公开/公告号CN113101302A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-07-13
原文格式PDF
申请/专利权人 河南省银丰生物工程技术有限公司;银丰生物工程集团有限公司;
申请/专利号CN202110206410.1
申请日2021-02-24
分类号A61K35/28(20150101);A61P3/10(20060101);
代理机构32215 南京君陶专利商标代理有限公司;
代理人严海晨
地址 450000 河南省郑州市高新技术产业开发区长椿路11号
入库时间 2023-06-19 11:50:46
技术领域
本发明涉及一种自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法，具体为一种自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法，属于糖尿病研究技术领域。
背景技术
糖尿病的病程长，药物依赖性强，并且会引发多种并发症，严重影响人们的生活质量，是亟待解决的一大难题，糖尿病是一种严重威胁人类健康和生命的代谢性疾病，目前已成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大疾病。虽然糖尿病的病因和发病机制目前还不十分清楚，但胰岛β细胞功能进行性衰竭是目前公认的发病重要环节和决定因素。因此，替代和恢复胰岛β细胞功能成为治疗糖尿病的必然选择，近年来，虽然胰岛素的剂型和给药途径有了显著进展，但临床实践证明，外源性胰岛素治疗不能像自身分泌胰岛素那样精确的控制血糖，且糖尿病肾病和视网膜病变等慢性并发症却逐渐成为糖尿病患者致死、致残的主要原因。因此，胰岛细胞移植又逐渐成为研究者的关注点。
查阅文献资料得知，干细胞研究的理论和实验技术得到了进一步的发展，通过自体移植同时避免了供体缺乏和免疫排斥两大难题，并且有报道显示，体外实验中胰岛细胞的移植能够有效降低血糖和减少并发症的发生，MSCs体外向胰岛样细胞的诱导分化，及其移植后对糖尿病大鼠的治疗效果，为临床上糖尿病的治疗提供依据。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决问题而提供一种自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法，包括以下步骤：
步骤一、人MSCs体外诱导为胰岛样细胞团，取传代至第3代的人MSCs，待细胞融合至70%-80%后，换用含10ug/L碱性成纤维细胞生长因子、尼克酰胺的DMEM高糖培养基进行诱导分化；
步骤二、双硫腙染色，取双硫腙粉末10mg溶于1mL二甲基亚砜中，配成储备液，-20℃保存备用；
步骤三、大鼠糖尿病模型的制备，包括以下过程：
（1）、将0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH4.5）将链脲佐菌素制成2%注射液，待大鼠空腹12h后，经腹腔注射70mg/Kg链脲佐菌素和0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液；
（2）、大鼠分别于注射前、注射后48h、5d、8d空腹断尾采血，测定全血血糖浓度；
（3）、大鼠血糖浓度正常值为2.80-7.56mmol/L，选用连续2次血糖浓度高于16.7mmol/L的大鼠作为糖尿病模型。
步骤四、胰岛样细胞团的移植，造模后，胰岛样细胞组大鼠于肾被膜下移植入胰岛样细胞2*106个，间充质干细胞组大鼠于肾被膜下移植入未诱导的脐带间充质干细胞2*106个，模型对照组大鼠于肾被膜下移植不含任何细胞的培养液1mL，各组大鼠均于移植前及移植后48h测定空腹血糖浓度，之后每周定点测空腹血糖及体质量1次；
步骤五、胰腺组织免疫组化检测，胰腺取出后，迅速放入甲醛溶液中，固定3h后常规免疫组化法染色，酶修复30min，加羊抗鼠一抗过夜，次日二康修复；
步骤六、统计学方法分析。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤一中，诱导前，MSCs呈长梭形，贴壁生长。诱导4d后，细胞向中央聚集，同时出现胰岛样细胞团。诱导7d的胰岛样细胞团经双硫腙染色15min后，倒置显微镜下可见细胞团多数细胞着色，呈现棕红色阳性表达，周边有少数细胞不着色。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中，双硫腙临用时用PBS缓冲液1：100稀释，0.22μm孔径滤膜过滤。于倒置显微镜下加入到随机挑选的诱导后的胰岛样细胞团，置37℃孵育箱中孵育15min，PBS洗3次，镜检。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤三中，造模前各组大鼠空腹血糖浓度均处于正常范围内。腹腔注射链脲菌素48h后，大鼠血糖浓度迅速升高。注射后第5天和第8天，大鼠血糖浓度均大于16.7mmol/L，证明建模成功。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中，胰岛团细胞移植后2周，胰岛样细胞组大鼠血糖浓度明显降低，且胰岛素分泌增加，一直维持至第6周。间充质干细胞组大鼠血糖浓度在移植后有所下降，胰岛素分泌有所增加，至移植后第4周胰岛素分泌减少，之后维持较低水平。正常对照组一直处于糖尿病血糖状态，且无胰岛素分泌。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，在进行胰腺组织免疫组化检测时，利用苏木精复染，SABC试剂盒显色。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤六中，采用SPSS软件进行统计学分析。
本发明的有益效果是：该自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法设计合理，本研究使我们认识到自体MSCs在经过诱导分化后，可以转化成为胰岛样细胞团，胰岛样细胞团在移植后具有一定的胰岛素分泌功能，能达到治疗糖尿病的目的。这些都为间充质干细胞移植应用于临床上糖尿病的治疗提供了实验基础，并有望使其成为一种更简便、经济、有效的治疗的手段。
附图说明
图1为本发明流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，一种自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法，包括以下步骤：
步骤一、人MSCs体外诱导为胰岛样细胞团，取传代至第3代的人MSCs，待细胞融合至70%-80%后，换用含10ug/L碱性成纤维细胞生长因子、尼克酰胺的DMEM高糖培养基进行诱导分化；
步骤二、双硫腙染色，取双硫腙粉末10mg溶于1mL二甲基亚砜中，配成储备液，-20℃保存备用；
步骤三、大鼠糖尿病模型的制备，包括以下过程：
（1）、将0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH4.5）将链脲佐菌素制成2%注射液，待大鼠空腹12h后，经腹腔注射70mg/Kg链脲佐菌素和0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液；
（2）、大鼠分别于注射前、注射后48h、5d、8d空腹断尾采血，测定全血血糖浓度；
（3）、大鼠血糖浓度正常值为2.80-7.56mmol/L，选用连续2次血糖浓度高于16.7mmol/L的大鼠作为糖尿病模型；
步骤四、胰岛样细胞团的移植，造模后，胰岛样细胞组大鼠于肾被膜下移植入胰岛样细胞2*106个，间充质干细胞组大鼠于肾被膜下移植入未诱导的脐带间充质干细胞2*106个，模型对照组大鼠于肾被膜下移植不含任何细胞的培养液1mL，各组大鼠均于移植前及移植后48h测定空腹血糖浓度，之后每周定点测空腹血糖及体质量1次；
步骤五、胰腺组织免疫组化检测，胰腺取出后，迅速放入甲醛溶液中，固定3h后常规免疫组化法染色，酶修复30min，加羊抗鼠一抗过夜，次日二康修复；
步骤六、统计学方法分析。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤一中，诱导前，MSCs呈长梭形，贴壁生长。诱导4d后，细胞向中央聚集，同时出现胰岛样细胞团。诱导7d的胰岛样细胞团经双硫腙染色15min后，倒置显微镜下可见细胞团多数细胞着色，呈现棕红色阳性表达，周边有少数细胞不着色。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤二中，双硫腙临用时用PBS缓冲液1：100稀释，0.22μm孔径滤膜过滤。于倒置显微镜下加入到随机挑选的诱导后的胰岛样细胞团，置37℃孵育箱中孵育15min，PBS洗3次，镜检。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤三中，造模前各组大鼠空腹血糖浓度均处于正常范围内。腹腔注射链脲菌素48h后，大鼠血糖浓度迅速升高。注射后第5天和第8天，大鼠血糖浓度均大于16.7mmol/L，证明建模成功。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤四中，胰岛团细胞移植后2周，胰岛样细胞组大鼠血糖浓度明显降低，且胰岛素分泌增加，一直维持至第6周。间充质干细胞组大鼠血糖浓度在移植后有所下降，胰岛素分泌有所增加，至移植后第4周胰岛素分泌减少，之后维持较低水平。正常对照组一直处于糖尿病血糖状态，且无胰岛素分泌。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤五中，在进行胰腺组织免疫组化检测时，利用苏木精复染，SABC试剂盒显色。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤六中，采用SPSS软件进行统计学分析。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
机译： 化合物，其制备方法，药物组合物，抑制二肽基肽酶-iv的方法，用于治疗由抑制二肽基肽酶-iv介导的疾病，提高的胰岛新生，b细胞存活和胰岛素生物合成的疾病的患者治疗或控制糖尿病，高血糖，肥胖，胰岛素抵抗，一种或多种疾病，动脉粥样硬化，哺乳动物患者的一种或多种疾病，中性粒细胞减少和贫血的一种或多种疾病，以治疗或控制生长激素缺乏症和艾滋病毒感染在哺乳动物患者中，调节哺乳动物患者的免疫反应，减少精子运动，并产生药物组合物，以及药物组合
机译： 化合物或其药学上可接受的盐，药物组合物和在需要其的哺乳动物中抑制二肽基肽酶-iv酶的活性的方法，以在需要其的哺乳动物中治疗糖尿病，以治疗非胰岛素依赖型糖尿病（类型2）。 2）在有需要的哺乳动物中，在有需要的哺乳动物中治疗高血糖症，在有需要的哺乳动物中治疗肥胖症，治疗一种或多种选自血脂异常，高脂血症，高甘油三酯血症的脂质疾病，高胆固醇血症，需要治疗的哺乳动物中的低hdl和高ldl，以及在需要一种或多种疾病的哺乳动物中进行治疗
机译： 化合物，药物组合物，化合物的用途，用于治疗hpparso介导的疾病或状况，降低患者体内甘油三酸酯，治疗2型糖尿病，降低患者胰岛素抵抗或降低血压，病人体内的纤维蛋白原水平，以降低病人的ldlc并将病人的小致密ldl改变为正常致密ldl的粒径，并使用hpparso激动剂
