gly Met Val Asn Lys Gly Ile Ile Ala Leu Pro Ile

245 250 255

Pro Ser Trp Leu Pro Gly Val Gly Pro Thr Val Ser Ser Arg Met His

260 265 270

Gly Lys Lys Ser Tyr Leu Met Leu Pro Lys Ala Leu Glu Trp Thr Leu

275 280 285

Asn Trp Cys Ile Phe Gln Thr Met Phe Asp Arg Lys Phe Cys Val Arg

290 295 300

Lys Asp Ile Leu Thr Ser Pro Ser Leu Leu Lys Lys Arg Leu Val Phe

305 310 315 320

Met Gly Ile Ala Met Phe Leu Leu Ser Pro Cys Leu Val Ile Phe Pro

325 330 335

Leu Val Tyr Leu Phe Leu Arg Tyr Ala Glu Glu Phe Tyr Asn His Pro

340 345 350

Ser Thr Ala Ser Ser Arg Lys Trp Ser Asn Leu Ser Lys Trp Ile Leu

355 360 365

Arg Glu Tyr Asn Glu Val Asp His Phe Phe Lys His Arg Leu Asn Asn

370 375 380

Ser Ser Val Asn Ser Leu Asn Tyr Leu Lys Gln Phe Pro Thr Pro Leu

385 390 395 400

Val Ser Ile Ile Ala Lys Phe Ile Ser Phe Val Ser Gly Gly Leu Ala

405 410 415

Gly Ile Leu Leu Ile Leu Gly Phe Leu Gly Glu Ser Ile Leu Glu Gly

420 425 430

His Val Phe Gly Arg Asn Leu Leu Trp Tyr Thr Ile Val Phe Gly Thr

435 440 445

Ile Ala Thr Val Ser Arg Asn Val Val Val Asp Glu Leu Gln Val Ile

450 455 460

Asp Pro Glu Gly Ala Met Ser Phe Val Leu Gln Gln Thr His Tyr Met

465 470 475 480

Pro Lys Arg Trp Arg Gly Lys Glu Gly Ser Glu Leu Val Arg Arg Asp

485 490 495

Phe Glu Ser Leu Phe Gln Tyr Thr Ile Thr Met Leu Leu Glu Glu Met

500 505 510

Ala Ser Ile Phe Ile Thr Pro Tyr Leu Leu Ile Phe Val Val Pro Lys

515 520 525

Arg Val Asp Asp Ile Leu Arg Phe Ile Ser Asp Phe Thr Val Tyr Val

530 535 540

Asp Gly Val Gly Asp Val Cys Ser Leu Ser Met Phe Asp Leu Arg Arg

545 550 555 560

His Gly Asn Arg Asn Tyr Gly Ser Pro His Asn Ala Val Lys Ser Met

565 570 575

Arg Ser Ser Gln Gly Lys Met Glu Lys Ser Leu Leu Ser Phe Gln Ser

580 585 590

Thr Tyr Thr Ser Trp Glu Pro Asn Ala Asp Gly Lys Lys Phe Ile Cys

595 600 605

Asn Leu Gln Lys Phe Lys Glu Lys Gln Ile Arg Gln His Thr Phe Gln

610 615 620

Thr Thr Glu Ser Ser Gln Leu Gly Leu Ser Cys Arg Gly Gln Thr Ala

625 630 635 640

Val Phe His Arg Leu Leu Pro Arg Asn Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Val

645 650 655

Ile Phe Asn Phe Asp Pro Leu Gly Leu Leu Asp Thr Asp Gln Arg Ala

660 665 670

Cys Pro Tyr Ile Leu Asp Trp Tyr Tyr Thr His Gln His Thr Asn Arg

675 680 685

Glu Ala Gly Ser Ser Ser His Leu Asn Glu Ala Ser Pro Glu Gln Gln

690 695 700

Glu Glu Ile Trp Pro Pro Leu Ser Lys Pro Leu Thr Glu Ile Glu Asp

705 710 715 720

Glu Gln Ile Trp Asp Ser Asp Leu Tyr Arg Arg Ala Arg Ser Tyr Leu

725 730 735

Glu Ala Ser Thr Ser Ser Ala Phe Phe Arg Gln Ala Thr Thr Phe Lys

740 745 750

Arg His Gly Arg Glu Gln Asn Ser Thr Ser His Gln Trp Trp Ala Gln

755 760 765

Ala Ser Arg Gln Gln Ala Asp Pro Arg Asn Ser Phe Gln Gly Pro Pro

770 775 780

Gln Asp Ser Phe Leu Glu Pro Pro Asp Phe Arg Asn His Leu Glu Ala

785 790 795 800

Ser His Asp Ser Ser His Gln Ser Asp Cys Arg Leu Thr Ser Arg Arg

805 810 815

Ser Thr Asp Pro Gln Asp Ser Phe Val Glu Pro Pro Asp Phe Gly Asp

820 825 830

Tyr Met Ser Cys His Ser Ser Ser Tyr His Gly Asp Glu Thr Ser Asp

835 840 845

Gly Asn Ser Glu Leu Asp Gln Ser Asn Asn Ser Trp Arg Ser Pro His

850 855 860

Ala Leu Ser Lys Thr Arg Tyr Met Gly Asp Asp Asp Leu Asp Leu Glu

865 870 875 880

Gln Gly Pro Ser Phe His Phe Thr Asp Ala Pro Gln Lys Asp Ser Gly

885 890 895

Ser Glu Gly Asp Gly His Gly Val Ala Asn Ile Tyr Ser Ser Thr Pro

900 905 910

Ala Ser Leu Pro Val Arg Ile Ile Pro Arg Ser Ser Asp Pro Val

915 920 925

<210> 3

<223> 靶位点

<400> 3

gagtggaagc gctcgagtc 19

<210> 4

<223> pRHVcGFP载体序列

<400> 4

atgcaggtgt ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaaatat atcatcatga 60

acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa 120

cgggaaacgt cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa 180

tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgcttgta tgggaagccc 240

gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat 300

gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt 360

atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccggaaa aacagcattc 420

caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc 480

ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt 540

cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat 600

gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa acttttgcca 660

ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac 720

gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag 780

gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt 840

tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc 900

gatgagtttt tctaatcaga attggttaat tggttgtaac actggcagag cattacgctg 960

acttgacggg acggcgcaag ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 1020

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 1080

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 1140

aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 1200

ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 1260

catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 1320

ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 1380

ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 1440

agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 1500

taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 1560

atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 1620

cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 1680

ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 1740

accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 1800

gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccggcgcg ccgaatgaac gccaagagga 1860

acaagcatga aaccgcacca ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac cgaagagatc 1920

gaggcggaga tgatcgcggc cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt ctcaaccgtg 1980

cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc 2040

ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt tgagtaaaac 2100

agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag 2160

gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca 2220

tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg ttagtcgatt 2280

ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg 2340

ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact 2400

tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag 2460

ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc accgccgacc 2520

tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg 2580

tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg 2640

ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac ccaggcactg 2700

ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc cgcgaggtcc 2760

aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta aagagaaaat 2820

gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca gcaaggctgc 2880

aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc agttgccggc 2940

ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca ttaccgagct 3000

gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa atgagtagat 3060

gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc accgacgccg 3120

tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc tgggttgcct 3180

gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga gcggtcgcaa 3240

accatccggc ccggtacaaa tcggcgcggc gctgggtgat gacctggtgg agaagttgaa 3300

ggccgcgcag gccgcccagc ggcaacgcat cgaggcagaa gcacgccccg gtgaatcgtg 3360

gcaagcgtcc gctgatcgaa tccgcaaaga atcccggcaa ccgccggcag ccggtgcgcc 3420

gtcgattagg aagccgccca agggcgacga gcaaccagat tttttcgttc cgatgctcta 3480

tgacgtgggc acccgcgata gtcgcagcat catggacgtg gccgttttcc gtctgtcgaa 3540

gcgtgaccga cgagctggcg aggtgatccg ctacgagctt ccagacgggc acgtagaggt 3600

ttccgcaggg ccggccggca tggccagtgt gtgggattac gacctggtac tgatggcggt 3660

ttcccatcta accgaatcca tgaaccgata ccgggaaggg aagggagaca agcccggccg 3720

cgtgttccgt ccacacgttg cggacgtact caagttctgc cggcgagccg atggcggaaa 3780

gcagaaagac gacctggtag aaacctgcat tcggttaaac accacgcacg ttgccatgca 3840

gcgtacgaag aaggccaaga acggccgcct ggtgacggta tccgagggtg aagccttgat 3900

tagccgctac aagatcgtaa agagcgaaac cgggcggccg gagtacatcg agatcgagct 3960

agctgattgg atgtaccgcg agatcacaga aggcaagaac ccggacgtgc tgacggttca 4020

ccccgattac tttttgatcg atcccggcat cggccgtttt ctctaccgcc tggcacgccg 4080

cgccgcaggc aaggcagaag ccagatggtt gttcaagacg atctacgaac gcagtggcag 4140

cgccggagag ttcaagaagt tctgtttcac cgtgcgcaag ctgatcgggt caaatgacct 4200

gccggagtac gatttgaagg aggaggcggg gcaggctggc ccgatcctag tcatgcgcta 4260

ccgcaacctg atcgagggcg aagcatccgc cggttcctaa tgtacggagc agatgctagg 4320

gcaaattgcc ctagcagggg aaaaaggtcg aaaaggtctc tttcctgtgg atagcacgta 4380

cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggaacccg tacattggga acccaaagcc 4440

gtacattggg aaccggtcac acatgtaagt gactgatata aaagagaaaa aaggcgattt 4500

ttccgcctaa aactctttaa aacttattaa aactcttaaa acccgcctgg cctgtgcata 4560

actgtctggc cagcgcacag ccgaagagct gcaaaaagcg cctagtttac ccgccaatat 4620

atcctgtcag gcgcgccccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc 4680

tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta 4740

atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta 4800

acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt 4860

aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tctactcact tagcggccgt tacttgtaca 4920

gctcgtccat gccgagagtg atcccggcgg cggtcacgaa ctccagcagg accatgtgat 4980

cgcgcttctc gttggggtct ttgctcaggg cggactgggt gctcaggtag tggttgtcgg 5040

gcagcagcac ggggccgtcg ccgatggggg tgttctgctg gtagtggtcg gcgagctgca 5100

cgctgccgtc ctcgatgttg tggcggatct tgaagttcac cttgatgccg ttcttctgct 5160

tgtcggccat gatatagacg ttgtggctgt tgtagttgta ctccagcttg tgccccagga 5220

tgttgccgtc ctccttgaag tcgatgccct tcagctcgat gcggttcacc agggtgtcgc 5280

cctcgaactt cacctcggcg cgggtcttgt agttgccgtc gtccttgaag aagatggtgc 5340

gctcctggac gtagccttcg ggcatggcgg acttgaagaa gtcgtgctgc ttcatgtggt 5400

cggggtagcg gctgaagcac tgcacgccgt aggtcagggt ggtcacgagg gtgggccagg 5460

gcacgggcag cttgccggtg gtgcagatga acttcagggt cagcttgccg taggtggcat 5520

cgccctcgcc ctcgccggac acgctgaact tgtggccgtt tacgtcgccg tccagctcga 5580

ccaggatggg caccaccccg gtgaacagct cctcgccctt gctcaccata gcggccgcac 5640

tagtaagctt ggtaccgagc tcacccgggg atcccactgg atctggatat cctgcataag 5700

taacaccaaa caacagggtg agcatcgaca aaagaaacag taccaagcaa ataaatagcg 5760

tatgaaggca gggctaaaaa aatccacata tagctgctgc atatgccatc atccaagtat 5820

atcaagatca aaataattat aaaacatact tgtttattat aatagatagg tactcaaggt 5880

tagagcatat gaatagatgc tgcatatgcc atcatgtata tgcatcagta aaacccacat 5940

caacatgtat acctatccta gatcgatatt tccatccatc ttaaactcgt aactatgaag 6000

atgtatgaca cacacataca gttccaaaat taataaatac accaggtagt ttgaaacagt 6060

attctactcc gatctagaac gaatgaacga ccgcccaacc acaccacatc atcacaacca 6120

agcgaacaaa aagcatctct gtatatgcat cagtaaaacc cgcatcaaca tgtataccta 6180

tcctagatcg atatttccat ccatcatctt caattcgtaa ctatgaatat gtatggcaca 6240

cacatacaga tccaaaatta ataaatccac caggtagttt gaaacagaat tctactccga 6300

tctagaacga ccgcccaacc agaccacatc atcacaacca agacaaaaaa aagcatgaaa 6360

agatgacccg acaaacaagt gcacggcata tattgaaata aaggaaaagg gcaaaccaaa 6420

ccctatgcaa cgaaacaaaa aaaatcatga aatcgatccc gtctgcggaa cggctagagc 6480

catcccagga ttccccaaag agaaacactg gcaagttagc aatcagaacg tgtctgacgt 6540

acaggtcgca tccgtgtacg aacgctagca gcacggatct aacacaaaca cggatctaac 6600

acaaacatga acagaagtag aactaccggg ccctaaccat ggaccggaac gccgatctag 6660

agaaggtaga gagggggggg gggggaggac gagcggcgta ccttgaagcg gaggtgccga 6720

cgggtggatt tgggggagat ctggttgtgt gtgtgtgcgc tccgaacaac acgaggttgg 6780

ggaaagaggg tgtggagggg gtgtctattt attacggcgg gcgaggaagg gaaagcgaag 6840

gagcggtggg aaaggaatcc cccgtagctg ccggtgccgt gagaggagga ggaggccgcc 6900

tgccgtgccg gctcacgtct gccgctccgc cacgcaattt ctggatgccg acagcggagc 6960

aagtccaacg gtggagcgga actctcgaga ggggtccaga ggcagcgaca gagatgccgt 7020

gccgtctgct tcgcttggcc cgacgcgacg ctgctggttc gctggttggt gtccgttaga 7080

ctcgtcgacg gcgtttaaca ggctggcatt atctactcga aacaagaaaa atgtttcctt 7140

agttttttta atttcttaaa gggtatttgt ttaattttta gtcactttat tttattctat 7200

tttatatcta aattattaaa taaaaaaact aaaatagagt tttagttttc ttaatttaga 7260

ggctaaaata gaataaaata gatgtactaa aaaaattagt ctataaaaac cattaaccct 7320

aaaccctaaa tggatgtact aataaaatgg atgaagtatt atataggtga agctatttgc 7380

aaaaaaaaag gagaacacat gcacactaaa aagataaaac tgtagagtcc tgttgtcaaa 7440

atactcaatt gtcctttaga ccatgtctaa ctgttcattt atatgattct ctaaaacact 7500

gatattattg tagtactata gattatatta ttcgtagagt aaagtttaaa tatatgtata 7560

aagatagata aactgcactt caaacaagtg tgacaaaaaa aatatgtggt aattttttat 7620

aacttagaca tgcaatgctc attatctcta gagaggggca cgaccgggtc acgctgcact 7680

gcagtaattc gggggatctg gattttagta ctggattttg gttttaggaa ttagaaattt 7740

tattgataga agtattttac aaatacaaat acatactaag ggtttcttat atgctcaaca 7800

catgagcgaa accctatagg aaccctaatt cccttatctg ggaactactc acacattatt 7860

atggagaaac tcgagcttgt cgatcgacag atcccggtcg gcatctactc tatttctttg 7920

ccctcggacg agtgctgggg cgtcggtttc cactatcggc gagtacttct acacagccat 7980

cggtccagac ggccgcgctt ctgcgggcga tttgtgtacg cccgacagtc ccggctccgg 8040

atcggacgat tgcgtcgcat cgaccctgcg cccaagctgc atcatcgaaa ttgccgtcaa 8100

ccaagctctg atagagttgg tcaagaccaa tgcggagcat atacgcccgg agtcgtggcg 8160

atcctgcaag ctccggatgc ctccgctcga agtagcgcgt ctgctgctcc atacaagcca 8220

accacggcct ccagaagaag atgttggcga cctcgtattg ggaatccccg aacatcgcct 8280

cgctccagtc aatgaccgct gttatgcggc cattgtccgt caggacattg ttggagccga 8340

aatccgcgtg cacgaggtgc cggacttcgg ggcagtcctc ggcccaaagc atcagctcat 8400

cgagagcctg cgcgacggac gcactgacgg tgtcgtccat cacagtttgc cagtgataca 8460

catggggatc agcaatcgcg catatgaaat cacgccatgt agtgtattga ccgattcctt 8520

gcggtccgaa tgggccgaac ccgctcgtct ggctaagatc ggccgcagcg atcgcatcca 8580

tagcctccgc gaccggttgt agaacagcgg gcagttcggt ttcaggcagg tcttgcaacg 8640

tgacaccctg tgtacggcgg gagatgcaat aggtcaggct ctcgctaaac tccccaatgt 8700

caagcacttc cggaatcggg agcgcggccg atgcaaagtg ccgataaaca taacgatctt 8760

tgtagaaacc atcggcgcag ctatttaccc gcaggacata tccacgccct cctacatcga 8820

agctgaaagc acgagattct tcgccctccg agagctgcat caggtcggag acgctgtcga 8880

acttttcgat cagaaacttc tcgacagacg tcgcggtgag ttcaggcttt ttcattgtcc 8940

tctccaaatg aaatgaactt ccttatatag aggaagggtc ttgcgaagga tagtgggatt 9000

gtgcgtcatc ccttacgtca gtggagatgt cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg 9060

ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac 9120

tgtcggcaga gagatcttga atgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg 9180

agccaccttc cttttctact gtcctttcga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc 9240

cgaggaggtt tcccgaaatt atcctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg 9300

agactgtatc tttgacattt ttggagtaga ccagagtgtc gtgctccacc atgtttgttt 9360

acaccacaat atatcctgcc a 9381

<210> 5

<223> SK-gRNA载体

<400> 5

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 180

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 240

tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 300

ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 360

tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 420

atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 480

gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 540

caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 600

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 660

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 720

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 780

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 840

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 900

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 960

taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 1020

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 1080

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 1140

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 1200

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 1260

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 1320

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 1380

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 1440

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 1500

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 1560

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 1620

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1680

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 1740

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 1800

ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 1860

agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 1920

aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 1980

gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg 2040

tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt 2100

tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg 2160

ccaagcgcgc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct ggagctccac cgcggtggcg 2220

gccgcagatc tgctagcgtc gacgattaag gaatctttaa acatacgaac agatcactta 2280

aagttcttct gaagcaactt aaagttatca ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg 2340

tgcagtcagg gaccatagca caagacaggc gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg 2400

gaagccggga acactgggta cgtcggaaac cacgtgatgt gaagaagtaa gataaactgt 2460

aggagaaaag catttcgtag tgggccatga agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg 2520

ccggcccatt acgcaattgg acgacaacaa agactagtat tagtaccacc tcggctatcc 2580

acatagatca aagctgattt aaaagagttg tgcagatgat ccgtggcagc tcgcaggtga 2640

acacaacacc tgcacacgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt 2700

tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt ccacataatc ctcgagtcta 2760

gaggatcctc ggtacccaat tcgccctata gtgagtcgta ttacgcgcgc tcactggccg 2820

tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag 2880

cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc 2940

aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgga aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt 3000

cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat 3060

cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa 3120

gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg 3180

cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa 3240

agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc 3300

gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag 3360

tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg 3420

cgcgtcag 3428

<210> 6

<223> pC1300-Cas9载体

<400> 6

aattcgagct cggtaccaag gatccgtacc cctactccaa aaatgtcaaa gatacagtct 60

cagaagacca aagggctatt gagacttttc aacaaagggt aatttcggga aacctcctcg 120

gattccattg cccagctatc tgtcacttca tcgaaaggac agtagaaaag gaaggtggct 180

cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggctatcat tcaagatgcc tctgccgaca 240

gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa 300

ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg acatctccac tgacgtaagg gatgacgcac 360

aatcccaccc ctactccaaa aatgtcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg 420

agacttttca acaaagggta atttcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 480

gtcacttcat cgaaaggaca gtagaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 540

ataaaggaaa ggctatcatt caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 600

cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 660

attgatgtga catctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 720

acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacagcccaa gctagatcca 780

tggcccctaa gaagaagaga aaggtcggta ttcacggcgt tcctgcggcg atggacaaga 840

agtatagtat tggtctggac attgggacga attccgttgg ctgggccgtg atcaccgatg 900

agtacaaggt cccttccaag aagtttaagg ttctggggaa caccgatcgg cacagcatca 960

agaagaatct cattggagcc ctcctgttcg actcaggcga gaccgccgaa gcaacaaggc 1020

tcaagagaac cgcaaggaga cggtatacaa gaaggaagaa taggatctgc tacctgcagg 1080

agattttcag caacgaaatg gcgaaggtgg acgattcgtt ctttcataga ttggaggaga 1140

gtttcctcgt cgaggaagat aagaagcacg agaggcatcc tatctttggc aacattgtcg 1200

acgaggttgc ctatcacgaa aagtacccca caatctatca tctgcggaag aagcttgtgg 1260

actcgactga taaggcggac cttagattga tctacctcgc tctggcacac atgattaagt 1320

tcaggggcca ttttctgatc gagggggatc ttaacccgga caatagcgat gtggacaagt 1380

tgttcatcca gctcgtccaa acctacaatc agctctttga ggaaaaccca attaatgctt 1440

caggcgtcga cgccaaggcg atcctgtctg cacgcctttc aaagtctcgc cggcttgaga 1500

acttgatcgc tcaactcccg ggcgaaaaga agaacggctt gttcgggaat ctcattgcac 1560

tttcgttggg gctcacacca aacttcaaga gtaattttga tctcgctgag gacgcaaagc 1620

tgcagctttc caaggacact tatgacgatg acctggataa ccttttggcc caaatcggcg 1680

atcagtacgc ggacttgttc ctcgccgcga agaatttgtc ggacgcgatc ctcctgagtg 1740

atattctccg cgtgaacacc gagattacaa aggccccgct ctcggcgagt atgatcaagc 1800

gctatgacga gcaccatcag gatctgaccc ttttgaaggc tttggtccgg cagcaactcc 1860

cagagaagta caaggaaatc ttctttgatc aatccaagaa cggctacgct ggttatattg 1920

acggcggggc atcgcaggag gaattctaca agtttatcaa gccaattctg gagaagatgg 1980

atggcacaga ggaactcctg gtgaagctca atagggagga ccttttgcgg aagcaaagaa 2040

ctttcgataa cggcagcatc cctcaccaga ttcatctcgg ggagctgcac gccatcctga 2100

gaaggcagga agacttctac ccctttctta aggataaccg ggagaagatc gaaaagattc 2160

tgacgttcag aattccgtac tatgtcggac cactcgcccg gggtaattcc agatttgcgt 2220

ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca caccttggaa cttcgaggaa gtggtcgata 2280

agggcgcttc cgcacagagc ttcattgagc gcatgacaaa ttttgacaag aacctgccta 2340

atgagaaggt ccttcccaag cattccctcc tgtacgagta tttcactgtt tataacgaac 2400

tcacgaaggt gaagtatgtg accgagggaa tgcgcaagcc cgccttcctg agcggcgagc 2460

aaaagaaggc gatcgtggac cttttgttta agaccaatcg gaaggtcaca gttaagcagc 2520

tcaaggagga ctacttcaag aagattgaat gcttcgattc cgttgagatc agcggcgtgg 2580

aagacaggtt taacgcgtca ctggggactt accacgatct cctgaagatc attaaggata 2640

aggacttctt ggacaacgag gaaaatgagg atatcctcga agacattgtc ctgactctta 2700

cgttgtttga ggatagggaa atgatcgagg aacgcttgaa gacgtatgcc catctcttcg 2760

atgacaaggt tatgaagcag ctcaagagaa gaagatacac cggatgggga aggctgtccc 2820

gcaagcttat caatggcatt agagacaagc aatcagggaa gacaatcctt gactttttga 2880

agtctgatgg cttcgcgaac aggaatttta tgcagctgat tcacgatgac tcacttactt 2940

tcaaggagga tatccagaag gctcaagtgt cgggacaagg tgacagtctg cacgagcata 3000

tcgccaacct tgcgggatct cctgcaatca agaagggtat tctgcagaca gtcaaggttg 3060

tggatgagct tgtgaaggtc atgggacggc ataagcccga gaacatcgtt attgagatgg 3120

ccagagaaaa tcagaccaca caaaagggtc agaagaactc gagggagcgc atgaagcgca 3180

tcgaggaagg cattaaggag ctggggagtc agatccttaa ggagcacccg gtggaaaaca 3240

cgcagttgca aaatgagaag ctctatctgt actatctgca aaatggcagg gatatgtatg 3300

tggaccagga gttggatatt aaccgcctct cggattacga cgtcgatcat atcgttcctc 3360

agtccttcct taaggatgac agcattgaca ataaggttct caccaggtcc gacaagaacc 3420

gcgggaagtc cgataatgtg cccagcgagg aagtcgttaa gaagatgaag aactactgga 3480

ggcaactttt gaatgccaag ttgatcacac agaggaagtt tgataacctc actaaggccg 3540

agcgcggagg tctcagcgaa ctggacaagg cgggcttcat taagcggcaa ctggttgaga 3600

ctagacagat cacgaagcac gtggcgcaga ttctcgattc acgcatgaac acgaagtacg 3660

atgagaatga caagctgatc cgggaagtga aggtcatcac cttgaagtca aagctcgttt 3720

ctgacttcag gaaggatttc caattttata aggtgcgcga gatcaacaat tatcaccatg 3780

ctcatgacgc atacctcaac gctgtggtcg gaacagcatt gattaagaag tacccgaagc 3840

tcgagtccga attcgtgtac ggtgactata aggtttacga tgtgcgcaag atgatcgcca 3900

agtcagagca ggaaattggc aaggccactg cgaagtattt cttttactct aacattatga 3960

atttctttaa gactgagatc acgctggcta atggcgaaat ccggaagaga ccacttattg 4020

agaccaacgg cgagacaggg gaaatcgtgt gggacaaggg gagggatttc gccacagtcc 4080

gcaaggttct ctctatgcct caagtgaata ttgtcaagaa gactgaagtc cagacgggcg 4140

ggttctcaaa ggaatctatt ctgcccaagc ggaactcgga taagcttatc gccagaaaga 4200

aggactggga cccgaagaag tatggaggtt tcgactcacc aacggtggct tactctgtcc 4260

tggttgtggc aaaggtggag aagggaaagt caaagaagct caagtctgtc aaggagctcc 4320

tgggtatcac cattatggag aggtccagct tcgaaaagaa tccgatcgat tttctcgagg 4380

cgaagggata taaggaagtg aagaaggacc tgatcattaa gcttccaaag tacagtcttt 4440

tcgagttgga aaacggcagg aagcgcatgt tggcttccgc aggagagctc cagaagggta 4500

acgagcttgc tttgccgtcc aagtatgtga acttcctcta tctggcatcc cactacgaga 4560

agctcaaggg cagcccagag gataacgaac agaagcaact gtttgtggag caacacaagc 4620

attatcttga cgagatcatt gaacagattt cggagttcag taagcgcgtc atcctcgccg 4680

acgcgaattt ggataaggtt ctctcagcct acaacaagca ccgggacaag cctatcagag 4740

agcaggcgga aaatatcatt catctcttca ccctgacaaa ccttggggct cccgctgcat 4800

tcaagtattt tgacactacg attgatcgga agagatacac ttctacgaag gaggtgctgg 4860

atgcaaccct tatccaccaa tcgattactg gcctctacga gacgcggatc gacttgagtc 4920

agctcggggg ggataagaga ccagcggcaa ccaagaaggc aggacaagcg aagaagaaga 4980

agtagcaatt cggtacgctg aaatcaccag tctctctcta caaatctatc tctctctatt 5040

ttctccataa ataatgtgtg agtagtttcc cgataaggga aattagggtt cttatagggt 5100

ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact 5160

tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag tactaaaatc cagatctcct 5220

aaagtcccta tagatctttg tcgtgaatat aaaccagaca cgagacgact aaacctggag 5280

cccagacgcc gttcgaagct agaagtaccg cttaggcagg aggccgttag ggaaaagatg 5340

ctaaggcagg gttggttacg ttgactcccc cgtaggtttg gtttaaatat gatgaagtgg 5400

acggaaggaa ggaggaagac aaggaaggat aaggttgcag gccctgtgca aggtaagaag 5460

atggaaattt gatagaggta cgctactata cttatactat acgctaaggg aatgcttgta 5520

tttataccct atacccccta ataacccctt atcaatttaa gaaataatcc gcataagccc 5580

ccgcttaaaa attggtatca gagccatgaa taggtctatg accaaaactc aagaggataa 5640

aacctcacca aaatacgaaa gagttcttaa ctctaaagat aaaagatctt tcaagatcaa 5700

aactagagtc gacctgcagg catgcaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 5760

actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 5820

gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 5880

atggcgaatg ctagagcagc ttgagcttgg atcagattgt cgtttcccgc cttcagttta 5940

aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt 6000

agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtgc 6060

atgccaacca cagggttccc ctcgggatca aagtactttg atccaacccc tccgctgcta 6120

tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca gccgtcttct gaaaacgaca tgtcgcacaa 6180

gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct gcccttttcc tggcgttttc ttgtcgcgtg 6240

ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga ctagaaccgg agacattacg ccatgaacaa 6300

gagcgccgcc gctggcctgc tgggctatgc ccgcgtcagc accgacgacc aggacttgac 6360

caaccaacgg gccgaactgc acgcggccgg ctgcaccaag ctgttttccg agaagatcac 6420

cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc caggatgctt gaccacctac gccctggcga 6480

cgttgtgaca gtgaccaggc tagaccgcct ggcccgcagc acccgcgacc tactggacat 6540

tgccgagcgc atccaggagg ccggcgcggg cctgcgtagc ctggcagagc cgtgggccga 6600

caccaccacg ccggccggcc gcatggtgtt gaccgtgttc gccggcattg ccgagttcga 6660

gcgttcccta atcatcgacc gcacccggag cgggcgcgag gccgccaagg cccgaggcgt 6720

gaagtttggc ccccgcccta ccctcacccc ggcacagatc gcgcacgccc gcgagctgat 6780

cgaccaggaa ggccgcaccg tgaaagaggc ggctgcactg cttggcgtgc atcgctcgac 6840

cctgtaccgc gcacttgagc gcagcgagga agtgacgccc accgaggcca ggcggcgcgg 6900

tgccttccgt gaggacgcat tgaccgaggc cgacgccctg gcggccgccg agaatgaacg 6960

ccaagaggaa caagcatgaa accgcaccag gacggccagg acgaaccgtt tttcattacc 7020

gaagagatcg aggcggagat gatcgcggcc gggtacgtgt tcgagccgcc cgcgcacgtc 7080

tcaaccgtgc ggctgcatga aatcctggcc ggtttgtctg atgccaagct ggcggcctgg 7140

ccggccagct tggccgctga agaaaccgag cgccgccgtc taaaaaggtg atgtgtattt 7200

gagtaaaaca gcttgcgtca tgcggtcgct gcgtatatga tgcgatgagt aaataaacaa 7260

atacgcaagg ggaacgcatg aaggttatcg ctgtacttaa ccagaaaggc gggtcaggca 7320

agacgaccat cgcaacccat ctagcccgcg ccctgcaact cgccggggcc gatgttctgt 7380

tagtcgattc cgatccccag ggcagtgccc gcgattgggc ggccgtgcgg gaagatcaac 7440

cgctaaccgt tgtcggcatc gaccgcccga cgattgaccg cgacgtgaag gccatcggcc 7500

ggcgcgactt cgtagtgatc gacggagcgc cccaggcggc ggacttggct gtgtccgcga 7560

tcaaggcagc cgacttcgtg ctgattccgg tgcagccaag cccttacgac atatgggcca 7620

ccgccgacct ggtggagctg gttaagcagc gcattgaggt cacggatgga aggctacaag 7680

cggcctttgt cgtgtcgcgg gcgatcaaag gcacgcgcat cggcggtgag gttgccgagg 7740

cgctggccgg gtacgagctg cccattcttg agtcccgtat cacgcagcgc gtgagctacc 7800

caggcactgc cgccgccggc acaaccgttc ttgaatcaga acccgagggc gacgctgccc 7860

gcgaggtcca ggcgctggcc gctgaaatta aatcaaaact catttgagtt aatgaggtaa 7920

agagaaaatg agcaaaagca caaacacgct aagtgccggc cgtccgagcg cacgcagcag 7980

caaggctgca acgttggcca gcctggcaga cacgccagcc atgaagcggg tcaactttca 8040

gttgccggcg gaggatcaca ccaagctgaa gatgtacgcg gtacgccaag gcaagaccat 8100

taccgagctg ctatctgaat acatcgcgca gctaccagag taaatgagca aatgaataaa 8160

tgagtagatg aattttagcg gctaaaggag gcggcatgga aaatcaagaa caaccaggca 8220

ccgacgccgt ggaatgcccc atgtgtggag gaacgggcgg ttggccaggc gtaagcggct 8280

gggttgtctg ccggccctgc aatggcactg gaacccccaa gcccgaggaa tcggcgtgac 8340

ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag 8400

aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt 8460

gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc 8520

ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg 8580

atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt 8640

ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac 8700

gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga cctggtactg 8760

atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag 8820

cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg gcgagccgat 8880

ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt 8940

gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa 9000

gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg ggcggccgga gtacatcgag 9060

atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag gcaagaaccc ggacgtgctg 9120

acggttcacc ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg gccgttttct ctaccgcctg 9180

gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc 9240

agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca 9300

aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc 9360

atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg gttcctaatg tacggagcag 9420

atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat 9480

agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta cattgggaac 9540

ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa 9600

ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc 9660

tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg 9720

tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca 9780

aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca 9840

ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 9900

aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 9960

gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 10020

gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 10080

attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 10140

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 10200

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 10260

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 10320

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 10380

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 10440

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 10500

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 10560

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 10620

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 10680

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 10740

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 10800

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 10860

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 10920

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 10980

cgttaaggga ttttggtcat gcattctagg tactaaaaca attcatccag taaaatataa 11040

tattttattt tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt caaaaaatag ctcgacatac 11100

tgttcttccc cgatatcctc cctgatcgac cggacgcaga aggcaatgtc ataccacttg 11160

tccgccctgc cgcttctccc aagatcaata aagccactta ctttgccatc tttcacaaag 11220

atgttgctgt ctcccaggtc gccgtgggaa aagacaagtt cctcttcggg cttttccgtc 11280

tttaaaaaat catacagctc gcgcggatct ttaaatggag tgtcttcttc ccagttttcg 11340

caatccacat cggccagatc gttattcagt aagtaatcca attcggctaa gcggctgtct 11400

aagctattcg tatagggaca atccgatatg tcgatggagt gaaagagcct gatgcactcc 11460

gcatacagct cgataatctt ttcagggctt tgttcatctt catactcttc cgagcaaagg 11520

acgccatcgg cctcactcat gagcagattg ctccagccat catgccgttc aaagtgcagg 11580

acctttggaa caggcagctt tccttccagc catagcatca tgtccttttc ccgttccaca 11640

tcataggtgg tccctttata ccggctgtcc gtcattttta aatataggtt ttcattttct 11700

cccaccagct tatatacctt agcaggagac attccttccg tatcttttac gcagcggtat 11760

ttttcgatca gttttttcaa ttccggtgat attctcattt tagccattta ttatttcctt 11820

cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 11880

attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 11940

tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 12000

aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 12060

tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 12120

ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 12180

gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 12240

atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 12300

aatgtactga attaacgccg aattaattcg ggggatctgg attttagtac tggattttgg 12360

ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata catactaagg 12420

gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc ccttatctgg 12480

gaactactca cacattatta tggagaaact cgagcttgtc gatcgacaga tccggtcggc 12540

atctactcta tttctttgcc ctcggacgag tgctggggcg tcggtttcca ctatcggcga 12600

gtacttctac acagccatcg gtccagacgg ccgcgcttct gcgggcgatt tgtgtacgcc 12660

cgacagtccc ggctccggat cggacgattg cgtcgcatcg accctgcgcc caagctgcat 12720

catcgaaatt gccgtcaacc aagctctgat agagttggtc aagaccaatg cggagcatat 12780

acgcccggag tcgtggcgat cctgcaagct ccggatgcct ccgctcgaag tagcgcgtct 12840

gctgctccat acaagccaac cacggcctcc agaagaagat gttggcgacc tcgtattggg 12900

aatccccgaa catcgcctcg ctccagtcaa tgaccgctgt tatgcggcca ttgtccgtca 12960

ggacattgtt ggagccgaaa tccgcgtgca cgaggtgccg gacttcgggg cagtcctcgg 13020

cccaaagcat cagctcatcg agagcctgcg cgacggacgc actgacggtg tcgtccatca 13080

cagtttgcca gtgatacaca tggggatcag caatcgcgca tatgaaatca cgccatgtag 13140

tgtattgacc gattccttgc ggtccgaatg ggccgaaccc gctcgtctgg ctaagatcgg 13200

ccgcagcgat cgcatccata gcctccgcga ccggttgtag aacagcgggc agttcggttt 13260

caggcaggtc ttgcaacgtg acaccctgtg cacggcggga gatgcaatag gtcaggctct 13320

cgctaaactc cccaatgtca agcacttccg gaatcgggag cgcggccgat gcaaagtgcc 13380

gataaacata acgatctttg tagaaaccat cggcgcagct atttacccgc aggacatatc 13440

cacgccctcc tacatcgaag ctgaaagcac gagattcttc gccctccgag agctgcatca 13500

ggtcggagac gctgtcgaac ttttcgatca gaaacttctc gacagacgtc gcggtgagtt 13560

caggcttttt catatctcat tgccccccgg gatctgcgaa agctcgagag agatagattt 13620

gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata 13680

gaggaaggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca gtggagatat 13740

cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc 13800

tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttga acgatagcct 13860

ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc cttttctact gtccttttga 13920

tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt 13980

gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattc ttggagtaga 14040

cgagagtgtc gtgctccacc atgttatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg 14100

gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt 14160

cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggtgc 14220

caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat agctgggcaa tggaatccga 14280

ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg tcttctgaga 14340

ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg ttggcaagct 14400

gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 14460

gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 14520

gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 14580

aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acg 14633

<210> 7

<223> ATG9-2-g++引物

<400> 7

ggcagagtgg aagcgctcga gtc 23

<210> 8

<223> ATG9-2-g--引物

<400> 8

aaacgactcg agcgcttcca ctc 23

<210> 9

<223> pC1300-F

<400> 9

acactttatg cttccggctc 20

<210> 10

<223> ATG9-F

<400> 10

ggctacttca tggagaagac tt 22

<210> 11

<223> ATG9-R

<400> 11

ttcgagatct gtaaccttga ga 22

<210> 12

<223> ATG9-cGFP-F

<400> 12

ggggtaccat gatgtccttc cttccgaag 29

<210> 13

<223> ATG9-cGFP-R

<400> 13

ttgctcacca tagcggccgc aactgggtca ctgcttctag 40

<210> 14

<223> HYG-F

<400> 14

aagatgttgg cgacctcgta ttgg 24

<210> 15

<223> HYG-R

<400> 15

gatcgttatg tttatcggca ctttgc 26

<210> 16

<223> T7

<400> 16

taatacgactcactatagg 19

<210> 17

<223> T3

<400> 17

attaaccctcactaaaggga 20