一种胰腺神经内分泌肿瘤复发预测系统、方法、终端及介质

技术领域

本发明属于医学信息处理技术领域，尤其涉及一种胰腺神经内分泌肿瘤复发预测系统、方法、终端及介质。

背景技术

目前，胰腺神经内分泌肿瘤是一种罕见且异质性较大的一组胰腺肿瘤，该肿瘤认为是起源于神经内分泌细胞，可以根据肿瘤细胞是否可以异常产生分泌具有生物学功能的激素分为功能性和非功能性两种类型[1]。然后胰腺神经内分泌肿瘤的发病率在这近20年内有所上升，至1/100000每年[2]。这部分原因是影像技术的广泛应用于临床实践。由于大多数胰腺神经内分泌肿瘤是非功能性的，属于那种无症状，所以很多患者在诊断时已经处于一个晚期，约21％的患者初诊时已经是局部高级别或发生转移[2]。

目前，针对胰腺神经内分泌肿瘤手术依然是推荐的最主要的治疗方式[3]。对于胰腺神经内分泌肿瘤患者来说，其中最重要的一个话题就是术后是否复发。但是，胰腺神经内分泌肿瘤术后的临床结局差异极大，无复发生存时间从0.96月到129.1月不等[4]。且现在最常用在临床实践中的分级方法是WHO的分类方法(如下表)，WHO2017版根据肿瘤的增殖指数和形态学将胰腺神经内分泌肿瘤分为3个级别[5]。然而，即使是相同级别的肿瘤其临床结局差异很大，即使低级别的肿瘤也可能会复发，尤其是G2期肿瘤[6]。这种以形态学病理为基础的WHO分级导致部分胰腺神经内分泌肿瘤患者的过度治疗或治疗不足。因此，对于胰腺神经内分泌肿瘤来说，急需一个更加有效且实用的预测复发风险的模型。

m6A RNA甲基化是mRNA转录后表观修饰的最常见的形式，大约占到RNA修饰方式的百分之六十[7]。m6A甲基化和免疫应答、干细胞分化、胚胎发育以及微小RNA(miRNA)的成熟加工是密切相关[8]。根据目前的大量研究表明，m6A甲基化在多种肿瘤的发生发展中也起到极大的作用。m6A甲基化过程是受到各种调控因子的调节，包括了甲基化转移酶(METTL3,METTL14,METTL16,KIAA1429,WTAP,RBM15)，去甲基化酶(FTO和ALKBH5)，以及识别甲基化结合位点的蛋白(YTHDC1,YTHDC2,YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3,HNRNPC,IGF2BP2)[9]。越来越多证据表明这些m6A调控因子在肿瘤的预后和进展中发挥极大的作用。如METTL3可以通过依赖于调控YTHDF2的方式降解SOCS2mRNA从而促进肝细胞肝癌的增殖和迁移[10]。在结直肠癌中，YTHDF1上调和不良预后有关[11]。另外，低水平的FTO在肝内胆管癌中是预后不良的一个提示[12]。以及FTO高表达常常发生在急性髓系白血病患者中，FTO可以抑制白血病细胞的分化[13]。m6A甲基化调控因子的作用是极大的。其中，YTHDF2在肝癌、前列腺癌以及胰腺癌中均有表达[14-16]，且高表达均与不良预后有关。然而，m6A甲基化调控因子YTHDF2在胰腺神经内分泌肿瘤中的预后意义还未明确,以及是否可以联合一些常见的胰腺神经内分泌肿瘤的临床参数建立一个更加准确且实用的用于预测胰腺神经内分泌肿瘤复发的预后模型，这是有待开发的。

文献的出处：

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通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有技术中，胰腺神经内分泌肿瘤的复发预测数据准确性差，不能为精准治疗和个体化治疗提供数据支持。现有技术的预测方法客观和简洁性效果差。目前国际及国内尚无相关的专利及文献报道。

(2)现有技术中，主要依据病理医生对肿瘤形态学的主观判断，主观性很强，与病理医生个人的经验很相关，可重复性差。

解决以上问题及缺陷的意义为：

本发明的目的是基于YTHDF2评分及病理参数的综合评分，建立一种客观的、临床可行的、重复性高的综合风险模型，用来预测胰腺神经内分泌肿瘤的复发风险，用于指导胰腺神经内分泌肿瘤的分层治疗。期待新的模型能够更加客观、更加精准地预测患者的复发，方便精确指导术后检测，可以更好平衡随着随访时间的增加所导致影响检查的放射性的损害以及带来的经济负担和实际所获的效应，可从而避免检查及治疗过度和治疗不足，达到精准治疗和个体化治疗的目的。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种胰腺神经内分泌肿瘤复发预测系统、方法、终端及介质。本发明提供一种判断胰腺神经内分泌肿瘤术后复发风险的预测模型，该预后模型是基于胰腺神经内分泌肿瘤大小、YTHDF2评分及肿瘤淋巴结转移与否的综合风险评分系统，可以预测胰腺神经内分泌肿瘤患者术后的复发风险。

本发明是这样实现的，一种胰腺神经内分泌肿瘤复发预测系统，应用于信息数据处理终端，所述胰腺神经内分泌肿瘤复发预测系统包括：

胰腺神经内分泌肿瘤信息确定模块，用于利用组织学的方法确定胰腺神经内分泌肿瘤的淋巴结情况以及准确测量肿瘤最大径；

肿瘤细胞表达量评分确定模块，用于利用免疫组化的方法检测肿瘤细胞中YTHDF2的表达，确定表达量评分；

胰腺神经内分泌肿瘤转移指标获取模块，用于综合肿瘤大小、YTHDF2表达量评分及胰腺神经内分泌肿瘤淋巴结是否发生转移建立复发风险分层的TNY模型，并根据肿瘤大小、YTHDF2表达量评分及胰腺神经内分泌肿瘤淋巴结是否发生转移三个指标的情况分为低危、中危和高危三组，从而判断胰腺神经内分泌肿瘤的复发风险。

本发明的另一目的在于提供一种胰腺神经内分泌肿瘤复发预测方法，应用于信息数据处理终端，所述胰腺神经内分泌肿瘤复发预测方法包括：

步骤一，YTHDF2评分：利用免疫组织化学的方法检测YTHDF2在胰腺神经内分泌肿瘤中的表达；

步骤二，获取肿瘤大小的测量数据：确定肿瘤的边界，以最大径作为代表肿瘤的大小，以厘米作为单位，2.5cm作为肿瘤大小的界值；

步骤三，淋巴结状态的判定：对于清扫的淋巴结，然后进行福尔马林固定，石蜡包埋，然后对淋巴结标本进行苏木素伊红(HE)染色，判断是否有肿瘤转移侵犯淋巴结组织；

步骤四，构建复发风险的分层系统。

进一步，所述步骤一YTHDF2的评估包括：根据免疫组化染色强度分为0(阴性)、1(弱阳性)、2(中等强度阳性)、3(强阳性)；记录阳性肿瘤细胞的百分比；最后得分为两部分的乘积，即得到为0-300的定量的评分，如果评分≤60视为YTHDF2低表达，评分＞60视为YTHDF2高表达。

进一步，所述步骤三淋巴结状态的判定包括：

1)先判读淋巴结状态：有淋巴结转移的进行肿瘤大小的分类，无淋巴结转移的直接进行YTHDF2的分类；

2)如果有淋巴结转移也有肿瘤小于2.5厘米，此时得到淋巴结转移且肿瘤＜2.5厘米这种特征；

3)如果有淋巴结转移也有肿瘤大小大于等于2.5厘米，进一步根据YTHDF2的表达分类，此时得到两种类型的特征：淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2低表达、淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2高表达；

4)如果无淋巴结转移，直接根据YTHDF2的表达分类，得到淋巴结未转移且YTHDF2低表达、淋巴结未转移且YTHDF2高表达两种特征。

进一步，所述复发风险的分层系统包括：

复发风险分级低危层，用于淋巴结未转移且YTHDF2高表达；

复发风险分级中危层，用于淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2低表达、淋巴结为转移且YTHDF2低表达；

复发风险分级高危层，用于淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2高表达、淋巴结转移且肿瘤＜2.5厘米。

进一步，所述步骤四构建复发风险的分层系统后，还需进行统计分析，包括：利用R语言绘制TNY模型的生存曲线、比较TNY模型的C指数，以及绘制时间依赖的ROC曲线和计算曲线下面积。

本发明的另一目的在于提供一种计算机设备，所述计算机设备包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，所述计算机程序被所述处理器执行时，使得所述处理器执行如下步骤：

YTHDF2评分：利用免疫组织化学的方法检测YTHDF2在胰腺神经内分泌肿瘤中的表达；

获取肿瘤大小的测量数据：确定肿瘤的边界，以最大径作为代表肿瘤的大小，以厘米作为单位，2.5cm作为肿瘤大小的界值；

淋巴结状态的判定：对于清扫的淋巴结，然后进行福尔马林固定，石蜡包埋，然后对淋巴结标本进行苏木素伊红(HE)染色，判断是否有肿瘤转移侵犯淋巴结组织；

构建复发风险的分层系统。

本发明的另一目的在于提供一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时，使得所述处理器执行所述胰腺神经内分泌肿瘤复发预测方法。

本发明的另一目的在于提供一种信息数据处理终端，所述信息数据处理终端用于实现所述胰腺神经内分泌肿瘤复发预测方法。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：

本发明提供了一种基于临床病理参数(肿瘤大小和淋巴结转移情况)和YTHDF2的预后模型，可以预测胰腺神经内分泌肿瘤的复发风险。发明方案的主要步骤是通过测量肿瘤的大小，通过免疫组化方法检测YTHDF2，通过显微镜下观察判断肿瘤的清扫的淋巴结是否发生转移及免疫组化结果，从而确定内膜癌的肿瘤大小、淋巴结状况和YTHDF2的表达，然后赋予风险分层，淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2高表达、淋巴结转移且肿瘤＜2.5厘米属于高危；淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2低表达、淋巴结未转移且YTHDF2低表达属于中危；淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2高表达、淋巴结转移且肿瘤＜2.5厘米属于高危。

该模型可以有效预测胰腺神经内分泌肿瘤的复发，从而避免治疗过度和治疗不足，达到精准治疗和个体化治疗的目的。该模型是基于分子病理、肿瘤大小和淋巴结状况而建立的，在临床应用上具有可行性，比目前临床应用的WHO的分级具有更高的预测能力、更加客观和简洁。该发明具有较好的创新性，目前国际及国内尚无相关的专利及文献报道。

相比于现有技术，本发明的优点进一步包括：

本发明利用组织学的方法确定胰腺神经内分泌肿瘤的淋巴结情况以及准确测量肿瘤最大径。

利用免疫组化的方法检测肿瘤细胞中YTHDF2的表达，确定表达量评分。

综合肿瘤大小、YTHDF2表达量评分及胰腺神经内分泌肿瘤淋巴结是否发生转移建立复发风险分层的TNY模型，并根据肿瘤大小、YTHDF2表达量评分及胰腺神经内分泌肿瘤淋巴结是否发生转移三个指标的情况分为低危、中危和高危三组，从而判断胰腺神经内分泌肿瘤的复发风险。

本发明通过分析183例胰腺神经内分泌肿瘤，基于肿瘤大小、YTHDF2表达量评分及胰腺神经内分泌肿瘤淋巴结是否发生转移构建了一种判断胰腺神经内分泌肿瘤复发的预后风险分层系统，根据分层系统将胰腺神经内分泌肿瘤患者分为低危、中危和高危。

(1)本发明的TNY模型具有很高的的对于胰腺神经内分泌肿瘤患者术后复发的预测能力。本发明中，通过多因素回归分析结果发现：肿瘤大小、YTHDF2的表达及淋巴结转移情况是胰腺神经内分泌肿瘤的独立预后因素，肿瘤大小是大于等于2.5厘米、YTHDF2高表达及淋巴结发生转移的胰腺神经内分泌肿瘤患者的预后更差，其生存曲线见图2。本发明专利中TNY模型中低危、中危及高危患者的生存曲线完全分开，见图3。C指数即一致性指数(C-index，concordance index)，用来评价模型的预测能力。C指数是指所有病人对子中预测结果与实际结果一致的对子所占的比例，它估计了预测结果与实际观察到的结果相一致的概率。对于患者的无复发生存期(RFS)，TNY模型的C指数为0.978(95％可信区间0.936–1.000)。另外，ROC曲线分析是用于评估一个因素预测能力的手段，是可以用于连续型变量分组的方法。在生存分析中，疾病状态和因素取值均会随时间发生变化。而标准的ROC曲线分析将个体的疾病状态和因素取值视作固定值，未将时间因素考虑在分析之中。在这种情况下，使用时间依赖性ROC无疑是更好的选择，曲线下面积(AUC)反映模型或者因素预测的能力即准确性。本发明利用TNY模型对胰腺神经内分泌肿瘤的一年、三年和5年的无复发生存进行预测，分别时间依赖的ROC曲线下面积为0.858(95％置信区间:0.747-0.913)，0.824(95％置信区间:0.754-0.912),和0.870(95％置信区间:0.762-0.915)见图4。由此可见，这些ROC曲线下面积都是很大的，目前认为ROC曲线下面积大于0.7，认为预测能力良好，本发明的模型的预测能力较好。

(2)本发明中的TNY模型更客观、更简洁以及更加实用具有可操作性。WHO对于胰腺神经内分泌肿瘤的分级是仅根据组织形态学判读，包括了分化情况以及Ki67指数和核分裂数。肿瘤分化情况的判断目前全凭病理医生的主观感知和判断，病理医生的诊断一致性较低，尤其是在高级别肿瘤中，鉴别分化程度较为困难，病理医生之间的诊断一致性就更低。以及Ki67指数的判读不同病理医生之间也存在一定差异。本发明中的TNY模型是基于肿瘤大小、免疫组化及淋巴结转移与否的二分类方法建立的评分系统，并没有纳入过多主观判读的指标，并且根据患者的三个指标具体组合的特征即可判读一线神经内分泌肿瘤的复发风险。因此，本发明中的TNY模型更加客观和简洁。

(3)本发明中的TNY模型可用于指导胰腺神经内分泌肿瘤术后的辅助治疗。对于低危患者，复发的风险极低，术后无复发生存的中位时间为41月，且5年无复发生存率为89.0％；对于中危患者，5年无复发生存率为70％；然而对于高危患者，复发风险较高，术后无复发生存的中位时间为20.8月，且5年无复发生存率为6.9％，对于不同的危险分级可以选择是否加用辅助治疗。对于中度危险的患者建议接受化疗，对于高度危险建议接受外放射治疗或联合化疗，并密切随访。对于低危的患者先进行密切随访即可。然而，对于高危患者建议接受外放射治疗或联合化疗，并密切随访。

附图说明

图1是本发明实施例提供的胰腺神经内分泌肿瘤的TNY模型中复发风险特征构建流程示意图。根据淋巴结、肿瘤大小和YTHDF2的表达情况将患者分为5组不同特征。特征1为淋巴结阳性且肿瘤小于2.5厘米；特征2为淋巴结阳性肿瘤大于等于2.5厘米且YTHDF2低表达；特征3为淋巴结阳性肿瘤大于等于2.5厘米且YTHDF2高表达；特征4为淋巴结阴性且YTHDF2低表达；特征5为淋巴结阴性且YTHDF2高表达。

图2是本发明实施例提供的肿瘤大小、YTHDF2的表达及肿瘤淋巴结转移与胰腺神经内分泌肿瘤患者是无复发生存时间有关。a.YTHDF2的表达与胰腺神经内分泌肿瘤患者的无复发生存期有关,YTHDF2高表达患者无复发生存时间较YTHDF2低表达患者短，且具有统计学差异。b.肿瘤大小与胰腺神经内分泌肿瘤患者的无复发生存期有关；肿瘤大于2.5厘米的患者相对于小于等于2.5厘米的患者拥有较短的无复发生存期，差异具有统计学意义。c.淋巴结转移情况与胰腺神经内分泌肿瘤患者的无复发生存期有关；发生淋巴结转移的患者比为发生淋巴结转移的患者的无复发生存期短，差异具有统计学意义。

图3是本发明实施例提供的TNY复发风险分级系统中不同风险分层患者的无复发生存时间曲线。根据本发明对患者分成高中低危险分组，高中低3组的无复发时间差异极大，将不同危险度的患者很好区分，差异具有统计学意义。

图4本发明实施例提供的TNY模型的时间依赖性的ROC曲线以及预测1年、3年和5年无复发生存的预测能力的ROC曲线下面积。该模型1年无复发生存的预测的曲线下面积为0.858，3年无复发生存的预测的曲线下面积为0.824，5年无复发生存的预测的曲线下面积为0.870，均显示模型预测能力极强。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种胰腺神经内分泌肿瘤复发预测系统、方法、终端及介质，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明提供一种胰腺神经内分泌肿瘤复发预测系统，应用于信息数据处理终端，所述胰腺神经内分泌肿瘤复发预测系统包括：

胰腺神经内分泌肿瘤信息确定模块，用于利用组织学的方法确定胰腺神经内分泌肿瘤的淋巴结情况以及准确测量肿瘤最大径；

肿瘤细胞表达量评分确定模块，用于利用免疫组化的方法检测肿瘤细胞中YTHDF2的表达，确定表达量评分；

胰腺神经内分泌肿瘤转移指标获取模块，用于综合肿瘤大小、YTHDF2表达量评分及胰腺神经内分泌肿瘤淋巴结是否发生转移建立复发风险分层的TNY模型，并根据肿瘤大小、YTHDF2表达量评分及胰腺神经内分泌肿瘤淋巴结是否发生转移三个指标的情况分为低危、中危和高危三组，从而判断胰腺神经内分泌肿瘤的复发风险。

本发明还提供一种胰腺神经内分泌肿瘤复发预测方法，应用于信息数据处理终端，所述胰腺神经内分泌肿瘤复发预测方法包括：

步骤一，YTHDF2评分：利用免疫组织化学的方法检测YTHDF2在胰腺神经内分泌肿瘤中的表达；

步骤二，获取肿瘤大小的测量数据：确定肿瘤的边界，以最大径作为代表肿瘤的大小，以厘米作为单位，2.5cm作为肿瘤大小的界值；

步骤三，淋巴结状态的判定：对于清扫的淋巴结，然后进行福尔马林固定，石蜡包埋，然后对淋巴结标本进行苏木素伊红(HE)染色，判断是否有肿瘤转移侵犯淋巴结组织；

步骤四，构建复发风险的分层系统。

在本发明一实施例中，所述步骤一YTHDF2的评估包括：根据免疫组化染色强度分为0(阴性)、1(弱阳性)、2(中等强度阳性)、3(强阳性)；记录阳性肿瘤细胞的百分比；最后得分为两部分的乘积，即得到为0-300的定量的评分，如果评分≤60视为YTHDF2低表达，评分＞60视为YTHDF2高表达。

在本发明一实施例中，所述步骤三淋巴结状态的判定包括：

1)先判读淋巴结状态：有淋巴结转移的进行肿瘤大小的分类，无淋巴结转移的直接进行YTHDF2的分类；

2)如果有淋巴结转移也有肿瘤小于2.5厘米，此时得到淋巴结转移且肿瘤＜2.5厘米这种特征；

3)如果有淋巴结转移也有肿瘤大小大于等于2.5厘米，进一步根据YTHDF2的表达分类，此时得到两种类型的特征：淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2低表达、淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2高表达；

4)如果无淋巴结转移，直接根据YTHDF2的表达分类，得到淋巴结未转移且YTHDF2低表达、淋巴结未转移且YTHDF2高表达两种特征。

进一步，所述复发风险的分层系统包括：

复发风险分级低危层，用于淋巴结未转移且YTHDF2高表达；

复发风险分级中危层，用于淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2低表达、淋巴结为转移且YTHDF2低表达；

复发风险分级高危层，用于淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2高表达、淋巴结转移且肿瘤＜2.5厘米。

进一步，所述步骤四构建复发风险的分层系统后，还需进行统计分析，包括：利用R语言绘制TNY模型的生存曲线、比较TNY模型的C指数，以及绘制时间依赖的ROC曲线和计算曲线下面积。

其中，复发风险的分层系统如下：

根据肿瘤大小是否大于等于2.5厘米，淋巴结是否发生转移以及YTHDF2的表达评分。因为该预后模型纳入了肿瘤大小(Tumor size)、淋巴结状况(Nodal status)和YTHDF2,所以此模型定义为胰腺神经内分泌肿瘤TNY预后模型。

下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步描述。

实施例

1、研究对象

本实施案例的研究对象为WHO分级中G1-3期医学神经内分泌肿瘤患者术后的肿瘤组织标本。纳入标准：明确病理诊断为胰腺神经内分泌肿瘤；肿瘤必须得是原发在胰腺的；病理切片及石蜡标本完整；随访时间至少12个月；临床数据以及预后随访数据均完整。

排除标准：术前接受新辅助化疗；术前接受放射治疗；合并其他胰腺肿瘤；病理切片或石蜡标本缺失；随访时间小于12个月；死于术后急性并发症的患者。

2.研究方法

2.1临床资料的收集

通过查阅患者住院病历及门诊病历，记录患者的年龄、性别、手术方式、肿瘤的功能性、术前是否接受化疗、术后是否接受辅助治疗、辅助治疗的方式，通过电话或门诊病历随访，记录患者是否复发、复发时间、复发部位、复发后的治疗方式、是否死亡、死亡时间、死亡原因。

2.2病理参数的判读

通过显微镜下观察病理HE切片，判读以下病理参数，包括组分化程度、肿瘤分级、肿瘤大小、分级、分期、淋巴结转移情况、Ki67指数、核分裂、肝转移、淋巴管和血管侵犯情况。

2.3免疫组织化学染色

1)病理标本的筛选：挑选含有肿瘤组织的石蜡组织标本，有条件可制备石蜡包埋标本的组织芯片。

2)切片，展片，贴片，烤片：切片厚度为4μm，然后将展开的切片用防脱粘附载玻片捞起，放于切片架晾干，在烤片机上70℃烘烤30min。

3)脱蜡：将至切片一次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、100％酒精、95％酒精、90％酒精、85％酒精、75％酒精、50％酒精、蒸馏水中各5min，进行脱蜡。

4)抗原修复：将一定量的EDTA抗原修复液(pH＝6.0)加入烧杯中，将烧杯放入高压锅中，加热至沸腾，高压沸腾2～3min，抗原修复液冷却恢复至室温，用PBS冲洗2次。

5)灭活过氧化物酶：滴加3％双氧水至组织切片，室温孵育15min，PBS冲洗3遍，以阻断内源性过氧化物酶。

6)封闭：使用防水记号笔勾勒出组织标本部分，滴加封闭用血清，置于湿盒中室温下封闭30min,PBS冲洗3次.

7)孵育一抗：在组织切片滴加YTHDF2(货号ab246514,稀释比例1:2000；厂家Abcam)的抗体置于湿盒中，4℃过夜。同型IgG作为阴性对照。

8)孵育二抗：一抗孵育4℃过夜后，取出，在37℃复温1h,PBS洗三次,滴加二抗，室温孵育1h；然后PBS冲洗三次.

9)DAB显色：孵育完毕后，滴加新鲜配置的DAB显色液，显色5min左右，观察染色情况，根据染色的程度，流动水冲洗10min，及时终止显色。

10)苏木素复染，蓝返：切片在苏木素染液中室温染色2min左右，流动水冲洗后放入0.1％盐酸乙醇中5-10s，自来水冲洗后，放入氨水中5-10s蓝返。

11)脱水：依次在浓度为50％酒精→70％酒精→80％酒精→90％酒精→95％酒精→100％酒精(两次)脱水5min，二甲苯透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中10min透明。

12)封片：中性树胶封片，盖上盖玻片，注意避免出现气泡，通风橱内晾干后观察。

2.4免疫组化结果的评估

利用免疫组织化学的方法检测YTHDF2在胰腺神经内分泌肿瘤中的表达。YTHDF2的评估：根据免疫组化染色强度分为0(阴性)、1(弱阳性)、2(中等强度阳性)、3(强阳性)；记录阳性肿瘤细胞的百分比；最后得分为两部分的乘积，即得到为0-300的定量的评分，如果评分≤60视为YTHDF2低表达，评分＞60视为YTHDF2高表达。

2.4 TNY模型复发风险特征的构建步骤

如图1所示：1)先判读淋巴结状态：有淋巴结转移的进行肿瘤大小的分类，无淋巴结转移的直接进行YTHDF2的分类；

2)如果有淋巴结转移也有肿瘤小于2.5厘米，此时得到淋巴结转移且肿瘤＜2.5厘米这种特征；

3)如果有淋巴结转移也有肿瘤大小大于等于2.5厘米，进一步根据YTHDF2的表达分类，此时得到两种类型的特征：淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2低表达、淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2高表达；

4)如果无淋巴结转移，直接根据YTHDF2的表达分类，得到淋巴结未转移且YTHDF2低表达、淋巴结未转移且YTHDF2高表达两种特征。

综上5种特征：淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2高表达、淋巴结转移且肿瘤＜2.5厘米属于高危；淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2低表达、淋巴结未转移且YTHDF2低表达属于中危；淋巴结转移且肿瘤≥2.5厘米且YTHDF2高表达、淋巴结转移且肿瘤＜2.5厘米属于高危。

2.5 TNY复发风险封层系统构建

2.5统计分析

利用R语言中的survival包及ggplot包绘制TNY模型的患者生存曲线，利用R语言中的survival包和survcomp包比较TNY模型的C指数，以及：利用“survivalROC”和“timeROC”绘制时间依赖的ROC曲线和计算曲线下面积。总体来说时间依赖的ROC曲线下面积和C指数越大，则提示模型预测能力越好。

在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

应当注意，本发明的实施方式可以通过硬件、软件或者软件和硬件的结合来实现。硬件部分可以利用专用逻辑来实现；软件部分可以存储在存储器中，由适当的指令执行系统，例如微处理器或者专用设计硬件来执行。本领域的普通技术人员可以理解上述的设备和方法可以使用计算机可执行指令和/或包含在处理器控制代码中来实现，例如在诸如磁盘、CD或DVD-ROM的载体介质、诸如只读存储器(固件)的可编程的存储器或者诸如光学或电子信号载体的数据载体上提供了这样的代码。本发明的设备及其模块可以由诸如超大规模集成电路或门阵列、诸如逻辑芯片、晶体管等的半导体、或者诸如现场可编程门阵列、可编程逻辑设备等的可编程硬件设备的硬件电路实现，也可以用由各种类型的处理器执行的软件实现，也可以由上述硬件电路和软件的结合例如固件来实现。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。