一种动物肝外胆道恶性狭窄模型的建立方法

技术领域

本发明涉及动物模型技术领域，特别涉及一种动物肝外胆道恶性狭窄模型的建立方法。

背景技术

肝外胆道恶性狭窄是临床的多发疾病，最常见的病因为胆管细胞癌和胰腺癌，其他包括原发性肝癌、转移瘤、壶腹癌等。肝外胆道恶性狭窄可导致胆道梗阻，进一步导致黄疸、皮肤瘙痒、肝功能受损等一系列症状、体征和并发症。及时解除梗阻以及治疗侵入胆管的肿瘤是提高患者生存期和改善生存质量的关键之一。经皮经肝胆道引流术、胆道支架植入术、胆道肿瘤消融术等介入诊疗是肝外胆道恶性狭窄重要的治疗方法。肝外胆道恶性狭窄的病理生理的研究、新型介入器材、诊疗方法等的研发依赖于合适的动物模型。然而，目前常用的肝外胆道恶性狭窄模型多为小鼠、大鼠等啮齿类小动物模型，难以适用于评估新型介入诊疗方法的评估；而兔等较大动物的模型主要由机械性损伤、夹闭等造成，不符合临床实际发病的病理生理基础。

目前的胆管梗阻的动物模型主要有机械性梗阻性黄疸动物模型和药物诱发的胆管肿瘤动物模型。其中，机械性梗阻性黄疸动物模型绝大多数采用结扎、机械损伤或药物损伤动物胆管导致胆管狭窄闭塞以及梗阻性黄疸。然而由于是外力的急性、机械性损伤导致的胆管狭窄，并非肿瘤侵犯所导致的慢性、胆管腔内的胆管狭窄，与现实中因胆管肿瘤导致的梗阻性黄疸患者的病理基础并不相似，并不能完全模拟现实中因胆管肿瘤导致的梗阻性黄疸。此外，药物诱发的胆管肿瘤动物模型采用的是致癌物诱发或者质粒转染方法诱发胆管肿瘤的动物模型。此类模型存在动物模型成瘤率低、动物成瘤后很难产生伴有梗阻性黄疸的状态等缺点。

因此，如何开发一种能完全模拟现实中因恶性肿瘤导致的梗阻性黄疸、并且简便易行、成功率高的肝外胆道恶性狭窄的模型，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种动物肝外胆道恶性狭窄模型的建立方法，该模型能完全模拟现实中因恶性肿瘤导致的梗阻性黄疸，并且简便易行、成功率高，动物成瘤后能产生伴有梗阻性黄疸的状态。

为了实现上述目的，本发明实施例提供一种动物肝外胆道恶性狭窄模型的建立方法，所述方法包括：

获得肿瘤组织团块，后将所述肿瘤组织团块裁剪获得条形肿瘤组织；

将受体动物的腹腔打开并分离和显露出肝外胆管；

将所述条形肿瘤组织和条形固定件均与所述肝外胆管中的胆总管平行放置并捆绑，后抽出所述条形固定件，缝合所述受体动物的腹腔并消毒包扎，后待所述条形肿瘤组织生长使得所述受体动物的胆管狭窄或闭塞形成梗阻性黄疸，获得动物肝外胆道恶性狭窄模型。

进一步地，所述获得肿瘤组织团块，包括：

获得患有肿瘤的供体动物；所述患有肿瘤的供体动物中的肿瘤包括肿瘤细胞或肿瘤组织皮下接种的、天然发生的、基因修饰改造后自发的和致癌物诱发性的中的一种；

从所述患有肿瘤的供体动物中分离获得肿瘤组织团块。

进一步地，所述从患有肿瘤的供体动物中分离，获得肿瘤组织团块，具体包括：

将肿瘤细胞或肿瘤组织接种于供体动物的腹股沟区皮下以进行增殖生长，后进行分离，获得肿瘤组织团块。

进一步地，所述肿瘤细胞的接种量为≥1×10

进一步地，所述增殖生长的时间为2-6周。

进一步地，所述条形肿瘤组织的宽度为0.8-1.2mm，长度为9-11mm。

进一步地，所述将受体动物的腹腔打开并分离和显露出肝外胆管，具体包括：

将受体动物经耳缘静脉全麻并仰卧位固定，打开腹腔，并分离和显露出肝外胆管。

进一步地，所述条形固定件包括24G留置针鞘管或直径范围为1mm-8mm的硬质和软质管中的一种。

进一步地，所述肿瘤组织团块生长至所述受体动物的胆管或狭窄闭塞形成梗阻性黄疸包括：

所述肿瘤组织团块种植2周后起，每周进行影像学和/或血清学检查，以监测肿瘤生长情况直至所述受体动物的胆管狭窄或闭塞形成梗阻性黄疸。

进一步地，所述抽出所述条形固定件中，维持肝外胆管与所述肿瘤组织团块的捆绑状态。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明实施例提供的一种动物肝外胆道恶性狭窄模型的建立方法，所述方法包括：获得肿瘤组织团块，后将所述肿瘤组织团块裁剪获得条形肿瘤组织；将受体动物的腹腔打开并分离和显露出肝外胆管；将所述条形肿瘤组织和条形固定件均与所述肝外胆管中的胆总管平行放置并一同固定捆绑，后抽出所述条形固定件，缝合所述受体动物的腹腔并消毒包扎，后待所述条形肿瘤组织生长使得所述受体动物的胆管狭窄或闭塞形成梗阻性黄疸，获得动物肝外胆道恶性狭窄模型。本发明实施例建立模型时，采用肿瘤组织和条形固定件同时固定于肝总管，移除条形固定物，肿瘤与胆管贴合并生长浸润，导致胆管阻塞，将肿瘤绑于胆管，等肿瘤生长侵犯胆管，可以形成胆管肿瘤且结扎胆管时，使用条形固定件保护，保留胆管通畅，保证后续胆管狭窄为肿瘤侵犯导致。该方法可以同时兼具胆管肿瘤与梗阻性黄疸两种因素，非常贴近临床中因胆管肿瘤导致梗阻性黄疸的患者情况，简便易行、能完全模拟现实中因胆管肿瘤导致的梗阻性黄疸，且动物模型成瘤率高、动物成瘤后能产生伴有梗阻性黄疸的状态。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例提供的一种动物肝外胆道恶性狭窄模型的建立方法的流程图；

图2为正常兔的胆管、十二指肠解剖结构；

图3为本发明实施例动物模型建立中将条形肿瘤组织和条形固定件同时与所述肝外胆管中的胆总管平行放置并固定的示意图；

图4为本发明实施例动物模型抽出所述条形固定件后的示意图；

图5为本发明实施例动物模型成功建立示意图；

其中，图2-图5中，1-胆囊，2-右肝管，3-左肝管，4-胆囊管，5-肝门部，6-胆总管，7-壶腹部，8-十二指肠，9-肿瘤块，10-绑线，11-条形固定件。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

本发明实施例提供一种动物肝外胆道恶性狭窄模型的建立方法，总体思路如下：

根据本发明实施例一种典型的实施方式，提供一种动物肝外胆道恶性狭窄模型的建立方法，如图1所示，所述方法包括：

S1、获得肿瘤组织团块，后将所述肿瘤组织团块裁剪获得条形肿瘤组织；

具体地，从患有肿瘤的供体动物中分离出获得肿瘤组织团块；

该供体动物包括但不限于兔形目动物；也可包括猪、鼠类、犬、灵长类等实验动物；

所述患有肿瘤的供体动物中的肿瘤包括肿瘤细胞或肿瘤组织皮下接种的、天然发生的、基因修饰改造后自发的和致癌物诱发性的中的一种。

作为一种可选的实施方式，所述步骤S1中具体包括：

将肿瘤细胞或肿瘤组织接种于供体动物腹股沟区皮下以进行增殖生长，后进行分离，获得肿瘤组织团块。

所述肿瘤细胞的接种量为≥1×10

所述增殖生长的时间为3-6周。接种后约3周后腹股沟区肿瘤组织可增长至直径约2cm。

S2、将受体动物的腹腔打开并分离和显露出肝外胆管；

该受体动物包括但不限于兔形目动物；也可包括猪、鼠类、犬、灵长类等实验动物；

如图2所示，胆管包含胆总管及左右肝总管等所有胆管束；

该实施方式中，打开腹腔的具体操作为：将受体动物经静脉全麻并仰卧位固定，打开腹腔。

S3、将所述条形肿瘤组织和条形固定件均与所述肝外胆管中的胆总管平行放置并捆绑(如图3所示)，后抽出所述条形固定件(如图4所示)、缝合所述受体动物的腹腔并消毒包扎，后所述条形肿瘤组织生长至所述受体动物的胆管狭窄闭塞形成梗阻性黄疸(如图5所示)，获得动物肝外胆道恶性狭窄模型。

将所述肿瘤组织团块裁剪成条形肿瘤组织后接种于受体动物的原因为：条形使肿瘤组织团块在胆管周围生长并逐渐侵犯胆管，形成肿瘤生长浸润侵犯胆管，其他形状不利于固定肿瘤组织团块；

将瘤块捆绑固定于肝外胆管中的胆总管，且与胆总管平行设置的原因为留下固定的空间，避免因完全结扎导致机械性胆管阻塞，若不平行可能会导致完全结扎胆管或者条形固定件在结扎后无法取出；将瘤块捆绑固定于肝外胆管中除胆总管外的其他部位有无法形成侵犯胆管的不利影响；

条形固定件的作用：固定时可帮助保留胆管通畅，保证后续胆管狭窄为肿瘤侵犯导致，能完全模拟现实中因胆管肿瘤导致的梗阻性黄疸。

所述捆绑中采用可吸收缝线；可吸收缝线是指在手术缝合当中植入人体组织后，能够被人体组织降解吸收，并且是不用拆线的一类新型复合材料。

作为一种可选的实施方式，所述条形肿瘤组织的宽度为0.8-1.2mm，长度为9-11mm。将所述肿瘤组织团块裁剪成该尺寸范围的条形肿瘤组织的原因：尺寸过大肿瘤组织团块生长过快导致试验动物过早死亡，容易导致建模失败；尺寸过小，肿瘤组织团块无法固定，容易脱落；

作为一种可选的实施方式，所述条形固定件包括24G留置针鞘管、或类直径范围为1mm-8mm的硬质、软质管中的一种，以与所选取实验动物肝外正常胆管的直径相近为佳。本发明实施方式采用24G留置针鞘管的优点为粗细适合，鞘管材质柔软，材料易得；

所述抽出所述条形固定件中维持肝外胆管与所述肿瘤组织团块的捆绑状态。具体可采用组织胶或明胶海绵片等以防止或减少肿瘤组织移位。组织胶可以将肿瘤组织团块与周边组织结构黏连，防止或减少移位。明胶海绵片为止血材料，可以将肿瘤组织团块与周边组织结构黏连，防止或减少移位。

所述肿瘤组织团块自种植2周后起每周进行影像学和/或血清学检查，以监测肿瘤生长情况直至所述受体动物的胆管狭窄闭塞形成梗阻性黄疸。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种动物肝外胆道恶性狭窄模型的建立方法进行详细说明。

实施例1

S1、从患有肿瘤的供体兔中分离，获得肿瘤组织团块，具体地：

经耳缘静脉全麻实验动物，取仰卧位将实验动物四肢固定于手术台，腹股沟部位备皮，消毒铺巾，将兔肿瘤细胞VX2或肿瘤组织接种于兔腹股沟区皮下(接种量为10

S2、将受体兔的腹腔打开并分离和显露出肝外胆管，具体地：经耳缘静脉全麻实验动物，取仰卧位将固定于手术台，上腹部备皮，消毒铺巾，以正中切口打开腹腔，分离和显露肝外胆管。

S3、将所述条形肿瘤组织和24G留置针的鞘管沿胆管走形，平行置于胆管，以缝线将瘤块和鞘管以适当的松紧度固定于与胆管，注意防止过松导致瘤块移位，或过紧引起结扎导致的胆管狭窄。抽出24G留置针鞘管，维持胆管与瘤块捆绑状态，此步可采用组织胶或明胶海绵片等以防止或减少肿瘤组织移位。逐层缝合腹腔，消毒包扎。种植2周后起每周行影像学检查，以监测肿瘤生长情况以及胆管狭窄闭塞形成梗阻性黄疸。

实施例2

S1、从患有肿瘤的供体兔中分离，获得肿瘤组织团块，具体地：

经耳缘静脉全麻实验动物，取仰卧位将实验动物四肢固定于手术台，腹股沟部位备皮，消毒铺巾，将兔肿瘤细胞VX2肿瘤细胞或肿瘤组织接种于兔腹股沟区皮下(接种量为10

S2、将受体兔的腹腔打开并分离和显露出肝外胆管，具体地：经耳缘静脉全麻实验动物，取仰卧位将固定于手术台，上腹部备皮，消毒铺巾，以正中切口打开腹腔，分离和显露肝外胆管。

S3、将所述条形肿瘤组织和24G留置针的鞘管沿胆管走形，平行置于胆管，以缝线将瘤块和鞘管以适当的松紧度固定于与胆管，注意防止过松导致瘤块移位，或过紧引起结扎导致的胆管狭窄。抽出24G留置针鞘管，维持胆管与瘤块捆绑状态，此步可采用组织胶或明胶海绵片等以防止或减少肿瘤组织移位。逐层缝合腹腔，消毒包扎。种植2周后起每周行影像学检查，以监测肿瘤生长情况以及胆管狭窄闭塞形成梗阻性黄疸。

实施例3

S1、从患有肿瘤的供体兔中分离，获得肿瘤组织团块，具体地：

经耳缘静脉全麻实验动物，取仰卧位将实验动物四肢固定于手术台，腹股沟部位备皮，消毒铺巾，将兔肿瘤细胞VX2肿瘤细胞或肿瘤组织接种于兔腹股沟区皮下(接种量为10

S2、将受体兔的腹腔打开并分离和显露出肝外胆管，具体地：经耳缘静脉全麻实验动物，取仰卧位将固定于手术台，上腹部备皮，消毒铺巾，以正中切口打开腹腔，分离和显露肝外胆管。

S3、将所述条形肿瘤组织和24G留置针的鞘管沿胆管走形，平行置于胆管，以缝线将瘤块和鞘管以适当的松紧度固定于与胆管，注意防止过松导致瘤块移位，或过紧引起结扎导致的胆管狭窄。抽出24G留置针鞘管，维持胆管与瘤块捆绑状态，此步可采用组织胶或明胶海绵片等以防止或减少肿瘤组织移位。逐层缝合腹腔，消毒包扎。种植2周后起每周行影像学检查，以监测肿瘤生长情况以及胆管狭窄闭塞形成梗阻性黄疸。

对比例1

对比例1为现有技术中采用外力导致的急性、机械性、胆管腔外胆管狭窄的动物模型。

对比例2

该对比例为现有技术中采用致癌物诱发或者质粒转染方法诱发胆管肿瘤的动物模型。

对比例3

该对比例中不采用条形固定件，其余步骤均同实施例1。

实验例1

统计实施例1-3和对比例1-3的优缺点如表1所示：

表1

由表1的数据可知：

对比例1中，由于是外力导致的急性、机械性、胆管腔外的胆管狭窄，不能完全模拟现实中因胆管肿瘤导致的梗阻性黄疸；

对比例2中，药物诱发的胆管肿瘤动物模型成瘤率低至50％；

对比例3中，接种固定时未采用条形固定件，不能完全模拟现实中因胆管肿瘤导致的梗阻性黄疸；

实施例1-实施例3中，简便易行、能完全模拟现实中因胆管肿瘤导致的梗阻性黄疸、动物模型成瘤率高，成瘤率范围为90-100％、动物成瘤后能产生伴有梗阻性黄疸的状态。

综上可知，本发明实施例提供的一种兔肝外胆道恶性狭窄模型的建立方法，非常贴近临床中因肝外胆管肿瘤导致梗阻性黄疸的患者，简便易行、能完全模拟现实中因胆管肿瘤导致的梗阻性黄疸，且动物模型成瘤率高、动物成瘤后能产生伴有梗阻性黄疸的状态；该动物模型方法的建立，能够获得适合的大动物模型以进行进一步实验研究，能够更好地指导诊治肝癌胆管恶性狭窄。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。