公开/公告号CN113122640A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-07-16
原文格式PDF
申请/专利权人 中国医学科学院肿瘤医院;
申请/专利号CN202110598817.3
申请日2021-05-31
分类号C12Q1/6886(20180101);C12N15/11(20060101);C12M1/34(20060101);C12M1/00(20060101);G16B20/10(20190101);G16B25/20(20190101);
代理机构11245 北京纪凯知识产权代理有限公司;
代理人张立娜
地址 100021 北京市朝阳区潘家园南里17号
入库时间 2023-06-19 11:52:33
技术领域
本发明涉及生物医学领域,具体涉及CEP63和FOSL2的DNA拷贝数变异在膀胱尿路上皮癌诊断中的应用。
背景技术
膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤,是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,也是全身十大常见肿瘤之一。尿路上皮癌是膀胱癌最常见的病理类型。膀胱尿路上皮癌的高复发率为患者带来了较沉重的经济负担。
依据目前的诊疗指南,膀胱尿路上皮癌的诊断主要依靠膀胱镜检查。然而常规膀胱镜检查受到镜下视野的限制,无法全面的反映膀胱中肿瘤的情况,且有创性操作也为患者造成了身体负担。
发明内容
本发明的目的是提供CEP63和FOSL2的DNA拷贝数变异在膀胱尿路上皮癌诊断中的应用。
第一方面,CEP63基因和/或FOSL2基因的DNA拷贝数变异作为标记物在如下任一中的应用:
(A1)制备用于诊断或者辅助诊断膀胱尿路上皮癌的产品,或诊断或者辅助诊断膀胱尿路上皮癌;
(A2)制备用于区分或者辅助区分膀胱尿路上皮癌和无癌对照的产品,或区分或者辅助区分膀胱尿路上皮癌和无癌对照;
(A3)制备用于检测待测者患膀胱尿路上皮癌的概率的产品,或检测待测者患膀胱尿路上皮癌的概率。
第二方面,本发明要求保护用于检测CEP63基因和/或FOSL2基因的DNA拷贝数变异的物质在如下任一中的应用:
(A1)制备用于诊断或者辅助诊断膀胱尿路上皮癌的产品,或诊断或者辅助诊断膀胱尿路上皮癌;
(A2)制备用于区分或者辅助区分膀胱尿路上皮癌和无癌对照的产品,或区分或者辅助区分膀胱尿路上皮癌和无癌对照;
(A3)制备用于检测待测者患膀胱尿路上皮癌的概率的产品,或检测待测者患膀胱尿路上皮癌的概率。
在第一方面和第二方面所述应用中,CEP63基因和/或FOSL2基因的DNA拷贝数比值较无癌对照相比增加的越多(CEP63基因拷贝数与TBP拷贝数比值大于0.94,CEP63基因拷贝数与TBP拷贝数比值大于1.00),则相应待测者为膀胱尿路上皮癌的可能性越大。
第三方面,本发明要求保护如下任一应用:
P1、物质1和介质1的组合在制备用于诊断或者辅助诊断膀胱尿路上皮癌的产品中的应用;
所述物质1为用于检测CEP63基因和FOSL2基因的DNA拷贝数变异的物质;
所述介质1中记载有用于诊断或者辅助诊断膀胱尿路上皮癌的预测模型和使用方法;
所述预测模型如公式I所示:
L=-1.817+2.267×CEP63
其中,L为模型检验变量;CEP63
所述预测模型的使用方法,包括如下步骤:
(a1)检测待测者尿液样本中CEP63基因拷贝数与TBP基因拷贝数的比值,以及FOSL2基因拷贝数与TBP基因拷贝数的比值;然后根据如下确定所述CEP63
(a2)将步骤(a1)获得的所述CEP63
进一步地,所述阈值为-0.6835;若所述模型检验变量L大于-0.6835,则所述待测者为或候选为膀胱尿路上皮癌患者;若所述模型检验变量L小于等于-0.6835,则所述待测者不为或候选不为膀胱尿路上皮癌患者。
P2、P1中的所述物质1和介质2的组合在制备用于检测待测者患膀胱尿路上皮癌的概率的产品中的应用;
所述介质2中记载有用于检测待测者患膀胱尿路上皮癌的概率的预测模型和使用方法;
所述预测模型如公式I和公式II所示:
L=-1.817+2.267×CEP63
其中,L为模型检验变量;CEP63
P=exp(L)/[1+exp(L)] (公式II);
其中,P为所述待测者为膀胱尿路上皮癌的概率;L为所述公式I中的模型检验变量;
所述预测模型的使用方法,包括如下步骤:
(b1)检测待测者尿液样本中CEP63基因拷贝数与TBP基因拷贝数的比值,以及FOSL2基因拷贝数与TBP基因拷贝数的比值;然后根据如下确定所述CEP63
(b2)将步骤(b1)获得的所述CEP63
第四方面,本发明要求保护具有如下任一功能的试剂盒:
Q1、诊断或者辅助诊断膀胱尿路上皮癌;
Q2、区分或者辅助区分膀胱尿路上皮癌和无癌对照;
Q3、检测待测者患膀胱尿路上皮癌的概率。
所述试剂盒含有用于检测CEP63基因和/或FOSL2基因的DNA拷贝数变异的物质。
所述试剂盒中还可含有前文所述介质1或所述介质2。
第五方面,本发明要求保护如下任一系统:
系统I:用于诊断或者辅助诊断膀胱尿路上皮癌的系统,可包括:
(B1)用于检测CEP63基因和FOSL2基因的DNA拷贝数变异的试剂和/或仪器;
(B2)装置1。
所述装置1包括模型存储模块、数据输入模块、数据运算模块、阈值存储模块、数据比较模块和结论输出模块。
所述模型存储模块被配置为存储用于诊断或者辅助诊断膀胱尿路上皮癌的预测模型。
所述预测模型如公式I所示:
L=-1.817+2.267×CEP63
其中,L为模型检验变量;CEP63
所述数据输入模块被配置为输入对待测者尿液样本进行检测得到的CEP63基因拷贝数与TBP基因拷贝数的比值,以及FOSL2基因拷贝数与TBP基因拷贝数的比值,然后根据如下确定所述CEP63
所述数据运算模块被配置为接收来自于所述数据输入模块的所述CEP63
所述阈值存储模块被配置为存储用于诊断或者辅助诊断膀胱尿路上皮癌的判断阈值。
所述数据比较模块被配置为接收来自于所述数据运算模块计算所得的模型检验变量,并调用所述阈值存储模块中的判断阈值,将所述模型检验变量与所述判断阈值进行比较。
所述结论输出模块被配置为接收来自于所述数据比较模块的比较结果,根据所述比较结果输出所述待测者是否为膀胱尿路上皮癌患者的结论。
进一步地,所述阈值为-0.6835;若所述模型检验变量L大于-0.6835,则所述待测者为或候选为膀胱尿路上皮癌患者;若所述模型检验变量L小于等于-0.6835,则所述待测者不为或候选不为膀胱尿路上皮癌患者。
系统II:用于检测待测者患膀胱尿路上皮癌的概率的系统,可包括:
(C1)用于检测CEP63基因和FOSL2基因的DNA拷贝数变异的试剂和/或仪器;
(C2)装置2。
所述装置2包括模型存储模块、数据输入模块、数据运算模块。
所述模型存储模块被配置为存储用于检测待测者患膀胱尿路上皮癌的概率的预测模型。
所述预测模型如公式I和公式II所示:
L=-1.817+2.267×CEP63
其中,L为模型检验变量;CEP63
P=exp(L)/[1+exp(L)] (公式II)。
其中,P为所述待测者为膀胱尿路上皮癌的概率;L为所述公式I中的模型检验变量。
所述数据输入模块被配置为输入对待测者尿液样本进行检测得到的CEP63基因拷贝数与TBP基因拷贝数的比值,以及FOSL2基因拷贝数与TBP基因拷贝数的比值,然后根据如下确定所述CEP63
所述数据运算模块被配置为接收来自于所述数据输入模块的所述CEP63
所述系统还包括3D数字PCR试剂和/或仪器。
在上述各方面中,所述CEP63基因拷贝数与TBP基因拷贝数的比值具体为CEP63基因拷贝数的校正值与内参基因TBP拷贝数的校正值的比值;所述FOSL2基因拷贝数与TBP基因拷贝数的比值具体为FOSL2基因拷贝数的校正值与内参基因TBP拷贝数的校正值的比值。
进一步地,所述CEP63基因拷贝数的校正值、所述FOSL2基因拷贝数的校正值、所述内参基因TBP拷贝数的校正值均可通过如下计算得到:3D数字PCR中QuantStudio
在上述各方面中,用于检测CEP63基因和/或FOSL2基因的DNA拷贝数变异时的检测样本可为膀胱尿路上皮癌尿液样本。
在上述各方面中,用于检测CEP63基因和/或FOSL2基因的DNA拷贝数变异的物质可为PCR扩增引物。
在本发明的具体实施方式中,用于检测CEP63基因的DNA拷贝数变异的PCR扩增引物由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示两条单链DNA组成。用于检测FOSL2基因的DNA拷贝数变异的PCR扩增引物由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示两条单链DNA组成。
在上述各方面中,检测CEP63基因和/或FOSL2基因的DNA拷贝数变异时以TBP基因拷贝数作为内参。
进一步地,用于检测TBP基因拷贝数的PCR扩增引物由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示两条单链DNA组成。
本发明开创性的应用高灵敏度的3D数字PCR技术联合尿液中CEP63、FOSL2的DNA拷贝数变异构建膀胱尿路上皮癌的诊断模型,为临床诊断提供具备可行性的新途径。
附图说明
图1为膀胱尿路上皮癌与健康人(无癌对照)尿中2个基因的拷贝数变异(均数及95%可信区间),CEP63、FOSL2的拷贝数在膀胱尿路上皮癌患者尿中显著增加(Mann–Whitney检验,**p<0.01)。
图2为根据上述诊断模型区分膀胱尿路上皮癌患者和健康人(无癌对照)尿样本的受试者特征工作曲线。曲线下面积为0.858,p<0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、CEP63和FOSL2的DNA拷贝数变异在膀胱尿路上皮癌诊断中的应用
本实施例通过3D数字PCR在40例膀胱尿路上皮癌患者和42例健康人尿脱落细胞中检测CEP63、FOSL2的DNA拷贝数变异;联合CEP63、FOSL2的DNA拷贝数变异构建膀胱尿路上皮癌患者的诊断模型。
一、材料与方法
2、3D数字PCR试剂
3、3D数字PCR引物序列
如表1所示。
表1、本发明所涉及的3D数字PCR引物序列
4、3D数字PCR检测方法
(1)配制反应液。
反应体系如表2所示。
表2、本发明3D数字PCR反应体系
(2)将反应液应用QuantStudio
(3)进行3D数字PCR反应。
PCR仪:Proflex 2x Flat PCR System。
Proflex程序如表3所示。
表3、本发明3D数字PCR的Proflex程序
(4)应用QuantStudio
(5)应用QuantStudio
本发明中,芯片检出孔数大于16000(芯片共20000个反应孔),且有效孔比例(荧光强度大于阈值的孔占总检出孔数)大于0.85认为是质量合格的芯片。
(6)芯片数据二级处理
3D数字PCR中QuantStudio
二、结果与分析
1、入组患者及健康人基本特征
入组标准:
(1)于中国医学科学院肿瘤医院确诊初治的膀胱尿路上皮癌患者;(2)肿瘤组织病理诊断为膀胱尿路上皮癌。
剔除标准:
(1)手术前接受过其他治疗;(2)合并上尿路尿路上皮肿瘤或有上尿路尿路上皮肿瘤病史;(3)合并其他恶性肿瘤或有其他恶性肿瘤病史。
入组膀胱尿路上皮癌患者及健康人(无癌对照,现在及曾经均没有患过癌症且血常规指标都在参考范围内)基本特征如表4所示。
表4、入组膀胱尿路上皮癌患者及健康人基本特征
2、膀胱尿路上皮癌及健康人尿中CEP63、FOSL2的DNA拷贝数变异
应用3D数字PCR在40例膀胱尿路上皮癌患者和42例健康人尿脱落细胞中检测CEP63、FOSL2的DNA拷贝数变异。
用于检测CEP63和FOSL2基因的DNA拷贝数变异的3D数字PCR扩增引物如上所述(表1)。以TBP为内参基因(TATA-box binding protein基因)。用于检测TBP基因拷贝数的3D数字PCR扩增引物如上所述(表1)。
结果显示:膀胱尿路上皮癌患者尿脱落细胞中CEP63基因拷贝数比值(CEP63基因拷贝数与TBP基因拷贝数的比值)和FOSL2的拷贝数比值(FOSL2基因拷贝数与TBP基因拷贝数的比值)显著高于健康人尿中CEP63和FOSL2的拷贝数比值。如图1所示。
3、构建基于3D数字PCR的尿样本诊断模型
本发明中将3D数字PCR检测的CEP63与FOSL2的拷贝数联合,评估其对膀胱尿路上皮癌患者与健康人(无癌对照)尿样本的区分能力。
由于3D数字PCR检测的CEP63、FOSL2的拷贝数为连续变量,应用R软件(版本:3.6.030,R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria)(Ihaka etal.1996)中的“survminer”程序包获得区分膀胱尿路上皮癌与健康人(无癌对照)尿样本最佳的拷贝数比值(与内参基因TBP拷贝数的比值)的截点值,其中CEP63拷贝数比值的截点值为0.94,FOSL2拷贝数比值的截点值为1.00。
按照CEP63、FOSL2拷贝数比值的截点值将2个基因的拷贝数变换为二分类变量进行Logestic回归分析。基因的拷贝数比值大于截点值,则将该基因的变量值记为“1”,若基因的拷贝数比值小于等于截点值,则该基因的变量值记为“0”。单因素Logestic回归分析结果显示,尿液中CEP63的拷贝数变异(p<0.0001)、FOSL2的拷贝数变异(p<0.0001)与膀胱尿路上皮癌相关。将CEP63拷贝数、FOSL2拷贝数等变量纳入多因素二元Logestic回归分析,结果显示尿液中CEP63的拷贝数变异(p=0.0002)、FOSL2的拷贝数变异(p=0.002)是膀胱尿路上皮癌的独立危险因素,尿液中CEP63的拷贝数增加(拷贝数与TBP比值大于0.94),发生膀胱尿路上皮癌的可能性增加8.651倍;FOSL2的拷贝数增加(拷贝数与TBP比值大于1.00),发生膀胱尿路上皮癌的可能性增加13.8倍。
基于尿液中CEP63、FOSL2的拷贝数变异应用多元Logestic回归构建预测膀胱尿路上皮癌的诊断模型,如公式I所示。
模型中基因的拷贝数比值大于截点值,则将该基因的变量值(CEP63
L=-1.817+2.267×CEP63
其中,L为模型检验变量;CEP63
该尿样本提供者是膀胱尿路上皮癌的概率P为公式II:
P=exp(L)/[1+exp(L)] (公式II)。
4、评价尿样本诊断模型的检测效能
采用受试者特征工作曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC曲线)分析上述诊断模型的检测效能。将L值作为检验变量,将是否为膀胱尿路上皮癌患者作为状态变量,绘制ROC曲线,如图2所示。曲线下面积为0.858(95%可信区间:0.775-0.941),曲线下面积大于0.75,说明该诊断模型能够较好的区分膀胱尿路上皮癌患者和健康人(无癌对照)。该模型的灵敏度为85.0%,特异度为73.8%,阳性预测值为75.6%,阴性预测值为83.8%。
上述模型约登指数(Youden index)最大时的L值为-0.6835,将-0.6835作为诊断模型中L值的截点值,当L值大于-0.6835时认为该尿样本来自于膀胱尿路上皮癌患者;当L值小于等于-0.6835时认为该尿样本来自于正常人。
采用MacNemar配对卡方检验和Kappa一致性检验评价诊断模型的预测结果与实际情况的一致性。诊断模型预测的膀胱尿路上皮癌患者百分比为54.9%,实际情况膀胱尿路上皮癌患者的百分比为48.8%,MacNemar配对卡方检验的p值为0.332,说明预测结果与实际情况的差异不具有统计学意义。Kappa一致性检验p<0.0001,说明预测结果与实际情况之间具有一致性。见表5。
表5、诊断模型预测膀胱尿路上皮癌患者与正常受试者的配对卡方检验
a:McNemer检验,p>0.05,不具有统计学意义。
b:Kappa一致性检验,p<0.05,具有统计学意义,Kappa值为0.586。
本发明基于高灵敏度3D数字PCR技术,联合尿样本中CEP63与FOSL2的拷贝数变异构建了膀胱尿路上皮癌尿液诊断模型,并进行检测效能评价。该模型ROC曲线下面积为0.858,能够较好的区分膀胱尿路上皮癌与健康人尿样本;且模型预测结果与实际情况具有一致性。该诊断模型为膀胱尿路上皮癌患者的尿液诊断提供了新的方法。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国医学科学院肿瘤医院
<120> CEP63和FOSL2的DNA拷贝数变异在膀胱尿路上皮癌诊断中的应用
<130> GNCLN210473
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cactcgcttt cctcggattc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
caatgccttc tccagacttc c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
cagagtggaa cagccgtatg c 21
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
aaacccaact gcccaatctt cttag 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
gaactggctt ataggactgt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
ctggaactcg tctcactatt 20
机译: 二维DNA片段大小在确定拷贝数变异中的应用
机译: 分析尿沉渣及其套件中DNA甲基化特征的膀胱癌诊断方法
机译: 一种分析尿沉渣中DNA甲基化特征及其工具的膀胱癌诊断方法