用于治疗GM1和GM2神经节苷脂贮积病的RAAV载体

相关申请

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发明领域

在一些方面，本公开提供了可用于治疗溶酶体贮积病的重组腺相关病毒(rAAV)、组合物和试剂盒。在一些实施方案中，溶酶体贮积病是GM1或GM2神经节苷脂贮积病(例如，泰-萨二氏病)。

联邦赞助的研究

本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号HD060576的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

发明背景

GM1神经节苷脂贮积病是一种由人基因GLB1突变引起的常染色体隐性神经病理性溶酶体贮积病。人GLB1基因编码酶β-D-半乳糖苷酶(βgal)，该酶从中枢神经系统(例如GM1神经节苷脂)和周围组织(例如寡糖，糖蛋白和糖胺聚糖)的众多分子中去除末端半乳糖残基。溶酶体βgal活性不足会导致GM1神经节苷脂及其无唾液酸衍生物GA1主要在中枢神经系统中积累。GM1神经节苷脂贮积病一律致命，并且不存在有效的疗法。

泰-萨二氏病(Tay Sachs disease)(GM2神经节苷脂贮积病)和Sandhoff病是常染色体隐性溶酶体贮积病，分别由HEXA和HEXB基因中的突变引起，导致β-N-乙酰基-D-己糖胺酶(Hex)酶活性不足。Hex酶是包含HexA和HexB蛋白亚基的异二聚体。Hex活性不足导致GM2神经节苷脂在中枢神经系统中逐渐积累，并随之导致神经变性。泰-萨二氏病的特征是不断进展性神经系统衰落，最终死亡。泰-萨二氏病的症状包括频繁发作，吞咽困难，失去运动控制和频繁呼吸道感染。Sandhoff病的特征还在于CNS的逐步衰落，导致步态异常，吞咽和言语困难，周围神经病，精神病表现以及最终死亡。目前，没有针对泰-萨二氏病或Sandhoff病的疾病缓解治疗选择，并且只有对症治疗，包括抗惊厥药和解痉药。

发明概述

本公开的方面涉及用于基因递送的重组AAV载体。一些当前的AAV载体递送高水平的基因表达，其导致受试者中的不良事件(例如，细胞毒性)。本公开部分地基于以下认识：工程化的调节元件可以调节转基因表达水平以提供治疗量的转基因而不诱导不良事件。

在一些方面，本公开提供了包含壳体的重组AAV(rAAV)，所述壳体包含核酸，所述核酸包含通过嵌合内含子与编码溶酶体贮积病相关蛋白(例如，HEXA，HEXB，GLB1等)的转基因可操作连接的启动子。在一些方面，本公开提供了包含壳体的重组AAV(rAAV)，所述壳体包含核酸，所述核酸包含通过嵌合内含子与转基因可操作连接的启动子，其中所述启动子和所述转基因通过所述嵌合内含子分开，并且其中所述核酸不含增强子元件，并且其中转基因编码溶酶体贮积病相关蛋白(例如，HEXA和/或HEXB和/或GLB1)。在一些实施方案中，启动子包括鸡β-肌动蛋白(CB)启动子。在一些实施方案中，嵌合内含子包括鸡β肌动蛋白内含子和/或兔β珠蛋白内含子。在一些实施方案中，核酸进一步包含一个或多个非翻译序列，例如来自兔β-珠蛋白外显子1和/或外显子2的非翻译序列。在一些实施方案中，嵌合内含子的侧翼有两个非翻译序列(例如，第一非翻译序列位于启动子与嵌合内含子之间，并且第二非翻译区域位于嵌合内含子与转基因的第一密码子之间)。

在一些实施方案中，βgal是人βgal。在一些实施方案中，本公开描述的rAAV包括编码β-己糖胺酶亚基α(HexA)的转基因。在一些实施方案中，HEXA由SEQ ID NO:20所示的序列表示。在一些实施方案中，转基因编码β-己糖胺酶亚基β(HexB)。在一些实施方案中，HEXB由SEQ ID NO:21所示的序列表示。

在一些实施方案中，本文所述的rAAV的至少一个壳体蛋白是AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAVrh8,AAV9,AAV10或AAVrh10壳体蛋白。在一些实施方案中，本文所述的rAAV的至少一个ITR选自AAV1 ITR,AAV2 ITR,AAV3 ITR,AAV4 ITR,AAV5 ITR或AAV6 ITR。在一些实施例中，至少一个ITR是全长ITR。在一些实施方案中，rAAV包含两个ITR，其中杂合启动子和转基因位于两个ITR之间。在一些实施方案中，本文所述的rAAV具有以下血清型之一：AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAVrh8,AAV9,AAV10或AAVrh10。

在一些实施方案中，公开涉及编码本文描述的rAAV的组分的核酸。例如，在一些方面，本公开提供了分离的核酸，其包含选自SEQ ID NO:1至6或16至19的序列。在一些方面，本公开提供了分离的核酸，其包括编码具有SEQ ID NO:20或21所示的氨基酸序列的肽的序列。

在一些实施方案中，编码rAAV的组分的核酸(例如，包含序列的核酸，所述序列选自SEQ ID NO:1至6或16至19或来自SEQ ID NO:1至6或16至19的序列的一部分)包含在宿主细胞中。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。

在一些实施方案中，宿主细胞进一步包含编码AAV壳体蛋白(例如AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAVrh8,AAV9,AAV10或AAVrh10壳体蛋白)的分离的核酸。

在一些方面，本公开提供了药物组合物，其包含：(i)包含壳体的第一rAAV，所述壳体包含第一核酸，所述第一核酸包含通过嵌合内含子与编码β-己糖胺酶亚基α(HexA)的转基因可操作连接的启动子；(ii)包含壳体的第二rAAV，所述壳体包含第二核酸，所述第二核酸包含通过嵌合内含子与编码β-己糖胺酶亚基β(HexB)的转基因可操作连接的启动子。在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，第一rAAV和第二rAAV以1:1的比率存在于组合物中。

在一些方面，本公开提供了用于治疗溶酶体贮积病的方法，该方法包括对患有溶酶体贮积病(例如，泰-萨二氏病，GM2神经节苷脂贮积病，Sandhoff病，莫基奥(Morquio)综合征B等)患者施用本文所述的重组AAV(rAAV)或药物组合物。在一些实施方案中，溶酶体贮积病是泰-萨二氏病或Sandhoff病。在一些实施方案中，通过颅内注射，脑内注射或经由脑室系统，小脑延髓池或鞘内空间注射到CSF中，向受试者施用rAAV或药物组合物。在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗GM2神经节苷脂贮积病的方法，该方法包括向患有GM2神经节苷脂贮积病的受试者施用如本文所述的rAAV或药物组合物。

在一些方面，本公开提供了试剂盒，其包括：容器，其容纳如本文所述的重组AAV(rAAV)；或包含本文所述的重组AAV(rAAV)的组合物。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括容纳药学上可接受的载体的容器。在一些实施方案中，将rAAV或包含rAAV和药学上可接受的载体的组合物容纳在同一容器中。在一些实施方案中，容器是注射器。

在一些方面，本发明提供了包含核酸的重组AAV载体，所述核酸包含编码与编码SEQ ID NO:23所示的人GLB1的转基因可操作连接的启动子。在一些方面，本发明提供了分离的核酸，其编码与编码如SEQ ID NO:23所示的人GLB1的转基因可操作连接的启动子。在一些实施方案中，药物组合物包含rAAV和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗GM1神经节苷脂贮积病的方法，所述方法包括向患有GM1神经节苷脂贮积病的受试者施用所述rAAV或所述药物组合物。

附图简述

图1A-1B显示了rAAV载体CBA-mβgal-WPRE的设计。图1A显示了rAAV载体CBA-mβgal-WPRE的示意图。来自AAV2的两个反向末端重复(ITR)在每个末端上在载体的侧翼。CBA启动子由以下构成：巨细胞病毒立即早期增强子(CMV)，与其融合的鸡β-肌动蛋白启动子，然后是嵌合鸡β-肌动蛋白/兔β珠蛋白内含子(CBA)，小鼠溶酶体酸β-半乳糖苷酶cDNA(mβgal)，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)和串联的两个polyA信号，源自牛生长激素(BGH)和SV40。然后将此载体包装在AAVrh8壳体中。图1B显示了重组AAV(rAAV)载体，其包含在CBA启动子的控制下编码hGLB1的转基因。

图2A-2J显示了在βgal

图3A-3C显示了颅内注射AAV的βgal

图4显示了颅内注射AAV的βgal

图5A-5F显示了在βgal

图6A-6H显示了溶酶体贮积在长寿命AAV颅内注射的βgal

图7A-7K显示在βgal

图8A-8K显示在βgal

图9A-9L显示了在βgal

图10A-10B显示了载体设计的改变导致βgal

图11显示了在βgal

图12A-12U显示具有减少的蛋白质存在的载体导致βgal

图13显示了βGal

图14显示了经处理的βgal

图15A-15F显示了在βgal

图16显示了在治疗性AAVrh8处理后，βgal

图17A-17L显示了在用AAVrh8载体治疗性处理后对βgal

图18显示了当用较高剂量的较低表达的启动子处理时，在βgal

图19描绘了AAVrh8载体的结构。

图20显示了2140.8pAAV-cb-mβgal的载体图。

图21显示了编码HexAα-和β-亚基的单顺反子AAV载体的结构。

图22A-22F显示了猴丘脑中的神经病理学。在图22A中，可见单个核血管周围套囊(箭头)和白质中的坏死区域(*)。图22B显示了Luxol Fast Blue染色的切片，其中箭头描绘了1个大坏死面积，血管增殖和白质损失(注意到与相邻的深蓝色相比苍白)。图22C显示丘脑中具有空泡化的坏死区域(箭头)。图22D是丘脑中的血管套囊的例子(40x)。在最低剂量(1/30)中看到相似的神经病理学(图22E)。图22F显示了PBS注射动物中的正常丘脑；(1x剂量，图22A-22D；1/30剂量，图22E；注射的PBS，图22F)。

图23A-23D显示了CNS中的己糖胺酶活性。在注射不同剂量的编码cmHex-alpha和cmHex-beta的AAVrh8载体的1:1制剂的NHP的丘脑和胸脊髓中测量Hex活性。生物化学测定中使用两种人工底物，即MUG和MUGS。第一种底物被所有Hex同工酶(HexA，HexB，HexS)切割，而后者仅被HexA和HexS同工酶切割。

图24是尸检前的脑MRI，揭示了丘脑中的水肿。尸检前以1/30剂量注射编码cmHex-alpha和cmHex-beta的AAVrh8载体制剂的NHP的丘脑中的水肿(箭头)。在注射转基因空的AAVrh8载体的NHP中未观察到变化。

图25A-25G显示了在猴丘脑中的蛋白质表达。显示了在1x剂量动物的丘脑中注射部位的(图25A)近端和(图25B)远端的Hex-β染色(绿色)。显示了在1/30剂量动物的丘脑中注射部位的(图25C)近端和(图25D)远端的Hex-α染色(绿色)。在图25C-25D所示的1/30剂量动物的丘脑中注射部位的(图25E)近端和(图25F)远端的H&E染色。图25G显示了图25E中的框示区域的放大。箭头指示神经元中的嗜酸性物质。

图26A-2B呈现了一组具有预期的HexA表达水平梯度的新的AAV载体。图26A显示了表达元件从当前版本(顶部)到其最基本形式的示意性除去，没有ITR侧翼cDNA的经典启动子元件与聚腺苷酸化信号(底部载体)。图26B显示了基于ITR表达的载体，其逐渐掺入已知增加ITR驱动的基因表达的更多元件。缩写：CMV Enh–巨细胞病毒立即早期增强子；CB–鸡β-肌动蛋白启动子；HexA/B–对于每种载体设计，将生成一对携带食蟹猴HexA和HexB cDNA的载体；pA–聚腺苷酸化信号；ITR–AAV2反向末端重复；P1–认为将ITR介导的基因表达提高约10倍的启动子1；P2–认为将ITR介导的基因表达提高约50倍的启动子。

图27显示了pAAV-cb-ci-cmHexA-2158载体的质粒图。

图28显示了pAAV-P2Int-cmHexA_2194(修饰的)载体的质粒图。

图29A-29B显示了在瞬时转染的293T细胞中己糖胺酶活性的梯度。转染后72小时，使用人工底物4MUG(图29A)和4MUGS(图29B)(分别通过所有β-己糖胺酶同等型(HexA，B和S)或仅含有α-亚基的同等型(HexA，HexS)切割)在细胞裂解物中测量己糖胺酶活性。

图30显示了在1个月的研究期内体重的变化。误差棒代表1个标准偏差。

图31A-31T显示表达最高水平的食蟹猴Hex蛋白的小鼠脑含有嗜酸性神经元。H&E染色表明存在含有嗜酸性颗粒的神经元，其与海马和丘脑中的食蟹猴Hex表达水平相关(40x)。组1(图31A,31K),组2(图31B,31L),组3(图31C,31M),组4(图31D,31N),组5(图31E,31O),组6(图31F,31P),组7(图31G,31Q),组8(图31H,31R),组9(图31I,31S),和组10(图31J,31T)小鼠。

图32A-32T显示了无胸腺裸鼠脑中的食蟹猴Hexα表达在AAV载体之间变化。组1(图32A,32K),组2(图32B,32L),组3(图32C,32M),组4(图32D,32N),组5(图32E,32O),组6(图32F,32P),组7(图32G,32Q),组8(图32H,32R),组9(图32I,32S),和组10(图32J,32T)的丘脑和海马中的Hexα染色(绿色)；核用DAPI复染(蓝色)。箭头指示酶阳性细胞。

图33A-33T显示食蟹猴Hex蛋白的表达降低导致小胶质细胞活化的降低。Iba-1染色表明，海马和丘脑中食蟹猴Hex蛋白表达降低的组的炎症减少(20x)。组1(图33A,33K),组2(图33B,33L),组3(图33C,33M),组4(图33D,33N),组5(图33E,33O),组6(图33F,33P),组7(图33G,33Q),组8(图33H,33R),组9(图33I,33S),和组10(图33J,33T)。

图34A-34T显示了食蟹猴Hex蛋白表达的降低导致反应性星形胶质化的减少。GFAP染色表明，海马和丘脑中食蟹猴Hex蛋白表达降低的组的炎症减少(20x)。组1(图34A,34K),组2(图34B,34L),组3(图34C,34M),组4(图34D,34N),组5(图34E,34O),组6(图34F,34P),组7(图34G,34Q),组8(图34H,34R),组9(图34I,34S)和组10(图34J,34T)。

图35显示了选择用于在非人灵长类动物中进一步测试的新的AAV载体。

图36显示在颅内注射编码猕猴Hexα和Hexβ的AAV载体的无胸腺裸小鼠中的相对总Hex活性。显示了通过MUG底物测得的HexB，HexA和HexS的体外酶活性，相对于幼稚标准化(C1：嗅球和大脑的前3mm冠状切片，C2：随后的大脑的2mm冠状切片，C3：随后的大脑的3mm冠状切片，其含有注射部位，C4：随后的大脑的2mm的冠状切片，CRBL：小脑，BS：脑干，SC：脊髓)。

图37显示在颅内注射编码猕猴Hexα和Hexβ的AAV载体的无胸腺裸鼠中的相对HexA和HexS活性。显示了通过MUGS底物测得的HexA和HexS的体外酶活性，相对于幼稚标准化(C1：嗅球和大脑的前3mm冠状切片，C2：随后的大脑的2mm冠状切片，C3：随后的大脑的3mm冠状切片，其含有注射部位，C4：随后的大脑的2mm的冠状切片，CRBL：小脑，BS：脑干，SC：脊髓)。

图38A-38B显示了在实质内注射之后的靶向和分布的MRI分析。在图38A中，显示了使用不同序列的术前和术后脑MRI。AAVrh8载体制剂包含2mM钆，以使用T1加权MRI分析注射溶液的分布；该动物中钆的分布体积(Gd增强体积)为1.67mL。在图38B中显示了每个NHP的分布体积(Vd)和平均值±SD；丘脑中的总输注量(Vi)为0.3mL。

图39显示了在90天的实验过程中，注射AAVrh8的NHP的脑MRI。箭头指示三个NHP中丘脑中的高强度信号区域。

图40A-40C显示了在注射后90天，在一些注射AAVrh8的NHP的丘脑中可检测到的脑MRI的高强度。分组1中的1个NHP(图40A)在90天成像时间时在左丘脑中显示出大的高强度，尽管在较早的成像时间点未检测到。图40B显示了分组2中的NHP，其中在第30天开始检测到双侧高强度信号并且一直保持不变直到第90天。在图40中，分组3中的NHP从d30-d90在左丘脑显示高强度信号。

图41显示了冠状脑切片的生检取样。在右(R)或左(L)丘脑中的背(D)和腹(V)样品中测量高于正常值的己糖胺酶。

图42显示了分组1NHP的脑中的神经病理学发现，包括嗜酸性颗粒的神经元内累积，神经变性和噬神经细胞现象。

图43A-43B显示了在分组1中，一只注射AAVrh8的猴的左丘脑中严重的局灶性棘细胞层水肿伴有血管周套扎。图43A是4倍放大倍数拍摄的；图43B是10倍放大倍数拍摄的。

图44A-44B显示了在分组3猴中的神经病理学观察。尽管在这些猴中神经元变性是罕见的(图44A)，但是在猴295709中，存在有血管周格子细胞的证据(图44B)，可能与注射轨道有关。

图45显示了在分组1和分组3中猴的左和右丘脑中嗜酸性物质的神经元内积累的评分。

图46显示了分组1和分组3中猴的右和左丘脑中神经元变性和坏死的评分。

图47显示了分组1和分组3中猴的右和左丘脑中的炎症评分。

图48A-48F显示了颅内注射AAVrh8-cmHex载体导致Sandhoff小鼠脑中Hex表达的增加和GM2神经节苷脂含量的减少。6至8周龄的Sandhoff小鼠接受颅内注射PBS(n＝1；紫色条；n＝1)，AAVrh8-CBA-cmHex-W(绿色条(A)，n＝3，4.68x10

图49A-C显示了本公开描述的启动子的结构示意图。图49A显示了由SEQ ID NO:1表示的CB启动子的结构示意图。图49B显示了由SEQ ID NO:4表示的CB(6)-1启动子的结构示意图。图49C显示了由SEQ ID NO:5表示的P2-I启动子的结构示意图。

图50显示了双重启动子AAV9-Syn1-GFP-2xmiR

图51显示在成年SOD1

图52显示了在注射双重启动子AAV9-Syn1-GFP-2xmiR

图53A-53D显示颅内AAVrh8-mHEXA/B处理增加Sandhoff病(SD)小鼠的寿命，并导致保留的运动表现。通过(图53A)倒置筛网(inverted screen)，(图53B)rotarod和(图53C)线挂钩测试(wire hang test)中的经由TH/ICV或TH/DCN递送用4.68x10

图54A-54D显示SD小鼠中的颅内AAVrh8-mHexA/B处理提供寿命的剂量依赖性延长并延长运动表现。图54A显示了颅内注射到1个月SD小鼠的TH/ICV中的AAVrhh8-mHexA/B的剂量递增实验的Kaplan-Meier存活图。在(图54B)倒置筛网，(图54C)rotarod和(图54D)线挂钩测试中经由TH/ICV递送用4.68x10

图55A-55C显示AAVrh8-mHexA/B的颅内递送对正常小鼠的运动表现影响最小。通过TH/ICV或TH/DCN递送颅内注射4.68x10

图56A-56B显示AAVrh8-mHexA/B处理的颅内递送减少GM2神经节苷脂贮积并导致SD小鼠的中枢神经系统中广泛的己糖胺酶表达。通过TH/ICV注射1.17x10

图57A-57E显示了在TH+ICV注射AAV后SD猫的存活和生物分布。图57A显示未处理的SD猫的存活为4.4+/-0.6个月。图57B显示在AAV处理之后，SD猫的临床疾病发作延迟并且临床体征减弱。图57C是脑的总体图像，显示了切片的位置(左)。原位脑右半球和脊髓的冠状切片，显示了所分析的位置。图57D显示组织化学萘酚染色，其显示正常，SD和代表性猫AAV处理的SD猫中Hex的分布。图57E是SD猫的脑和脊髓中的HexA酶活性。

图58A-58H是AAV介导的基因疗法的治疗功效的生物标志物。图58A显示了SD猫脑的7T MRI，其显示出灰质和白质强度的增加，这是由于白质中的脱髓鞘增加和灰质中的GM2贮积增加所致。TH/ICV递送AAV基因疗法后，灰质和白质强度完全恢复正常化。轻度皮质萎缩是明显的，其在丘脑注射部位处是高强度。图58B是未处理的SD猫的MR光谱术，显示N-乙酰己糖胺(一种以前在SD患者中已报道的有毒代谢物)的增加。TH/ICV递送AAV基因疗法后，这是完全正常化的。图58C是代表性的SD MR谱。图58D是SD+AAV TH/ICV SD猫中的脑脊液(CSF)中的HexA活性。图58E和58F是正常(空心圆)，SD(黑色实心圆)和SD+AAV TH/ICV猫(阴影实心圆)的CSF中的乳酸脱氢酶(图58E)和天冬氨酸转氨酶(图58F)的水平。图58G和58H是SD+AAV TH/ICV猫11-907(图58G)和7-760(图58H)的血清抗体滴度。

图59A-F显示了在SD+AAV小脑延髓池(CM)猫中的临床治疗效果和生物分布。图59A是Kaplan-Meier曲线，显示未处理的SD猫存活4.4+/-0.6个月。通过小脑延髓池经AAV处理的SD猫的存活延长至9.9+/-0.5个月。图59B是临床评分，显示未处理的SD猫中的急剧下降。在具有长表型平台期的SD+AAV猫中下降是减弱的。在由于视力和听力丧失以及肌肉骨骼异常所致的移动丧失前对猫实施安乐死。临床评级得分基于以下临床体征，正常得分为10分，对于每种获得的症状，减去1分：轻微震颤，明显震颤，后肢虚弱，宽基姿态(wide-basedstance)，共济失调，偶尔跌倒，移动受限，前腿痉挛，后腿痉挛，无法移动。图59C显示猫脑，线显示了脑切片(左)，脑的右半球和整个脊髓的位置，显示了生物分布分析的位置。图59D是SD+AAV长期猫的脑和脊髓的HexA活性(MUGS)。1处的粗线表示正常水平。图59E和59F显示了如通过qPCR测量的在各个脑区域中HexA的表达。

图60显示了SD+AAV小脑延髓池(CM)猫中的贮积清除。正常(左)SD(中)和SD+AAVCM长期处理的猫的代表性高碘酸-希夫(PAS)染色。正常猫在脑和小脑中在白质中具有比灰质中更暗的PAS染色，而在脊髓中则相反。SD猫在灰质中比在白质中具有更深的染色并且具有白质中的染色丧失区域(尤其是在脊髓中尤为明显)。经由小脑延髓池注射处理的SD+AAV猫在皮质中的贮积和脱髓鞘增加，而在小脑，脑干和脊髓中正常化。

图61显示了AAV基因疗法后组织病理学的正常化。SD猫在小脑叶，DCN和脑干中表现出变性的神经元。AAV基因疗法后16周，SD猫在所有这些区域中具有正常化的形态，并保留在长期AAV处理的动物中，但浦肯野细胞(Purkinje cell)变性除外。令人感兴趣的是，在齿状核内有神经元的子集，其含有葡萄状(botriod)嗜酸性包涵体(插图，比例尺为5μm)。比例尺10μm。

图62A-62H显示了SD+AAV CM猫中疾病进展和改善的生物标志物。图62A是SD猫的7T MRI，显示出与正常猫相比皮质萎缩，高度强烈的白质和低强度灰质，与白质脱髓鞘和灰质中的脂质贮积相一致。在SD+AAV CM猫中，强度变化持续存在，但皮质萎缩得到改善。SD猫丘脑的MR光谱学显示N-乙酰己糖胺的增加，这通过在处理后16周AAV的CM递送来纠正。在人道终点时的一只CM猫中，NA Hex水平进一步提高。图62B显示了在SD+AAV CM猫中神经胶质细胞标记的肌醇(INS)(神经胶质增生的标志物)和甘油磷酸胆碱+磷酸胆碱(GPC+PCh)(脱髓鞘的标志物)也增加。图62C显示了代表性的MR谱。图62D显示了随时间的SD+AAV CM猫中的CSF HexA。正常水平由虚线表示。图62E-H显示了正常(空心圆)，SD猫(实心圆)和SD+AAVCM猫(浅实心圆)中CSF天冬氨酸转氨酶(AST)活性的细胞毒性标志物。

图63A-63C显示了颅内注射AAVrh8-CB-CI-mHexA/B载体减少CNS中GM2神经节苷脂贮积，伴随己糖苷酶活性的增加，导致SD小鼠的存活改善。SD小鼠接受总剂量4.68x10

图64A-64B显示增加剂量的CSF递送的AAVrh8-CB-CI-mHexA/B载体进一步减少GM2神经节苷脂在脊髓和小脑中的贮积。以增加的CSF剂量(1.17x10

图65是AAV-HexA和AAV-HexB载体基因组的结构的图示。

图66显示了pAAV-CB-ci-hHexA(v2)载体的质粒图。

图67显示了pAAV-CB-ci-hHexB载体的质粒。

图68显示在向单个晚期泰-萨二氏病受试者施用rAAVrh8-HexA/B之前和之后，血清和CSF中的HexA酶活性。

图69显示了处理前和处理后的MRI扫描，显示了与基线MRI相比额叶和顶叶中的白质(约2年差异)。

图70显示了在施用一剂利妥昔单抗后受试者的CD19和CD20计数，以及在IVIg输注后的IgG计数。

图71显示了脑脊液(CSF)中的GM2神经节苷脂从基线减少约25％。

图72显示了在处理后第0天和3个月时的HEXA，HEXB和TTR的western印迹染色。

图73显示了临床研究治疗设计。

图74A-74C显示了在小脑延髓池和腰L2水平基于导管的AAVrh8载体施用的实例。

图75A-75G显示了通过荧光镜检查引导血管内微导管至绵羊的小脑延髓池的rAAV施用方法的一个实施方案。图75A显示了荧光镜检查引导的血管内微导管的前进。图75B显示了微导管尖端的最终放置。图75C显示了死后脊髓的总体照片。图75D显示了通过免疫组织化学在脊髓切片中GFP的表达。图75E-75G显示通过免疫组织化学得到的脑切片中的GFP表达。

发明详述

在某些情况下，用当前的rAAV载体递送转基因导致未降解底物的积累或溶酶体区室的失调，从而导致上调溶酶体的生物发生(biogenesis)，底物减少或胞吐的响应。此外，通过rAAV载体驱动的转基因表达引入超生理水平的治疗性蛋白质也可触发有害的保护级联，其可能与这些病症中常见的未折叠的蛋白质响应有关。

因此，在一些方面，本公开提供了用于在组织例如CNS组织中表达溶酶体酶的组合物(例如，分离的核酸，rAAV，rAAV载体等)。在一些方面，本公开涉及使用本文所述的rAAV治疗溶酶体贮积病，例如GM1神经节苷脂贮积病，泰-萨二氏病或Sandhoff病的方法。本公开部分地基于以下发现：可以将某些调节序列和元件，例如启动子区域，工程化改造以用于rAAV中，从而提供治疗有效但不会引起与以前使用的rAAV有关的载体介导的基因毒性的转基因表达水平。

分离的核酸

在一些方面，本公开提供了一种核酸，其包含与启动子可操作连接的至少一种转基因，其中转基因编码与溶酶体贮积病相关的蛋白(例如，溶酶体贮积蛋白，例如HexA和/或HexB和GLB1)。

在一些实施方案中，GLB1转基因是人GLB1基因(GeneID:2720)。人GLB1基因可以包含NM_000404.4,NM_001079811.2,NM_001135602.2或NM_001317040.1的核苷酸序列。人GLB1基因编码β-半乳糖苷酶蛋白。人β-半乳糖苷酶蛋白可包含NP_000395.3,NP_001073279.1,NP_001129074.1或NP_001303969.1中的氨基酸序列。在一些实施方案中，人GLB1包含如SEQ ID NO:23中的序列。在一些实施方案中，人HexA转基因(GeneID:3073)包含NM_000520.5或NM_001318825.1中的核苷酸序列。在一些实施方案中，HexA蛋白由NCBI参考序列号NP_000511.2(SEQ ID NO:20)或NP_001305754.1中列出的序列表示。在一些实施方案中，人HexB转基因(GeneID:3074)包含NM_000521.4或NM_001292004.1中的核苷酸序列。在一些实施方案中，HexB蛋白由NCBI参考序列号NP_000512.1(SEQ ID NO:21)或NP_001278933.1中列出的序列表示。

编码与溶酶体贮积病相关的蛋白质的转基因可以与启动子可操作连接。如本文所用，“可操作接头”是指与下游转基因连接并促进其表达的启动子。在一些实施方案中，所述启动子是组成型启动子，例如鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子，逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地与RSV增强子一起)，巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地与CMV增强子)[参见例如Boshart et al.,Cell,41:521-530(1985)]，SV40启动子，二氢叶酸还原酶启动子，β-肌动蛋白启动子，磷酸甘油激酶(PGK)启动子，和EF1α启动子[Invitrogen]。在一些实施方案中，启动子是增强的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子是U6启动子。在一些实施方案中，鸡β-肌动蛋白启动子包含SEQ ID NO:22所示的序列。

在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。诱导型启动子允许基因表达的调节，并且可以通过外源提供的化合物，环境因素如温度或特定生理状态如急性期，细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中调节。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen，Clontech和Ariad。已经描述了许多其他系统，并且是本领域技术人员可以容易选择的。由外源提供的启动子调控的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子，地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子，T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))，四环素可抑制系统(Gossen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))，即四环素诱导系统(Gossen et al.,Science,268:1766-1769(1995),也可见Harvey et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))，RU486诱导系统(Wanget al.,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang et al.,Gene Ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导系统(Magari et al.,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。在这种情况下可能有用的其他类型的诱导型启动子是受特定生理状态如温度，急性期，细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中调节的那些。

在另一个实施方案中，可使用转基因的天然启动子(例如，GLB1，HEXA或HEXB)。当期望转基因的表达应模仿天然表达时，天然启动子可以是优选的。当必须在时间或发育上，或以组织特异性方式或响应于特定转录刺激物调节转基因的表达时，可以使用天然启动子。在另一个实施方案中，其他天然表达控制元件，例如增强子元件，聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列也可以用于模拟天然表达。

在一些实施方案中，启动子驱动神经元组织中的转基因表达。在一些实施方案中，本公开提供了可操作地包含与转基因可操作连接的组织特异性启动子的核酸，其中转基因编码溶酶体贮积病蛋白。如本文所用，“组织特异性启动子”是指相对于其他细胞类型优先调节(例如，驱动或上调)特定细胞类型中的基因表达的启动子。细胞类型特异性启动子可以对任何细胞类型具有特异性，例如中枢神经系统(CNS)细胞，肝脏细胞(例如肝细胞)，心脏细胞，肾细胞，眼细胞，肌肉细胞等。人突触蛋白1启动子(Syn1启动子)优先驱动神经元中的基因表达，而GfaABC1D(也称为GFAP)启动子优先驱动星形胶质细胞中的表达。然而，应当理解，几种细胞类型可以驻留在特定类型的组织内。例如，中枢神经系统组织包括神经元细胞和非神经元细胞(例如神经胶质细胞，星形胶质细胞等)。

在一些实施方案中，分离的核酸包含至少两个转基因，其编码与溶酶体贮积病相关的蛋白质(例如，HEXA和HEXB)。第一转基因和第二转基因可以与至少一个启动子可操作连接。在一些实施方案中，第一转基因编码HEXA，并且第二转基因编码HEXB。HEXA转基因和HEXB转基因可以可操作连接至相同的启动子，或者它们可以可操作连接至第一启动子和第二启动子。第一启动子和/或第二启动子可以是组成型的(例如，CBA)。或者，第一启动子和/或第二启动子可以是诱导型的。另外，第一启动子和/或第二启动子可以是组织特异性启动子。在一些实施方案中，第一启动子对神经元是特异性的，并且任选地是突触蛋白1启动子(Syn1启动子)。在一些实施方案中，Syn1启动子由SEQ ID NO:13表示。在一些实施方案中，第二启动子对星形胶质细胞是特异性的，并且任选地是GFAP启动子。在一些实施方案中，GFAP启动子由SEQ ID NO:14表示。

组织特异性启动子的其他例子包括但不限于肝特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子，胰岛素启动子，胰高血糖素启动子，促生长素抑制素启动子，胰多肽(PPY)启动子，突触蛋白1(Syn1)启动子，肌酸激酶(MCK)启动子，哺乳动物结蛋白(DES)启动子，α-肌球蛋白重链(a-MHC)启动子或心脏肌钙蛋白T(cTnT)启动子。其他示例性的启动子包括β-肌动蛋白启动子，乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig et al.,Gene Ther.,3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)启动子，Arbuthnot et al.,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996))，骨的骨钙素启动子(Stein et al.,Mol.Biol.Rep.,24:185-96(1997))；骨涎蛋白启动子(Chen et al.,J.Bone Miner.Res.,11:654-64(1996))，CD2启动子(Hansal et al.,J.Immunol.,161:1063-8(1998)；免疫球蛋白重链启动子；T细胞受体α链启动子，神经元的，例如神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen et al.,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993))，神经丝轻链基因启动子(Piccioli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991))和神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli et al.,Neuron,15:373-84(1995))等，这对于熟练的技术人员是显而易见的。

在一些方面，本公开涉及分离的核酸，其包含通过嵌合内含子可操作连接至启动子的转基因(例如溶酶体贮藏蛋白，例如GLB1，HexA，HexB和/或HexA和HexB)。在一些实施方案中，嵌合内含子包含来自鸡β-肌动蛋白基因的核酸序列，例如来自鸡β-肌动蛋白基因的内含子1的非编码内含子序列。在一些实施方案中，鸡β-肌动蛋白基因的内含子序列的长度在约50至约150个核苷酸的范围内(例如，在50至150个核苷酸之间的任何长度，包括端值在内)。在一些实施方案中，鸡β-肌动蛋白基因的内含子序列的长度在约100至120(例如100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119或120)个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，嵌合内含子与一个或多个非翻译序列(例如，位于启动子序列和嵌合内含子序列之间的非翻译序列和/或位于嵌合内含子和转基因序列的第一密码子之间的非翻译序列)相邻。在一些实施方案中，一个或多个非翻译序列的每一个是来自兔β-珠蛋白基因的非编码序列(例如，来自兔β-珠蛋白外显子1，外显子2等的非翻译序列)。

重组AAV

本公开的分离的核酸可以是重组腺相关病毒(rAAV)。在一些实施方案中，如本公开所描述的分离的核酸包括包含第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)或其变体的区域(例如，第一区域)和编码与溶酶体贮积病相关的转基因(例如，GLB1，HEXA和/或HEXB)的第二区域。分离的核酸(例如，重组AAV载体)可以包装到壳体蛋白中并施用于受试者和/或递送至选定的靶细胞。如本公开中其他地方所述，转基因还可以包含编码例如蛋白质的区域和/或表达控制序列(例如，poly-A尾巴)。

本公开提供了包含单个顺式作用野生型ITR的载体。在某些实施方案中，ITR是5’ITR。在一些实施方案中，ITR是3’ITR。通常，ITR序列的长度为约145bp。优选地，分子中基本上使用整个编码ITR的序列，尽管允许对这些序列进行一定程度的较小修饰。修饰ITR序列的能力在本领域技术范围内。(参见，例如教科书，诸如Sambrook et al,"MolecularCloning.A Laboratory Manual",2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；和K.Fisher et al.,J Virol.,70:520 532(1996))。例如，ITR可以在其末端解析位点(TR)发生突变，这会抑制在TR发生突变的载体末端处的复制，并导致形成自互补AAV。本公开中使用的此类分子的另一个实例是包含转基因的“顺式作用”质粒，其中选定的转基因序列和相关的调控元件的侧翼是5’AAV ITR序列和3’发夹形成RNA序列。AAV ITR序列可以从任何已知的AAV获得，包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型。在一些实施方案中，ITR序列是AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAVrh8,AAV9,AAV10和/或AAVrh10 ITR序列。

可以修饰和/或选择本公开的分离的核酸和/或rAAV以增强分离的核酸和/或rAAV对靶组织(例如CNS)的靶向。修饰和/或选择的非限制性方法包括AAV壳体血清型(例如AAV8，AAV9)，组织特异性启动子(例如Syn1，GFAP)和/或靶向肽。在一些实施方案中，本公开的分离的核酸和rAAV包括针对CNS组织的靶向增强的AAV壳体血清型(例如，AAV8，AAV9)。在一些实施方案中，本公开的分离的核酸和rAAV包含组织特异性启动子(例如，Syn1，GFAP)。在一些实施方案中，本公开的分离的核酸和rAAV包括对CNS组织的靶向增强的AAV壳体血清型和组织特异性启动子。

在一些方面，本公开提供了分离的AAV。如本文关于AAV所使用，术语“分离的”是指已经人工获得或产生的AAV。分离的AAV可以使用重组方法产生。此类AAV在本文中被称为“重组AAV”。重组AAV(rAAV)优选具有组织特异性靶向能力，使得可将rAAV的转基因特异性地递送至一个或多个预定组织。AAV壳体是确定这些组织特异性靶向能力的重要元素。因此，可以选择具有适合于被靶向的组织的壳体的rAAV。在一些实施方案中，rAAV包含AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAVrh8,AAV9,AAV10或AAVrh10壳体蛋白，或与其具有实质同源性的蛋白。在一些实施方案中，rAAV包含AAVrh8壳体蛋白。

在一些实施方案中，本公开的rAAV是假型化rAAV。假型化是与外来病毒包膜蛋白组合产生病毒或病毒载体的过程。结果是假型化的病毒颗粒。通过这种方法，外来病毒包膜蛋白可用于改变宿主嗜性或病毒颗粒稳定性的提高/降低。在一些方面，假型化rAAV包含来自两个或更多个不同AAV的核酸，其中来自一个AAV的核酸编码壳体蛋白，并且至少一个其他AAV的核酸编码其他病毒蛋白和/或病毒基因组。在一些实施方案中，假型化rAAV是指包含一种AAV血清型的反向末端重复(ITR)和另一种AAV血清型的壳体蛋白的AAV。例如，将含有用Y蛋白壳体化的血清型X的ITR的假型化AAV载体命名为AAVX/Y(例如，AAV2/1具有AAV2的ITR和AAV1的壳体)。在一些实施方案中，假型化rAAV可用于组合来自一种AAV血清型的壳体蛋白的组织特异性靶向能力与来自另一AAV血清型的病毒DNA，从而允许转基因靶向递送至靶组织。

获得具有期望壳体蛋白的重组AAV的方法是本领域众所周知的。(参见，例如，美国专利申请公开号US 2003/0138772，其内容通过引用整体并入本文)。通常，该方法涉及培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码AAV壳体蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；重组AAV载体，其由AAV反向末端重复(ITR)和转基因组成；以及足够的辅助功能以允许将重组AAV载体包装到AAV壳体蛋白中。通常，壳体蛋白是由AAV的cap基因编码的结构蛋白。在一些实施方案中，AAV包含三个壳体蛋白，病毒体蛋白1-3(命名为VP1，VP2和VP3)，所有这些都通过可变剪接从单个cap基因转录。在一些实施方案中，VP1，VP2和VP3的分子量分别为约87kDa，约72kDa和约62kDa。在一些实施方案中，在翻译后，壳体蛋白在病毒基因组周围形成球形的60聚体蛋白壳。在一些实施方案中，壳体蛋白保护病毒基因组，递送基因组和/或与宿主细胞相互作用。在一些方面，壳体蛋白以组织特异性方式将病毒基因组递送至宿主。

在一些实施方案中，AAV壳体蛋白属于选自下组的AAV血清型：AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV8,AAVrh8 AAV9,AAV10和AAVrh10组成的组的AAV血清型。在一些实施方案中，AAV壳体蛋白属于AAVrh8或AAVrh10血清型。在一些实施方案中，AAV壳体蛋白属于AAVrh8血清型。

在一些实施方案中，可以对宿主细胞方式提供要在宿主细胞中培养以将rAAV载体包装在AAV壳体中的组分。或者，可以由稳定的宿主细胞提供任何一种或多种所需组分(例如，重组AAV载体，rep序列，cap序列和/或辅助功能)，所述稳定宿主细胞使用本领域技术人员已知的方法经工程化改造以包含一种或多种所需组分。最合适地，此类稳定的宿主细胞可在诱导型启动子的控制下包含所需的组分。但是，所需的成分可以在组成型启动子的控制下。在适合与转基因一起使用的调控元件的讨论中，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的实例。在另一个替代方案中，选择的稳定宿主细胞可以包含在组成型启动子控制下的选择的组分和在一个或多个诱导型启动子控制下的其他选择的组分。例如，可产生稳定的宿主细胞，其衍生自293细胞(其包含在组成型启动子的控制下E1辅助功能)，但在诱导型启动子的控制下包含rep和/或cap蛋白。本领域技术人员还可以产生其他稳定的宿主细胞。

在一些实施方案中，本公开涉及包含核酸的宿主细胞，所述核酸包含与启动子可操作连接的选自下组的编码序列：SEQ ID NO:1-6。在一些实施方案中，本公开涉及包含上述宿主细胞的组合物。在一些实施方案中，包含上述宿主细胞的组合物还包含冷冻保存剂。

可用于产生本公开的rAAV的重组AAV载体，rep序列，cap序列和辅助功能可使用任何适当的遗传元件(载体)递送至包装宿主细胞。选定的遗传元件可以通过任何合适的方法递送，包括本文所述的那些。用于构建本公开的任何实施方案的方法是核酸操作技术人员已知的，并且包括基因工程，重组工程和合成技术。参见例如Sambrook et al,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y。类似地，产生rAAV病毒体的方法是众所周知的，并且合适方法的选择不限制本公开。参见，例如K.Fisher et al,J.Virol.,70:520-532(1993)和美国专利No.5,478,745。

在一些实施方案中，可以使用三重转染方法(在美国专利号6,001,650中详细描述)产生重组AAV。通常，通过用要包装成AAV颗粒的重组AAV载体(包含转基因)，AAV辅助功能载体和辅助功能载体转染宿主细胞来生产重组AAV。AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(即rep和cap)，该序列反式起作用以实现有效的AAV复制和壳体化。优选地，AAV辅助功能载体支持有效的AAV载体生产而不产生任何可检测的野生型AAV病毒体(即，包含功能性rep和cap基因的AAV病毒体)。适用于本发明的载体的非限制性实例包括描述于美国专利No.6,001,650的pHLP19和描述于美国专利No.6,156,303的pRep6cap6载体，其全部内容通过引用并入本文。辅助功能载体编码AAV进行复制依赖的非AAV衍生的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列(即“辅助功能”)。辅助功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于参与AAV基因转录的激活，阶段特异性AAV mRNA剪接，AAV DNA复制，cap表达产物的合成和AAV壳体装配的那些部分。基于病毒的辅助功能可以源自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒，疱疹病毒(除单纯疱疹病毒1型以外)和痘苗病毒。

在一些方面，本公开提供了转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞吸收外源DNA，并且当外源DNA已经通过细胞膜被引入时，已经“转染”细胞。许多转染技术是本领域公知的。参见，例如Graham et al.(1973)Virology,52:456,Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,NewYork,Davis et al.(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier,and Chu etal.(1981)Gene 13:197。此类技术可用于将一种或多种外源核酸，例如核苷酸整合载体和其他核酸分子引入合适的宿主细胞中。

“宿主细胞”是指包含或能够包含目的物质的任何细胞。通常，宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可用作AAV辅助构建体，AAV小基因质粒，辅助功能载体或与重组AAV的产生相关的其他转移DNA的受体。该术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用，“宿主细胞”可以指已经用外源DNA序列转染的细胞。应当理解，由于自然，偶然或故意的突变，单个亲本细胞的后代在形态或基因组或总DNA互补物上不一定与原始亲本完全相同。

如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外连续或延长生长和分裂的细胞群。通常，细胞系是源自单个祖细胞的克隆群体。在本领域中进一步已知在此类克隆群体的贮存或转移过程中，核型可以发生自发或诱导的变化。因此，源自细胞系的细胞可以与祖细胞或培养物不完全相同，并且提及的细胞系包括此类变体。

如本文所用，术语“重组细胞”是指如下的细胞，其中已经导入外源DNA片段，例如导致生物活性多肽转录或生物活性核酸如RNA产生的DNA片段。

如本文所用，术语“载体”包括任何遗传元件，例如质粒，噬菌体，转座子，粘粒，染色体，人工染色体，病毒，病毒体等，其在与适当的控制元件结合时能够复制并且可以在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆和表达媒介物，以及病毒载体。在一些实施方案中，有用的载体被认为是其中待转录的核酸区段位于启动子的转录控制下的那些载体。“启动子”是指被细胞的合成机器或引入的合成机器识别的，启动基因的特异性转录所需要的DNA序列。短语“可操作地定位”，“在控制下”或“在转录控制之下”是指启动子相对于核酸而言处于正确的位置和方向，以控制基因的RNA聚合酶的起始和表达。术语“表达载体或构建体”是指包含核酸的任何类型的遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。在一些实施方案中，表达包括核酸的转录，例如以从转录的基因产生生物活性多肽产物或抑制性RNA(例如，shRNA，miRNA，miRNA抑制剂)。

用于将重组载体包装在期望的AAV壳体中以产生本公开的rAAV的前述方法并不意味着是限制性的，并且其他合适的方法对于技术人员将是显而易见的。

重组AAV载体

本公开的分离的核酸可以是重组AAV(rAAV)载体。本发明的“重组AAV(rAAV)载体”通常至少由转基因及其调节序列以及5’和3’AAV反向末端重复(ITR)组成。正是这种重组AAV载体包装到壳体蛋白中并递送至选定的靶细胞。在一些实施方案中，转基因是与载体序列异源的核酸序列，其编码感兴趣的多肽，蛋白质，功能性RNA分子(例如，miRNA，miRNA抑制剂)或其他基因产物。核酸编码序列以允许转基因在靶组织的细胞中转录，翻译和/或表达的方式与调节成分可操作连接。

本公开的方面涉及以下发现：修饰rAAV的调节序列提供了治疗有效，但不引起与先前使用的rAAV相关的载体介导的毒性的转基因表达水平。因此，在一些实施方案中，本公开涉及包含修饰的遗传调控元件的重组AAV(rAAV)。在一些实施方案中，修饰的遗传调控元件是杂合启动子。

如本文所用，术语“杂合启动子”是指能够驱动RNA转录物(例如，包含由转基因编码的转录物)转录的调节构建体，其中所述构建体包含两个或更多个人工布置的调节元件。通常，杂合启动子包含至少一个作为最小启动子的元件和至少一个具有增强子序列或包含一个或多个转录调控元件的内含子，外显子或UTR序列的元件。在杂合启动子包含外显子，内含子或UTR序列的实施方案中，此类序列可以编码RNA转录物的上游部分(例如，如图1所示)，还包含调节(例如，增强)转录物的转录的调节元件。在一些实施方案中，杂合启动子的两个或更多个元件相对于彼此来自异源来源。在一些实施方案中，杂合启动子的两个或更多个元件相对于转基因来自异源来源。在一些实施方案中，杂合启动子的两个或更多个元件来自不同的遗传基因座。在一些实施方案中，杂合启动子的两个或更多个元件来自相同的基因座，但是以在遗传基因座处未发现的方式排列。在一些实施方案中，杂合启动子包含来自与一个或多个核酸序列融合的一个启动子的第一核酸序列，所述核酸序列包含差异来源的启动子或增强子元件。在一些实施方案中，杂合启动子包含来自鸡β-肌动蛋白启动子的第一序列和CMV增强子的第二序列。在一些实施方案中，杂合启动子包含来自鸡β-肌动蛋白启动子的第一序列和来自鸡β-肌动蛋白基因的内含子的第二序列。在一些实施方案中，杂合启动子包含来自与CMV增强子序列融合的鸡β-肌动蛋白启动子的第一序列和来自鸡β肌动蛋白基因的内含子的序列。

在一些方面，rAAV包括增强子元件。如本文所用，术语“增强子元件”是指当被激活蛋白结合时激活或增加一个或多个基因的转录的核酸序列。相对于它们调控的基因，增强子序列可以在上游(即5’)或下游(即3’)。增强子序列的实例包括巨细胞病毒(CMV)增强子序列和猿猴空泡形成病毒40(SV40)增强子序列。在一些实施方案中，rAAV包括CMV增强子元件或其一部分。如本文所用，术语“其一部分”是指核苷酸或氨基酸序列的片段，其保留其衍生自的整个核苷酸或氨基酸序列的所需功能特性。例如，“CMV增强子序列或其一部分”是指能够增加转基因转录的源自野生型CMV增强子的核苷酸序列。

在一些方面，rAAV包含转录后应答元件。如本文所用，术语“转录后应答元件”是指当转录时采用增强基因表达的三级结构的核酸序列。转录后调控元件的实例包括但不限于土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，小鼠RNA转运元件(RTE)，猿猴逆转录病毒1型(SRV-1)的组成型转运元件(CTE)，Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)的CTE，以及人热休克蛋白70的5’非翻译区(Hsp70 5’UTR)。在一些实施方案中，rAAV载体包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。

在一些方面，本公开提供了包含杂合或嵌合内含子的rAAV载体。如本文所用，术语“嵌合内含子”是指具有来自两个或更多个不同来源的序列的内含子。在一些实施方案中，嵌合内含子包含编码来自第一来源(例如，生物体或物种)的剪接供体位点和来自第二来源(例如，生物体或物种)的剪接受体位点的核酸。在一些实施方案中，嵌合内含子包含一个或多个转录调控元件和/或增强子序列。在一些实施方案中，嵌合内含子位于杂合启动子的外显子与转基因之间。在一些实施方案中，本公开提供了rAAV，其包含与转基因可操作连接的启动子，其中所述转基因编码溶酶体贮积蛋白，并且其中所述rAAV还包含嵌合内含子。

在某些实施方案中，本公开涉及包含人工转录元件的rAAV载体。如本文所用，在一些实施方案中，术语“人工转录元件”是指能够通过RNA聚合酶控制DNA的转录以产生RNA转录物的合成序列。本公开的转录活性元件通常小于500bp，优选小于200bp，更优选小于100bp，最优选小于50bp。在一些实施方案中，人工转录元件包含来自转录活性元件的两个或更多个核酸序列。转录活性元件在本领域中通常是公认的，包括例如启动子，增强子序列，TATA框，G/C框，CCAAT框，特异性蛋白1(Sp1)结合位点，Inr区，CRE(cAMP调节元件)，活化转录因子1(ATF1)结合位点，ATF1-CRE结合位点，APBβ框，APBα框，CArG框，CCAC框以及美国专利No.6,346,415中公开的那些。还考虑前述转录活性元件的组合。

在一些实施方案中，人工转录元件包含启动子序列。在一些实施方案中，人工转录元件包含增强子序列。在一些实施方案中，人工转录元件包含ATF1-CRE结合位点。在一些实施方案中，人工转录元件包含SP1结合位点。在一些实施方案中，人工转录元件包含C框。在一些实施方案中，人工转录元件包含TATA框。在一些实施方案中，人工转录元件包含ATF1-CRE结合位点，SP1结合位点和TATA框。在一些实施方案中，人工转录元件由SEQ ID NO:2表示。

表达控制序列包括适当的转录起始，终止，启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号，例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；当需要时，增强编码产物分泌的序列。许多表达控制序列(包括天然的，组成型，诱导性和/或组织特异性的启动子)在本领域中是已知的并且可以加以利用。

如本文所用，当核酸序列(例如，编码序列)和调节序列以使核酸序列的表达或转录处于调节序列影响下或在调节序列控制下的方式共价连接时，它们被称为“可操作地”连接。如果期望将核酸序列翻译成功能蛋白，则如果在5’调节序列中诱导启动子导致编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接性质不(1)导致移码突变的引入；(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应的RNA转录物被翻译成蛋白质的能力，则认为两个DNA序列是可操作连接的。因此，如果启动子区域能够实现该DNA序列的转录，使得所得的转录物可以翻译成所需的蛋白质或多肽，则该启动子区域将可操作连接至核酸序列。类似地，当两个或更多个编码区以使得其从共同启动子的转录导致已在框内翻译的两个或更多个蛋白质的表达的方式连接时，它们是可操作连接的。在一些实施方案中，可操作连接的编码序列产生融合蛋白。在一些实施方案中，可操作连接的编码序列产生功能性RNA(例如，shRNA，miRNA，miRNA抑制剂)。

对于编码蛋白质的核酸，通常在转基因序列之后和3’AAV ITR序列之前插入聚腺苷酸化序列。可用于本公开的rAAV构建体还可包含内含子，其期望地位于启动子/增强子序列与转基因之间。一种可能的内含子序列衍生自SV-40，被称为SV-40T内含子序列。

可以使用的另一种载体元件是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列用于从单个基因转录物中产生超过一个多肽。IRES序列可用于产生包含超过一个多肽链的蛋白质。这些和其他常见载体元件的选择是常规的，并且许多此类序列是可用的[参见例如Sambrooket al和其中引用的任何参考文献，例如于3.18 3.26和16.17 16.27页和Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1989]。在一些实施方案中，手足口病病毒2A序列包含在多蛋白中；例如，这是一种小肽(长度约18个氨基酸)，已显示出介导多蛋白的切割(Ryan,M D et al.,EMBO,1994；4:928-933；Mattion,N Met al.,J Virology,November 1996；p.8124-8127；Furler,S et al.,Gene Therapy,2001；8:864-873；和Halpin,C et al.,The Plant Journal,1999；4:453-459)。2A序列的切割活性先前已在包括质粒和基因治疗载体(AAV和逆转录病毒)的人工系统中得到证实(AAVand retroviruses)(Ryan,M D et al.,EMBO,1994；4:928-933；Mattion,N M et al.,JVirology,November 1996；p.8124-8127；Furler,S et al.,Gene Therapy,2001；8:864-873；and Halpin,C et al.,The Plant Journal,1999；4:453-459；de Felipe,P et al.,Gene Therapy,1999；6:198-208；de Felipe,P et al.,Human Gene Therapy,2000；11:1921-1931.；和Klump,H et al.,Gene Therapy,2001；8:811-817)。

宿主细胞中基因表达所需的调节序列的确切性质可以在物种，组织或细胞类型间变化，但通常应视需要包括分别与转录和翻译的起始有关的5’非转录序列和5’非翻译序列，例如TATA框，加帽序列，CAAT序列，增强子等。特别地，此类5’非转录调节序列将包括启动子区域，该启动子区域包括用于可操作连接的基因的转录控制的启动子序列。调节序列还可根据需要包括增强子序列或上游激活子序列。本公开的载体可以任选地包括5’前导序列或信号序列。

组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地带有RSV增强子)，巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地带有CMV增强子)[参见，例如Boshart et al,Cell,41:521-530(1985)]，SV40启动子，二氢叶酸还原酶启动子，β-肌动蛋白启动子，磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子[Invitrogen]。

诱导型启动子允许基因表达的调节，并且可以通过外源提供的化合物，环境因素如温度或特定生理状态如急性期，细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中调节。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen，Clontech和Ariad。已经描述了许多其他系统，并且是本领域技术人员可以容易地选择的。由外源提供的启动子调控的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子，地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子，T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))，四环素可抑制系统(Gossen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))，即四环素诱导系统(Gossen et al.,Science,268:1766-1769(1995),也可见Harvey et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))，RU486诱导系统(Wang et al.,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang et al.,Gene Ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导系统(Magari et al.,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。在这种情况下可能有用的其他类型的诱导型启动子是受特定生理状态如温度，急性期，细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中调节的那些。

载体的AAV序列通常包含顺式作用的5’和3’反向末端重复(参见，例如B.J.Carter,于“Handbook of Parvoviruses”,P.Tijsser编,CRC Press,pp.155 168(1990))。通常，ITR序列的长度为约145bp。优选地，分子中基本上使用整个编码ITR的序列，尽管允许对这些序列进行一定程度的较小修饰。修饰ITR序列的能力在本领域技术范围内。(参见，例如教科书，诸如Sambrook et al,"Molecular Cloning.A Laboratory Manual",2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；和K.Fisher et al.,JVirol.,70:520 532(1996))。本公开中使用的此类分子的另一个实例是包含转基因的“顺式作用”质粒，其中选定的转基因序列和相关的调控元件的侧翼是5’和3’AAV ITR序列。AAVITR序列可以从任何已知的AAV获得，包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型。

在一些实施方案中，本公开的rAAV是假型化rAAV。例如，将含有用Y蛋白壳体化的血清型X的ITR的假型化AAV载体命名为AAVX/Y(例如，AAV2/1具有AAV2的ITR和AAV1的壳体)。在一些实施方案中，假型化rAAV可用于组合来自一种AAV血清型的壳体蛋白的组织特异性靶向能力与来自另一AAV血清型的病毒DNA，从而允许转基因靶向递送至靶组织。

除了上面鉴定的用于重组AAV载体的主要元件外，该载体还包括必需的常规控制元件，这些元件以允许其在用质粒载体转染或用本公开产生的病毒感染的细胞中转录，翻译和/或表达的方式与转基因可操作连接。如本文所用，“可操作连接”的序列既包括与目的基因邻接的表达控制序列，又包括反式或以一定距离起作用以控制目的基因的表达控制序列。

重组AAV载体：转基因编码序列

rAAV载体的转基因序列的组成取决于所得载体所处的用途。例如，一种类型的转基因序列包括报告物序列，其在表达时产生可检测的信号。在另一个实例中，转基因编码治疗性蛋白质或治疗性功能性RNA。在另一个实例中，转基因编码旨在用于研究目的的蛋白质或功能性RNA，例如，以产生具有该转基因的体细胞转基因动物模型，例如以研究转基因产物的功能。在另一个实例中，转基因编码旨在用于创建疾病的动物模型的蛋白质或功能性RNA。合适的转基因编码序列对本领域技术人员将是显而易见的。

在一些方面，本公开涉及可用于治疗溶酶体贮积病的rAAV载体。溶酶体贮积病(也称为溶酶体贮积疾病)是一组由溶酶体功能缺陷引起的遗传性代谢病症。通常，溶酶体贮积病的特征在于参与溶酶体代谢的单一蛋白质(例如酶)的功能受损。例如，泰-萨二氏病是由己糖胺酶A(HEXA)基因的遗传突变引起的，导致HEXA酶无法水解GM

在一些实施方案中，本公开提供了rAAV，其包含编码溶酶体贮积病相关蛋白的转基因。在一些实施方案中，溶酶体贮积病相关蛋白选自：HEXA，HEXB和GLB1。在一些实施方案中，溶酶体贮积病相关蛋白是HEXA，并且包含SEQ ID NO:20所示的序列。在一些实施方案中，溶酶体贮积病相关蛋白是HEXB，并且包括SEQ ID NO:21所示的序列。在一些实施方案中，溶酶体贮积病相关蛋白是GLB1，并包含SEQ ID NO:23所示的序列。

本文还考虑了治疗溶酶体贮积病的方法，通过使用本文所述的rAAV将转基因递送至受试者来进行。在一些实施方案中，本公开涉及用于治疗溶酶体贮积病的方法，该方法包括向受试者施用rAAV。在一些实施方案中，rAAV包含杂合启动子。在一些实施方案中，rAAV包含嵌合内含子。在一些实施方案中，rAAV包含人工转录元件。在一些实施方案中，人工转录元件包含ATF1-CRE结合位点，SP1结合位点和TATA框。在一些实施方案中，启动子，嵌合内含子或人工转录元件可操作连接至转基因。在一些实施方案中，转基因是与溶酶体贮积病有关的转基因。在一些实施方案中，转基因选自HEXA，HEXB和GLB1。在一些实施方案中，溶酶体贮积病是GM2神经节苷脂贮积病(Sandhoff病和泰-萨二氏病)，并且rAAV包含编码HEXA和HEXB的转基因。在一些实施方案中，溶酶体贮积病是GM1神经节苷脂贮积病，并且转基因编码GLB1。

在一些方面，本公开提供了包含壳体的rAAV，所述壳体包含具有与第一转基因可操作连接的第一细胞类型特异性启动子和与第二转基因连接的第二细胞类型特异性启动子的核酸，其中第一启动子和第二启动子对同一细胞类型不是特异性的。不希望受到任何特定理论的束缚，在某些实施方案中，此类rAAV载体可用于治疗影响给定组织(例如CNS组织)内多种细胞类型的疾病。

因此，在一些方面，本公开涉及可用于治疗CNS相关疾病的rAAV载体。如本文所用，“CNS相关疾病”是指中枢神经系统的疾病或病状。与CNS相关的疾病可影响脊髓(例如脊髓病)，脑(例如脑病)或脑和脊髓周围的组织。与CNS相关的病症可以是遗传起源，遗传的或通过体细胞突变获得的。与CNS相关的病症可以是心理状况或病症，例如注意力不足多动症(Attention Deficient Hyperactivity Disorder)，自闭症谱系障碍(Autism SpectrumDisorder)，情绪障碍(Mood Disorder)，精神分裂症，抑郁症，Rhett综合征等。与CNS相关的病症可以是自身免疫性病症。与CNS相关的病症也可以是CNS的癌症，例如脑癌。作为癌症的与CNS相关的病症可以是CNS的原发癌，例如星形细胞瘤，胶质母细胞瘤等，或者可以是已经转移到CNS组织的癌症，例如已经转移到脑的肺癌。与CNS相关的病症的其他非限制性例子包括亨廷顿氏病，帕金森氏病，溶酶体贮积病，缺血，神经性疼痛，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，多发性硬化(MS)，卡纳万病(CD)，额颞叶变性(FTLD)，脊髓小脑性共济失调，脊髓和延髓性肌萎缩，齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩和弗雷德里希共济失调(Freiderich’s ataxia)。

在一些实施方案中，本公开描述的rAAV载体包含编码CNS疾病相关基因的转基因。在一些实施方案中，编码CNS疾病相关基因的转基因编码蛋白质或干扰RNA。干扰RNA的例子包括但不限于dsRNA，siRNA，shRNA，miRNA和人工miRNA(amiRNA)。与CNS疾病相关的基因的例子包括但不限于DRD2,GRIA1,GRIA2,GRIN1,SLC1A1,SYP,SYT1,CHRNA7,3Rtau/4rTUS,APP,BAX,BCL-2,GRIK1,GFAP,IL-1,AGER，与阿尔茨海默氏病有关；UCH-L1,SKP1,EGLN1,Nurr-1,BDNF,TrkB,gstm1,S106β，与帕金森氏病相关；亨廷顿蛋白(Htt)，IT15,PRNP,JPH3,TBP,ATXN1,ATXN2,ATXN3,Atrophin 1,FTL,TITF-1,Xbp1s,CRAG，与亨廷顿氏病相关；FXN，与弗雷德里希共济失调相关；ASPA，与卡纳万病相关；DMD，与肌营养不良症相关；SMN1,UBE1,DYNC1H1，与脊髓性肌萎缩相关；ALS2,ANG,ATXN2,C9orf72,DCTN1,FIG4,FUS,NEFH,OPTN,PFN1,PRPH,SETX,SIGMAR1,SMN1,SOD1,SPG11,TARDBP,UBQLN2,VAPB,VCP，与肌萎缩性侧索硬化症(ALS)相关；MAN2B1,MAN2B2,MAN2C1，与α-甘露糖苷病相关；AGA，与天冬氨酰基葡萄糖胺尿相关；CLN1,CLN2,CLN3,CLN5,CLN6,MFSD8,CLN8,CTSD，与Batten病相关；MANBA，与β-甘露糖苷病相关；CTNS，与胱氨酸病相关；LAMP2，与Danon病有关；GLA，与法布里病相关；ASAH1，与Farber病相关；FUCA1，与岩藻糖苷贮积症相关；CTSA，与半乳糖唾液酸苷贮积症相关；GBA，与戈谢病相关；GALC，与Krabbe病相关；ARSA，与异染性脑白质营养不良(metachromic leukodystrophy)相关；和IDUA,IDS,SGSH,NAGLU,HGSNAT,GNS,GALNS,ARSB,GUSB,HYAL1,SMPD1,NPC1,NPC2,GAA,NAGA,SLCA17A5和LAL(LIPA)，与粘多糖贮积症(例如Hurler综合征，Hunter综合征，Sanfilippo AD，Morquio，透明质酸酶缺乏，Maroteaux-Lamy，Sly综合征，唾液酸沉积症，I-细胞病，I-IV粘脂质累积，多种硫酸酯酶缺乏症，A-C型Niemann-Pick，庞贝病，致密成骨不全症，Sandhoff病，Schlinder病，泰-萨二氏，Wolman病)相关。

有用的转基因产品还包括miRNA。miRNA和其他小干扰核酸通过靶信使RNA(mRNA)的靶RNA转录物裂解/降解或翻译抑制来调节基因表达。miRNA天然表达，通常作为最终的19-25个非翻译RNA产物。miRNA通过与靶mRNA的3’非翻译区(UTR)进行序列特异性相互作用来展示其活性。这些内源表达的miRNA形成发夹前体，随后被加工成miRNA双链体，并且进一步被加工成“成熟”的单链miRNA分子。这种成熟的miRNA指导多蛋白复合物miRISC，miRISC鉴定靶mRNA的靶位点，例如在3’UTR区域中，根据其与成熟miRNA的互补性来进行。在一些实施方案中，抑制性RNA是miRNA。在一些实施方案中，本公开描述的rAAV包含编码靶向人SOD1(例如SOD1

重组AAV施用方法

可以根据本领域已知的任何适当方法将rAAV以组合物的形式递送至受试者。可将rAAV施用于受试者，即宿主动物，例如人，小鼠，大鼠，猫，狗，绵羊，兔，马，牛，山羊，猪，豚鼠，仓鼠，鸡，火鸡或非人类灵长类动物(例如猕猴)，所述rAAV优选悬浮在生理上相容的载体中(即，在组合物中)。在一些实施方案中，宿主动物不包括人。

可以通过例如肌内注射或通过施用到哺乳动物受试者的血流中来向哺乳动物受试者递送rAAV。可以通过注入静脉，动脉或任何其他血管导管来向血液施用。在一些实施方案中，通过隔离的肢体灌注(外科领域中众所周知的技术)将rAAV施用到血流中，所述隔离的肢体灌注是外科领域中众所周知的技术，该方法基本上使技术人员能够在施用rAAV病毒体之前将肢体与全身循环隔离。技术人员也可以使用美国专利No.6,177,403中描述的的隔离的肢体灌注技术的一种变型将病毒体施用到分离的肢体的脉管系统中，以潜在地增强向肌肉细胞或组织的转导。此外，在某些情况下，可以期望将病毒体递送至受试者的CNS。“CNS”是指脊椎动物的脑和脊髓的所有细胞和组织。因此，该术语包括但不限于神经元细胞，神经胶质细胞，星形胶质细胞，脑脊液(CSF)，间隙空间，骨，软骨等。可以使用本领域已知的神经外科技术，例如通过立体定向注射，用针，导管或相关装置通过注射入例如心室区域以及注射到纹状体(例如纹状体的尾状核或豆状核壳)，脊髓和神经肌肉接合或小脑小叶直接将重组AAV递送至CNS或大脑(参见，例如Stein et al.,J Virol 73:3424-3429,1999；Davidson et al.,PNAS 97:3428-3432,2000；Davidson et al.,Nat.Genet.3:219-223,1993；和Alisky and Davidson,Hum.Gene Ther.11:2315-2329,2000)。

在一些实施方案中，通过腰鞘内注射(LIT)将本发明的rAAV施用至CNS。在一些实施方案中，通过注射(例如丘脑注射)将本公开的rAAV直接施用于脑丘脑。在一些实施方案中，双侧进行rAAV的两次丘脑注射。在一些实施方案中，通过注射将本发明的rAAV直接施用于小脑深核(DCN)。在一些实施方案中，通过注射将本公开的rAAV双侧施用丘脑和DCN。在一些实施方案中，通过脑室内(ICV)注射直接施用本发明的rAAV。在一些实施方案中，通过注射将本公开的rAAV双侧施用丘脑和ICV。在一些实施方案中，通过注射将本公开的rAAV直接施用于DCN和ICV。

在一些实施方案中，通过静脉内注射施用如本公开中所述的rAAV。在一些实施方案中，通过脑内注射施用rAAV。在一些实施方案中，通过鞘内注射施用rAAV。在一些实施方案中，通过颅内注射递送rAAV。在一些实施方案中，通过小脑延髓池注射来递送rAAV。在一些实施方案中，通过脑侧脑室注射递送rAAV。在一些实施方案中，通过荧光镜引导的腰部鞘内导管将本公开的rAAV施用至椎管。在一些实施方案中，将本发明的rAAV施用于小脑延髓池和鞘内空间(例如，椎管)。在一些实施方案中，将本公开的rAAV施用于小脑延髓池，鞘内空间(例如，椎管)和丘脑(例如，通过丘脑内注射)。

本公开的方面涉及包含重组AAV的组合物，所述重组AAV包含至少一种修饰的遗传调节序列或元件。在一些实施方案中，该组合物还包含药学上可接受的载体。

本公开的组合物可包含单独或与一种或多种其他病毒(例如，编码具有一种或多种不同转基因的第二rAAV)组合的rAAV。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的rAAV，每个具有一个或多个不同的转基因。

在一些方面，本公开涉及包含rAAV的组合物(例如，药物组合物)，所述rAAV包含编码HexA基因的核酸。在一些方面，本公开涉及包含rAAV的组合物(例如，药物组合物)，所述rAAV包含编码HexB基因的核酸。在一些方面，本公开涉及组合物(例如，药物组合物)，其包含含有编码HexA基因的核酸的第一rAAV和包含编码HexB基因的核酸的第二rAAV。

在药物组合物中，编码HexA的rAAV:编码HexB的rAAV的比率可以变化，例如从约1:10至约10:1。在一些实施方案中，编码HexA的rAAV:编码HexB的rAAV的比率为1:1比率。在一些实施方案中，编码HexA的rAAV:编码HexB的rAAV的比率为1:2比率。在一些实施方案中，编码HexA的rAAV:编码HexB的rAAV的比率为1:5比率。在一些实施方案中，编码HexA的rAAV:编码HexB的rAAV的比率为1:10比率。在一些实施方案中，编码HexA的rAAV:编码HexB的rAAV的比率为2:1比率。在一些实施方案中，编码HexA的rAAV:编码HexB的rAAV的比率为5:1比率。在一些实施方案中，编码HexA的rAAV:编码HexB的rAAV的比率为10:1比率。

在一些实施方案中，编码HexB的rAAV:编码HexA的rAAV的比率为1:2比率。在一些实施方案中，编码HexB的rAAV:编码HexA的rAAV的比率为1:5比率。在一些实施方案中，编码HexB的rAAV:编码HexA的rAAV的比率为1:10比率。在一些实施方案中，编码HexB的rAAV:编码HexA的rAAV的比率为2:1比率。在一些实施方案中，编码HexB的rAAV:编码HexA的rAAV的比率为5:1比率。在一些实施方案中，编码HexB的rAAV:编码HexA的rAAV的比率为10:1比率。

鉴于rAAV所针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的载体。例如，一种合适的载体包括盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)一起配制。其他示例性载体包括无菌盐水，乳糖，蔗糖，磷酸钙，明胶，右旋糖苷，琼脂，果胶，花生油，芝麻油和水。载体的选择不是本公开的限制。

任选地，除了rAAV和载体之外，本发明的组合物还可包含其他常规药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇，山梨酸钾，山梨酸，二氧化硫，没食子酸丙酯，对羟基苯甲酸酯，乙基香草醛，甘油，酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。

以足够的量施用rAAV以转染期望组织的细胞并提供足够水平的基因转移和表达，而不产生过度不利影响。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于直接递送至选定器官(例如注射至CNS)，口服，吸入(包括鼻内和气管内递送)，眼内，静脉内，肌内，皮下，皮内，肿瘤内和其他胃肠外施用途径。如果需要的话，可以组合施用途径。

实现特定“治疗效果”所需的rAAV病毒体的剂量，例如，基因组拷贝的剂量单位/每千克体重(GC/kg)，将基于几个因素而变化，包括但不限于：rAAV病毒体施用途径，达到治疗效果所需的基因或RNA表达水平，所治疗的特定疾病或病症以及基因或RNA产物的稳定性。基于上述因素以及本领域公知的其他因素，本领域技术人员可以容易地确定用于治疗患有特定疾病或病症的患者的rAAV病毒体的剂量范围。

有效量的rAAV是足以靶向感染动物，靶向期望组织的量。在一些实施方案中，有效量的rAAV是足以产生稳定的体细胞转基因动物模型的量。有效量将主要取决于诸如受试者的物种，年龄，体重，健康以及要靶向的组织等因素，并且因此可以在动物和组织之间变化。例如，rAAV的有效量通常在约1ml至约100ml的溶液中，该溶液包含约10

在一些实施方案中，递送至丘脑的剂量为约1x10

在一些实施方案中，递送至丘脑的体积为约0.5mL至约1.5mL，约.75mL至约1.25mL或约.8mL至约1.2mL。

在一些实施方案中，递送至小脑延髓池和/或鞘内空间(例如，椎管)的剂量为1x10

在一些实施方案中，递送至鞘内空间(例如，椎管)的体积为约1mL至约10mL，或约2mL至约8mL。在一些实施方案中，递送至鞘内空间(例如，椎管)的体积为约2mL，3mL，4mL，5mL，6mL，7mL或8mL。

在一些实施方案中，通过血管内微导管进行向受试者(例如，受试者的CSF，鞘内空间和/或小脑延髓池)的递送。在一些实施方案中，经由血管内微导管递送1x10

在一些实施方案中，本公开涉及将包含编码溶酶体贮积病蛋白的转基因的rAAV组合物施用于有此需要的受试者(例如患有或怀疑患有溶酶体贮积病例如泰-萨二氏或Sandhoff病的受试者)的方法。在一些实施方案中，在施用如本文所公开的rAAV或包含该rAAV的组合物之前，受试者在受试者的CSF中具有正常β-己糖胺酶A活性的≤1.0％，≤0.5％或≤0.1％，例如，使用人工底物如MUG或MUGS测量。在一些实施方案中，受试者患有婴儿性泰-萨二氏病。在一些实施方案中，所述受试者为5-36个月龄。在一些实施方案中，所述受试者为12-36个月龄。在一些实施方案中，所述受试者为18-30个月龄。

在一些方面，本公开涉及以下认识：向受试者施用AAV的一种潜在的副作用是受试者对AAV的免疫应答，包括炎症。在一些实施方案中，在施用一种或多种如本文所述的rAAV之前，对受试者进行免疫抑制。

如本文所用，“免疫抑制的”或“免疫抑制”是指受试者中免疫应答的激活或功效的降低。可以使用一种或多种(例如多种，例如2、3、4、5或更多种)药剂在受试者中诱导免疫抑制，所述药剂包括但不限于利妥昔单抗，甲泼尼龙，泼尼松龙，西罗莫司，免疫球蛋白注射液，泼尼松，Solu-Medrol，兰索拉唑，甲氧苄啶/磺胺甲恶唑，甲氨蝶呤及其任意组合。在一些实施方案中，免疫抑制方案包括施用西罗莫司，泼尼松龙，兰索拉唑，甲氧苄啶/磺胺甲基异恶唑或其任何组合。

在一些实施方案中，公开内容所描述的方法进一步包括在向受试者施用rAAV(例如如本公开所描述的rAAV或药物组合物)之前在受试者中诱导免疫抑制的步骤(例如，施用一种或多种免疫抑制剂)。在一些实施方案中，在将rAAV施用于受试者之前，在约30天至约0天之间(例如，直到施用rAAV之前的30天之间的任何时间)，对受试者进行免疫抑制(例如，在受试者中诱导免疫抑制)。在一些实施方案中，用免疫抑制(例如，利妥昔单抗，西罗莫司和/或泼尼松)对受试者进行预处理至少7天。

在一些实施方案中，本公开中描述的方法进一步包括向施用了本公开的rAAV或包含rAAV的药物组合物的受试者共施用或事先施用药剂。在一些实施方案中，所述药剂选自Miglustat，Keppra，Prevacid，氯硝西泮及其任何组合。

在一些实施方案中，在施用rAAV或药物组合物期间和/或之后维持受试者的免疫抑制。在一些实施方案中，在施用rAAV或药物组合物后1天至1年之间对受试者进行免疫抑制(例如，施用一种或多种免疫抑制剂)。

在一些实施方案中，配制rAAV组合物以减少组合物中AAV颗粒的聚集，特别是在存在高rAAV浓度(例如约10

药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员众所周知的，开发用于在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适的剂量和治疗方案也是本领域技术人员众所周知的。

通常，这些制剂可以包含至少约0.1％或更多的活性化合物，尽管活性成分的百分比当然可以变化并且可以方便地在总制剂的重量或体积的约1或2％至约70％或80％或更多之间。自然地，可以以如下的方式在每种治疗有用的组合物中制备活性化合物的量，使得可以在任何给定的单位剂量的化合物中获得合适的剂量。制备此类药物制剂的本领域技术人员将考虑诸如溶解度，生物利用度，生物学半衰期，施用途径，产品货架期以及其他药理学考虑因素等引物，并因此多种剂量和治疗方案可以是理想的。

在某些情况下，期望以皮下，胰腺内，鼻内，胃肠外，静脉内，肌肉内，鞘内或口服，腹膜内或通过吸入在本文公开的适当配制的药物组合物中递送基于rAAV的治疗性构建体。在一些实施方案中，如美国专利No.5,543,158；5,641,515和5,399,363(各自通过引用整体并入本文)描述的施用模式可用于递送rAAV。在一些实施方案中，优选的施用模式是通过门静脉注射。

适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉剂。分散体也可以在甘油，液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在常规的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。在许多情况下，该形式是无菌的且具有一定的流动性，以致易于注射。它必须在生产和储存条件下保持稳定，并且必须进行防腐以防微生物(例如细菌和真菌)的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和/或植物油。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，酚，山梨酸，硫柳汞等来预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以使可注射组合物的吸收延长。

为了施用可注射的水溶液，例如，如果必要的话，可以适当地缓冲溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内，肌内，皮下和腹膜内施用。在这方面，本领域技术人员将知道可以使用的无菌水性介质。例如，可以将一剂溶解在1ml等渗NaCl溶液中，或者添加到1000ml皮下灌注液中，或者在提出的输注部位注射(例如，参见“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，第15版，第1035-1038页和1570-1580)。剂量的某些变化将必然取决于宿主的状况而发生。在任何情况下，负责给药的人员将确定适合个体宿主的适当剂量。

通过将所需量的活性rAAV按照需要与适当的溶剂与本文列举的多种其他成分混合，然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物包含基本分散介质和来自以上列举的那些成分的所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。

本文公开的rAAV组合物也可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并与无机酸形成，例如盐酸或磷酸，或有机酸诸如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃体等。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠，钾，铵，钙或铁，以及有机碱，例如异丙胺，三甲胺，组氨酸，普鲁卡因等。配制后，将以与剂型相容的方式和治疗有效量施用溶液。可以容易地以各种剂型，例如可注射溶液，药物释放胶囊等来施用制剂。

如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂，分散介质，媒介物，涂层材料，稀释剂，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂，缓冲剂，载体溶液，悬浮液，胶体等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。补充活性成分也可以掺入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于宿主时不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。

递送媒介物，例如脂质体，纳米胶囊，微粒，微球，脂质颗粒，囊泡等可以用于将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，rAAV载体递送的转基因可以配制用于递送，在脂质颗粒，脂质体，囊泡，纳米球或纳米颗粒等中包囊。

此类制剂对于引入本文公开的核酸或rAAV构建体的药学上可接受的制剂可以是优选的。脂质体的形成和使用是本领域技术人员通常已知的。最近，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利No.5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载体的各种方法(美国专利Nos.5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。

脂质体已成功用于通常对其他程序转染具有抗性的多种细胞类型。另外，脂质体没有基于病毒的递送系统典型的DNA长度限制。脂质体已有效地用于将基因，药物，放射治疗剂，病毒，转录因子和变构效应物引入各种培养的细胞系和动物中。此外，已经完成了一些成功的临床试验，检查脂质体介导的药物递送的有效性。

脂质体由分散在水性介质中的磷脂形成，并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。MLV的直径通常为25nm至4μm。MLV的超声处理导致直径在200至500.ANG.范围内的小单层囊泡(SUV)的形成，其核心中含有水溶液。

或者，可以使用rAAV的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以稳定且可再现的方式截留物质。为避免细胞内聚合物超载引起的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物设计此类超细颗粒(尺寸约为0.1μm)。涵盖使用满足这些要求的可生物降解的氰基丙烯酸聚烷基酯纳米颗粒。

除上述递送方法外，还涵盖以下技术作为将rAAV组合物递送至宿主的替代方法。超声促渗(例如超声)已得到使用并在美国专利No.5,656,016中描述为增加对循环系统和通过循环系统的药物渗透的速率和功效的装置。预期的其他药物递送替代物是骨内注射(美国专利No.5,779,708)，微芯片装置(美国专利No.5,797,898)，眼科制剂(Bourlais etal.,1998)，经皮基质(美国专利No.5,770,219和5,783,208)和反馈控制的递送(美国专利No.5,697,899)。

在一些实施方案中，本公开涉及向已施用如本文所述的rAAV或药物组合物的受试者施用一种或多种另外的治疗剂。例如，已观察到在酶替代疗法(ERT)中施用野生型分离蛋白以减轻酶活性降低，有效治疗溶酶体贮积病，包括戈谢病，亨特氏综合征，法布里氏病，庞贝病，Maroteaux-Lamy综合征，Morquio A综合征和LAL缺乏症。因此，在一些实施方案中，除如本公开所描述的rAAV或药物组合物外，还向受试者施用一种或多种酶替代疗法(ERT)。ERT通常是已知的，并由Li(2018)Pediatr Ann.47(5):e191-e197进行了描述。

在一些实施方案中，本文所述的组合物可以进一步包含分离的蛋白质。在一些实施方案中，组合物包含分离的野生型HexA蛋白。在一些实施方案中，组合物包含分离的野生型HexB蛋白。在一些实施方案中，组合物包含分离的野生型HexA和HexB蛋白。在一些实施方案中，组合物包含rAAV和分离的野生型HexA蛋白。在一些实施方案中，组合物包含rAAV和分离的野生型HexB蛋白。在一些实施方案中，组合物包含rAAV和分离的野生型HexA和HexB蛋白。

试剂盒和相关组成

在一些实施方案中，本文所述的试剂可以组装成药物或诊断或研究试剂盒，以促进它们在治疗，诊断或研究应用中的使用。试剂盒可包括一个或多个容纳本公开的组分和使用说明的容器。具体而言，此类试剂盒可包括一种或多种本文所述的试剂，以及描述这些试剂的意图应用和正确使用的说明。在某些实施方案中，试剂盒中的试剂可以是适于特定应用和试剂施用方法的药物制剂和剂量。用于研究目的的试剂盒可以包含适当浓度或数量的组分，用于进行各种实验。

在一些实施方案中，本公开涉及用于产生rAAV的试剂盒，该试剂盒包含容纳分离的核酸的容器，所述分离的核酸具有SEQ ID NO:1-6或16-19中任一项的序列。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于产生rAAV的说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括至少一个容纳重组AAV载体的容器，其中重组AAV载体包含转基因。

在一些实施方案中，本公开涉及试剂盒，其包括容纳如上所述的重组AAV的容器。在一些实施方案中，试剂盒还包括容纳药学上可接受的载体的容器。例如，试剂盒可包括一个容纳rAAV的容器和容纳适于将rAAV注射入受试者的缓冲液的第二容器。在一些实施例中，容器是注射器。

试剂盒可以设计成促进研究人员使用本文所述的方法，并且可以采取多种形式。如果适用，试剂盒的每种组合物可以以液体形式(例如溶液)或以固体形式(例如干粉)提供。在某些情况下，某些组合物可以是可组成的或在其它方面可加工的(例如，制成活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其他物质(例如水或细胞培养基)，其可以提供给或不可以提供给试剂盒。如本文中所使用的，“说明”可以定义说明和/或宣传的组成并且通常涉及在本公开的包装上或与本公开的包装相关的书面说明。说明还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明，以使用户清楚地认识到该说明将与试剂盒相关联，例如，视听(例如，录像带，DVD等)，互联网和/或基于网络的通信等。书面说明可以采用规定药品或生物制品的生产，使用或销售的政府机构规定的形式，该说明也可以反映该机构批准生产，使用或销售用于动物施用。

试剂盒可在一个或多个容器中包含本文所述的任何一种或多种组分。例如，在一个实施方案中，试剂盒可包括用于混合试剂盒的一种或多种组分和/或分离和混合样品并应用于受试者的说明。试剂盒可包括本文所述的容纳药剂的容器。试剂可以是液体，凝胶或固体(粉末)的形式。试剂可以无菌制备，包装在注射器中并冷藏运输。或者，可以将其容纳在小瓶或其他容器中以进行存储。第二容器可具有无菌制备的其他试剂。或者，试剂盒可以包括在注射器，小瓶，管或其他容器中预混合并运输的活性剂。试剂盒可以具有向动物施用试剂所需的一种或多种或所有组分，例如注射器，局部施用装置或iv针管和袋，特别是在用于生产特定体细胞动物模型的试剂盒的情况下。

在某些情况下，方法涉及用从组织中分离的总细胞DNA转染细胞，并补充辅助病毒功能(例如腺病毒)以在转染的细胞中触发和/或增强AAV rep和cap基因转录，所述组织潜在以非常低的丰度携带原病毒AAV基因组。在某些情况下，来自转染细胞的RNA为cDNA的RT-PCR扩增和新型AAV的检测提供了模板。在用从潜在带有原病毒AAV基因组的组织中分离的总细胞DNA转染细胞的情况下，通常需要给细胞补充促进AAV基因转录的因子。例如，细胞也可以用诸如腺病毒或疱疹病毒的辅助病毒感染。在一个特定的实施方案中，辅助功能是由腺病毒提供的。腺病毒可以是野生型腺病毒，并且可以是人或非人来源的，优选地是非人灵长类(NHP)来源的。类似地，已知感染非人类动物(例如黑猩猩，小鼠)的腺病毒也可以用于本公开的方法中(参见例如美国专利No.6,083,716)。除了野生型腺病毒以外，还可以利用携带必要辅助功能的重组病毒或非病毒载体(例如质粒，附加体等)。此类重组病毒是本领域已知的，并且可以根据公开的技术来制备。参见，例如，美国专利No.5,871,982和美国专利No.6,251,677，其描述了杂合Ad/AAV病毒。多种腺病毒株可从美国典型培养物保藏中心,Manassas,Va.获得，或应要求从多种商业和机构来源获得。此外，许多此类毒株的序列可从多种数据库获得，包括例如PubMed和GenBank。

细胞也可以用向AAV提供辅助功能的载体(例如辅助载体)转染。提供辅助功能的载体可以提供腺病毒功能，包括例如E1a，E1b，E2a，E4ORF6。提供这些功能的腺病毒基因的序列可以从任何已知的腺病毒血清型获得，例如血清型2、3、4、7、12和40，并且还包括本领域已知的任何目前鉴定的人类型。因此，在一些实施方案中，方法涉及用表达AAV复制，AAV基因转录和/或AAV包装所必需的一种或多种基因的载体转染细胞。

在一些情况下，可以使用本领域众所周知的方法，使用新的分离的壳体基因来构建和包装重组AAV载体，以确定与由该基因编码的新的壳体蛋白相关的功能特征。例如，新的分离的壳体基因可用于构建和包装包含报告物基因(例如，B-半乳糖苷酶，GFP，萤光素酶等)的重组AAV(rAAV)载体。然后可以将rAAV载体递送至动物(例如小鼠)，并且可以通过检查报告物基因在动物的各种组织(例如心脏，肝脏，肾脏)中的表达来确定新的分离的壳体基因的组织靶向特性。本文公开了表征新的分离的壳体基因的其他方法，并且其它方法是本领域众所周知的。

试剂盒可以具有多种形式，例如泡罩袋，收缩包装的袋，真空密封的袋，可密封的热成型托盘或类似的袋或托盘形式，具有松散填充在该袋中的辅助物，一个或多个管，容器，盒或袋。添加辅助物后，可以对试剂盒进行消毒，从而允许以其它方式拆开容器中的个别辅助物。可以使用任何适当的灭菌技术对试剂盒进行灭菌，例如辐射灭菌，热灭菌或本领域已知的其他灭菌方法。试剂盒还可以包括其他组件，取决于特定的应用，例如，容器，细胞培养基，盐，缓冲液，试剂，注射器，针，用于涂抹或去除消毒剂的织物如纱布，一次性手套，在施用前药剂的支持物等。

试剂盒中包含的说明可涉及检测细胞中潜在AAV的方法。另外，本公开的试剂盒可包括说明，阴性和/或阳性对照，用于样品的容器，稀释剂和缓冲液，样品制备管以及用于序列比较的参考AAV序列的印刷或电子表格。

治疗溶酶体贮积病的方法

本公开的方面提供了用于治疗溶酶体贮积病的方法。溶酶体贮积病(LSD)是与驻留酶功能失常有关的大于50种疾病的类别，所述功能失常导致溶酶体中未降解底物的积累。此积累随时间可以导致溶酶体功能失常，从而导致一系列事件，通常导致细胞死亡。涉及中枢神经系统(CNS)的LSD需要经过意图的疗法以穿越或绕过血脑屏障，从而将功能性酶传递至靶细胞以达到疾病消退。一种治疗递送方法是AAV介导的靶基因递送。

在本公开的一些实施方案中，溶酶体贮积病是GM1神经节苷脂贮积病，这是普遍致命的常染色体隐性遗传病。GM1神经节苷脂贮积病(OMIM#230500)是由GLB1基因突变引起的，该基因编码酶β-半乳糖苷酶。根据残留的β-gal活性和疾病发作来描述I-III型GM1神经节苷脂贮积病，I型出现在婴儿期，II型出现在婴儿后期或少年期，III型出现在成年时期。在一些实施方案中，本公开提供了用于施用于患有或怀疑患有II型GM1的受试者的方法和组合物。II型GM1和婴儿晚期发作的患者通常在1至3岁之间形成症状，预期寿命为5至10年。这些受试者在第一年内满足发育标志，但随后开始失去以前获得的技能，例如言语和移动性。II型GM1和青少年发作的患者在3至10岁之间形成症状，并且类似地显示先前获得的技能(例如言语和移动性)的衰退。

在一些实施方案中，GLB1是人的(GeneID:2720)，并且包含NM_000404.3,NM_001079811.2,NM_001135602.2,或NM_00137040.1中列出的序列。在一些实施方案中，GLB1是人的并且包含如NP_000395.2,NP_001073279.1,NP_00129074.1或NP_001303969.1中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，GLB1是小鼠GLB1(Gene ID:12091)，并且包含NM_009752.2中列出的序列。在一些实施方案中，GLB1是人的并且包含NP_033882.1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，GLB1包含与溶酶体中β-gal活性降低相关的GLB1中的突变，例如P10L,R59C,R59H,R121S,G123R,M132T,G134V,P136S,R148S,D151V,D151Y和/或任何其它突变(例如，如Uniprot-KB，P16278所列出提供，其内容通过引用完整并入本文)。

在一些方面，本公开提供了用于治疗GM1神经节苷脂贮积病的方法。GM1神经节苷脂贮积病可以是I型，II型或III型GM1神经节苷脂贮积病。由于GM1神经节苷脂贮积病是由β-半乳糖苷酶(β-gal)蛋白活性不足引起的，因此治疗GM1神经节苷脂贮积病的方法提供增加的β-gal活性。增加β-gal活性的方法的非限制性示例包括在细胞或受试者中表达野生型GLB1，降低细胞或受试者中突变体GLB1基因的表达，或向细胞或受试者提供野生型GLB1蛋白(例如，酶替代疗法)。在一些实施方案中，可以通过施用分离的核酸或包含编码GLB1(例如，野生型GLB1)的转基因的rAAV来治疗GM1。在一些实施方案中，转基因包含如SEQ ID NO:23所示的野生型GLB1序列。

通过进行本公开的方法，可以增加具有GM1神经节苷脂贮积病的细胞或受试者中的GLB1活性。患有GM1神经节苷脂贮积病的细胞或受试者中的GLB1活性可以提高50％-500％。患有GM1神经节苷脂贮积病的细胞或受试者中的GLB1活性可以增加至少50％。患有GM1神经节苷脂贮积病的细胞或受试者中的GLB1活性可以增加至少500％。患有GM1神经节苷脂贮积病的细胞或受试者中的GLB1活性可以增加100％-400％。患有GM1神经节苷脂贮积病的细胞或受试者中的GLB1活性可以增加200％-500％。患有GM1神经节苷脂贮积病的细胞或受试者中的GLB1活性可以增加50％,60％,70％,80％,90％,100％,125％,150％,175％,200％,225％,250％,275％,300％,325％,350％,375％,400％,425％,450％,475％或500％。

在受试者中治疗GM1神经节苷脂贮积病的方法可以包括施用本发明权利要求的分离的核酸，rAAV或组合物，其包含编码人GLB1的转基因。受试者可以是人类，小鼠，大鼠，猪，狗，猫或非人类灵长类动物。施用是指使细胞或受试者与本发明的分离的核酸，rAAV或组合物接触。施用的非限制性实例包括静脉内注射，动脉内注射，颅内注射，鞘内注射，脑内注射，输注或吸入。

在一些实施方案中，溶酶体贮积病是泰-萨二氏病(也称为GM2神经节苷脂贮积病)，由基因HEXA，HEXB和GM2A的至少一种中的突变引起的常染色体隐性病。泰-萨二氏病(TSD)(OMIM#272800)是一种普遍致命的病症，其存在于婴儿，青少年或成人中，他们在生命的第二或第三年出现发育迟缓，痴呆，失明和死亡等症状。GM2神经节苷脂的分解需要全部三种酶己糖胺酶A(HexA)，己糖胺酶B(HexB)和GM2神经节苷脂激活剂(GM2A)的野生型水平，并且这三种酶中任何一种酶的活性降低都与增加的GM2神经节苷脂在溶酶体中的贮积有关。患有TSD的患者由于富含脂质的神经节细胞在视网膜中央凹周围形成灰白色区域，从而留下了中央的“樱桃红斑”，这是该病症的标志。目前不存在针对TSD患者的治疗。

在本公开的一些实施方案中，溶酶体贮积病是Sandhoff病(也称为GM2神经节苷脂贮积病)，其是由HEXB基因中的突变引起的常染色体隐性疾病。Sandhoff病(SD)(OMIM#268800)是一种普遍致命的疾病。患有SD的患者通常在生命的前六个月出现虚弱，随后出现夸张的惊吓反应，早期失明，进行性运动和精神衰退，娃娃形的脸，樱桃红斑和大头畸形。死亡通常在三岁时发生。

在一些实施方案中，HexA是人的(GeneID:3073)，并包含NM_000520.5或NM_001318825.1中列出的序列。在一些实施方案中，人HexA包含NP_000511.2或NP_001305754.1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，HexA是小鼠(GeneID:15211)，并包含NM_010421.5中列出的序列。在一些实施方案中，小鼠HexA包含NP_034551.2中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，HexB是人的(GeneID:3074)，并包含NM_000521.3或NM_001292004.1中列出的序列。在一些实施方案中，人HexB包含NP_000512.1或NP_001278933.1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，HexB是小鼠(GeneID:15212)，并且包含如NM_010422.2所示的序列。在一些实施方案中，小鼠HexB包含NP_034552.1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，GM2A是人的(GeneID:2760)，并且包含如NM_000405.4或NM_001167607.1所示的序列。在一些实施方案中，人G2MA包含NP_000396.2或NP_001161079.1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，GM2A是小鼠(GeneID:14667)，并包含NM_102999.3中列出的序列。在一些实施方案中，小鼠GM2A包含NP_034429.1中列出的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供了分离的核酸和重组AAV，其包含编码人GLB1，HexA或HexB的转基因。在一些实施方案中，本公开提供了分离的核酸和重组AAV，其包含编码小鼠GLB1，HexA或HexB的转基因。在一些实施方案中，GLB1，HexA和/或HexB可操作连接至启动子，任选地是驱动转基因在特定组织中表达的组织特异性启动子。在一些实施方案中，CNS中的特定组织。在一些实施方案中，本公开提供了向有此需要的受试者施用包含上述分离的核酸或重组AAV的组合物的方法。在一些实施方案中，施用所述组合物的受试者患有或怀疑患有溶酶体贮积病，包括但不限于GM1神经节苷脂贮积病，泰-萨二氏病或Sandhoff病。

在一些实施方案中，向受试者施用包含编码人HexA和/或人HexB的转基因的本发明的rAAV或药物组合物，其中在施用rAAV或药物组合物后三个月，所述受试者在CSF中具有β-己糖胺酶A的酶活性的增加，其是正常酶活性的至少0.5％，至少1.0％或至少1.4％。在一些实施方案中，使用诸如MUG或MUGS的人工底物测量酶活性。在一些实施方案中，向受试者施用包含编码人HexA和/或人HexB的转基因的本发明的rAAV或药物组合物，其中相对于施用前的受试者基线酶活性，所述受试者在3个月时在CSF中的β-己糖胺酶A酶活性是至少2倍或至少3倍。在一些实施方案中，所述受试者患有泰-萨二氏病(例如，婴儿泰-萨二氏病)。

在一些实施方案中，到施用本公开的rAAV或药物组合物之后三个月或者在施用本公开的rAAV或药物组合物之后三个月时，GM2神经节苷脂从受试者的脑脊液(CSF)中的基线减少至少10％，至少15％，至少20％，至少21％，至少22％，至少23％，至少24％或至少25％。

因此，在一些实施方案中，本公开提供了可用于治疗溶酶体贮积病的分离的核酸，rAAV，组合物和方法。在一些实施方案中，分离的核酸，rAAV，组合物和方法用于治疗GM1神经节苷脂贮积病。在一些实施方案中，分离的核酸，rAAV，组合物和方法可用于治疗泰-萨二氏病。在一些实施方案中，分离的核酸，rAAV，组合物和方法可用于治疗Sandhoff病。

在一些方面，本公开提供了用于治疗GM2神经节苷脂贮积病的方法。GM2神经节苷脂贮积病可以是泰-萨二氏病或Sandhoff病。由于GM2神经节苷脂贮积病是由不足的HEXA和/或HEXB酶活性不足引起的，因此治疗GM2神经节苷脂贮积病的方法提供增加的HEXA和/或HEXB活性。增加活性的方法的非限制性实例包括在细胞或受试者中表达野生型HEXA和/或HEXB，降低细胞或受试者中突变体HEXA和/或HEXB基因的表达，或向细胞或受试者提供野生型HEXA和/或HEXB蛋白(例如酶替代疗法)。在一些实施方案中，可以通过施用分离的核酸或rAAV来治疗GM2，所述分离的核酸或rAAV包含至少一种编码HEXA或HEXB(例如，野生型HEXA和/或HEXB)的转基因。在一些实施方案中，转基因包含SEQ ID NO:20所示的野生型HEXA序列。在一些实施方案中，转基因包含SEQ ID NO:21所示的野生型HEXB序列。

通过进行本公开的方法，可以增加具有GM2神经节苷脂贮积病的细胞或受试者中的HEXA和/或HEXB活性。具有GM2神经节苷脂贮积病的细胞或受试者中的HEXA和/或HEXB活性可以增加50％至500％。具有GM2神经节苷脂贮积病的细胞或受试者中的HEXA和/或HEXB活性可以增加至少50％。具有GM2神经节苷脂贮积病的细胞或受试者中的HEXA和/或HEXB活性可以增加至少500％。具有GM2神经节苷脂贮积病的细胞或受试者中的HEXA和/或HEXB活性可以增加100％至400％。具有GM2神经节苷脂贮积病的细胞或受试者中的HEXA和/或HEXB活性可以增加200％至500％。具有GM2神经节苷脂贮积病的细胞或受试者的HEXA和/或HEXB活性可以增加50％,60％,70％,80％,90％,100％,125％,150％,175％,200％,225％,250％,275％,300％,325％,350％,375％,400％,425％,450％,475％或500％。

在受试者中治疗GM2神经节苷脂贮积病的方法可以包括施用本发明权利要求的分离的核酸，rAAV或组合物，其包含编码人HEXA和/或HEXB的转基因。受试者可以是人类，小鼠，大鼠，猪，狗，猫或非人类灵长类动物。施用是指使细胞或受试者与本发明的分离的核酸，rAAV或组合物接触。施用的非限制性实例包括静脉内注射，动脉内注射，颅内注射，鞘内注射，脑内注射，输注或吸入。

实施例

实施例1：材料和方法

构建了AAV载体(SEQ ID NO:3)，并且所述载体携带由启动子驱动的表达盒，接着是嵌合鸡β-肌动蛋白/兔β珠蛋白内含子(CBA)，小鼠溶酶体酸β-半乳糖苷酶cDNA(mβgal)，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)以及源自牛生长激素(BGH)和SV40的串联的两个polyA信号，所述启动子由与鸡β-肌动蛋白启动子融合的巨细胞病毒立即早期增强子(CMV)组成。该载体称为AAV-CBA-mβgal-WPRE。使用以下引物通过PCR诱变生成AAV-CBA-mβgalE269Q-WPRE：For 1:AAA CGT CTC ACT AGT CCG CGG AAT TC(SEQ ID NO:7),Rev1:AAACGT CTC ACT GAG AAT TGA TCA AA(SEQ ID NO:8),For2:AAA GGT CTC CGG CCG CTA GCGTCA G(SEQ ID NO:9),Rev2:AAA GGT CTC ATC AGT TCT ATA CTG GC(SEQ ID NO:10)。用SpeI和Not I限制酶消化所得的PCR产物，并克隆替换野生型βgalcDNA。通过从AAV-CBA-mβgal-WPRE载体(SEQ ID NO:3)中去除不同的元件来产生所有其他AAV载体。所有AAVrh8载体原液均通过标准方法产生。

GM1神经节苷脂贮积病小鼠(βgal

通过腹膜内注射0.9％盐水中氯胺酮(125mg/kg)和赛拉嗪(12.5mg/kg)麻醉六至八周龄βgal

在5分钟内从4rpm加速到40rpm的Rotarod装置上进行Rotarod测试，记录跌落前等待时间(latency to fall)。在事件开始时进行了一项从2rpm加速到20rpm的1分钟练习试验，然后进行了3次试验，中间休息15-20分钟进行了测试。记录了测试事件中每只小鼠的跌落前等待时间，并报告了3次试验中最长的rotarod上时间。

为了在βgal

在低温恒温器中切开20μm的脑(矢状和冠状)和脊髓(横切)切片，并保存于-80℃。

如前所述，在修改的情况下用X-gal对脑切片进行染色，以评估βgal的分布。简而言之，将载玻片固定在PBS中的0.5％戊二醛中，在冰冷的柠檬酸磷酸盐缓冲液(CPB)(50mMC

如前所述，在修改的情况下对脑和脊髓切片进行非律平染色以评估溶酶体贮积。简而言之，将载玻片固定在磷酸盐缓冲液(PBS)中的4％多聚甲醛中，用PBS洗涤，与水中的1.5％甘氨酸一起温育，用PBS洗涤，与100μg/ml的非律平和1μg/ml的ToPro3碘化物(LifeTechnologies，Grand Island，NY)温育1-2小时，用PBS洗涤，并用荧光封固介质PermaFluor封固。

用Mayer的苏木精和曙红对脑切片进行染色，以评估组织的形态变化。简而言之，将载玻片在室温下干燥，固定在磷酸盐缓冲液(PBS)中的4％多聚甲醛中，用水洗涤，与Mayer苏木精温育，在自来水中洗涤，用曙红复染，用去离子水冲洗，经一系列50％-100％的乙醇脱水，用CitriSolv清除，并用Permount封固。

在带有医疗载玻片支架的Nikon Super CoolScan 5000 ED上使用白光捕获全脑切片图像。在配备有Leica DFC425 C和DFC365 FX数码相机的Leica DM550 B显微镜上捕获显微镜图像。非律平在405nm成像，并且ToPro3碘化物在636nm成像。使用明场成像H&E。

所有的组织学分析进行为对N≥2-3只动物进行的非盲定性分析，在图中显示了代表性照片。

将生检穿孔在裂解缓冲液(0.2M CH

使用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒从注射部位生检穿孔中分离基因组DNA，并使用Nanodrop分光光度计测定浓度。使用以下引物和对载体基因组中BGH polyA特异的Taqman探针通过qPCR确定100ng基因组DNA中AAV载体基因组拷贝数：(TaqMan探针，6FAM-AGC ATT TTT TTC ACT GCA TTC TAG TTG TGG TTT GTC–TAMRA SEQ ID NO:11)。认为具有每μg DNA的≥100vg基因组拷贝数的样品对载体基因组呈阳性。

使用Trizol从生检穿孔中分离出总RNA，并使用RNeasy Plus Mini Kit进一步纯化，并在Agilent生物分析仪上对其质量进行分析。生物分析仪RNA完整性数(RIN)值为8.7-9.5，表明高质量的RNA。使用Affymetrix小鼠基因2.0ST阵列进行样品制备和微阵列杂交。每组分析三个独立样品。处理得到的数据，将P值<0.05和相对于PBS对照的1.5倍变化视为差异表达基因。

通过液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)对CNS中的GM1含量进行定量。简而言之，将25ul 0.01-0.04mg/μl组织在pH＝4.3的0.1M NaCl，0.2M CH

产生了编码人GLB1基因的重组AAV载体(rAAV9hGLB1)载体(SEQ ID NO:23)。这是复制缺陷型腺相关病毒基因转移载体。单链DNA基因组由在表达盒侧翼的来自AAV2的反向末端重复组成，所述表达盒由以下组成：人β-半乳糖苷酶(βgal)cDNA，由与鸡β-肌动蛋白启动子融合的巨细胞病毒立即早期增强子驱动，以及包含剪接供体和剪接受体位点的兔β-珠蛋白内含子。构建体还包含来自猿猴病毒40的聚腺苷酸化信号。将基因组包装在AAV血清型9的壳体中，所述AAV血清型9是人衍生的AAV(Gao 2004)(图1B)。将其配制在缓冲水悬浮液中以静脉内递送。

在可操作的CAG启动子的控制下，向C57BL/6小鼠注射PBS(对照)或AAV9-hGLB1(图1B)。经处理的小鼠接受2.25x10

实施例2

通过双侧注射在丘脑和小脑深核中以总剂量4e10vg，2.6e10vg和2.6e9vg分别将AAVrh8-CBA-mβgal-WPRE载体(图1和20)输注入6-8周龄GM1神经节苷脂贮积病小鼠(βgal

使用rotarod测试随时间评估经AAVrh8处理的小鼠的运动功能(图3)。在处理时间点后的6个月时，所有AAVrh8处理的βgal

实施例3

与未处理的βgal

注射后3个月通过动物CNS中的非律平染色对溶酶体贮积的组织学分析揭示脑和小脑中的几乎完全纠正，其与酶的存在相对应，如在同一时间点时Xgal染色中看到(图2)。令人惊讶的是，仅在注射部位或沿着注射轨道发现非律平阳性细胞(图5C，5E)。

注射AAVrh8的βgal

实施例4

早期损失后或注射后3个月，用苏木精和曙红(H&E)对动物进行组织学评估。发现这些动物在注射部位处具有与剂量相关的形态变化。注射后2周时，βgal

注射部位处非律平阳性细胞的自相矛盾的存在(图5C，5E)可能是βgal

实施例5

验证AAVrh8载体系列以评估酶活性，蛋白质水平和AAVrh8壳体对非律平检出性响应的贡献

设计了一系列AAVrh8载体，以研究注射部位处出乎意料的响应的性质(表1)。设计的另外的载体在图19中显示。这一系列AAVrh8包括序贯去除影响原始载体AAVrh8-CBA-mβgal-WPRE中转基因表达水平的元件，此后将其称为“CBA-WPRE”。在载体2“CBA”中，去除土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件(WPRE)。载体3“CBA-EI-WPRE”具有与载体1完全相同的骨架，但编码假定活性位点中带有E269Q突变的βgal蛋白。设计此载体以评估观察到的响应是由酶促活性还是蛋白质产生引起的。载体4“CB6”包含mβgal基因，但不携带WPRE或其他载体中存在的嵌合内含子。在两种剂量上对载体进行测试：“CB6低”(与所有其他载体剂量相同)和“CB6高”(2.0e10vg)。载体5“转基因空”或“T.空”包含载体1的所有组件，但缺少mβgalcDNA。

除了CB6载体以外，将新构建的AAVrh8载体双侧注射入正常βgal

表1：设计为评估贮积生物标志物非律平持久性的载体中的变化列表

CBA-WPRE载体产生高出未处理的βgal

通过Xgal染色(图12A，12D，12G，12J，12M，12P，12S)分析注射AAVrh8的βgal

在丘脑中进行了微阵列分析以进一步表征组织对由基因转移诱导的生理变化的响应。从CBA-mβgal-WPRE，CB6-低，T.空和PBS注射的分组中分离出总丘脑RNA。在热图中表示所有分析样品的转录物组变化(倍数变化>1.8倍，p<0.05)。CB6-低和T.空样品与PBS聚集在一起，并且与CBA-WPRE样品不同。与具有几个重叠基因的CB6和T.空相比，在CBA-WPRE样品中表达水平变化>2倍的基因数量(p<0.05)大得相当多(图13B)。CBA-WPRE样品中许多上调的基因是活化的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞特征性的(表2)。这些基因均未在CB6或T.空样品中显示出显著变化。

表2：在CBA-WPRE载体的微阵列分析中上调的选择基因。倍数变化是相对于PBS的CBA-WPRE载体。

实施例6

从上面的βgal

如组织学染色剂X-gal(图15)证明的脑中的βgal分布模式与通过4-Mu测定法测定的大脑或小脑+脑干中的活性水平相关(图14)。CBA-WPRE载体导致丘脑和DCN呈深蓝色染色以及在整个脑中广泛分布可检测到的酶活性(图15A)。相反，在CB6-低分组中(图15B)，丘脑和DCN染色强烈，但整个大脑，小脑或脑干的可检测水平较低。在CB6-高的动物中，脑内分布的βgal模式似乎比CB6-低的动物中宽(图15C)。如所预期的，没有T.空(图15D)和未处理的βgal

使用非律平染色(图16)对脑和脊髓中溶酶体贮积的组织学分析与上述βgal活性(图14)和分布模式(图15)相关。在注射CBA-WPRE的动物中，整个脑几乎完全清除贮积(图16)，除了在注射部位和腹侧海马和整个丘脑中具有非律平阳性细胞的轨道外(图16；第1行，第4列)。CB6-低分组的贮积清除似乎较低(图16；第2行)，因为前皮质，纹状体和脑干中仍存在非律平阳性细胞(图16；第2行，第2、5、7列)。在较高剂量下(CB6-高)，CB6载体的效率非常高，整个大脑中溶酶体贮积消退(图16；第3行)。如前所述，腹侧海马和背侧丘脑中存在非律平阳性细胞，但比CBA-WPRE中少(图16；第3行，第1列，第4列)。与未处理的βgal

还通过非律平染色评估了AAV处理的动物的脊髓的贮积含量。CBA-WPRE动物中的脊髓在颈部区域中几乎没有剩余贮积，但是胸部区域仅显示出最小的减少(分别为图17A-17B，箭头)。与未处理的对照相比，CB6-低的动物中的脊髓几乎没有可区分的贮积减少(图17C-17D)。CB6-高动物中的脊髓在颈和胸区域中几乎没有溶酶体贮积(图17E-17F，箭头)。如所预期的，与未处理的βgal

通过LC-MS/MS定量CNS中的GM1神经节苷脂水平(图18)。在CBA-WPRE和CB6-低分组中，与未处理的βgal

实施例7

在对泰-萨二氏病患者进行临床试验之前，对非人类灵长类动物进行了最终的安全性研究。本研究被设计为具有不同终点的单剂量(基于先前在GM2小鼠和猫中的研究；总载体剂量为3.2E12 vg)研究，以证明由将AAVrh8载体制剂双向注射到丘脑和一侧脑室组成的注射程序的安全性。

注射AAVrh8制剂(N＝3)的首批NHP在注射后28天内出现中度至严重的神经系统症状。对NHP实施安乐死，并且CNS的组织学评估揭示沿着似乎为注射轨道的丘脑中大面积坏死和髓磷脂损失(图22A-22D)。相反，注射盐水的NHP没有显示症状，并且在尸检时(注射后＞90天)没有神经病理学的证据(图22F)。除了大脑进行组织病理学评估以外，还检测到己糖胺酶活性高于正常活动的6至48倍(图24)。

给另外两个NHP分组(每个分组N＝2)注射分别为原始剂量的1/10和1/30的总剂量2E11和1.1E11 vg的AAVrh8载体制剂。注射较低剂量的表达cmHexA亚基的AAVrh8载体制剂的4个NHP的3个中形成神经系统症状，但随着剂量的减少，发作逐渐延迟。尽管症状发作有所延迟(或一个NHP中没有明显症状)，但在较低剂量分组中，所有4个NHP中脑的神经病理学评估揭示广泛的坏死区域，神经元损失和血管套扎(图22E)。与注射盐水的动物相比，这些NHP中脑中的己糖胺酶活性也有所提高(图23)。在脊髓中还发现Hex表达增加，在1x剂量的动物中更为明显(图23，下排)。

作为与AAVrh8壳体和/或制备方法相关的潜在毒性的对照，另一NHP分组(N＝2)接受3.2E12 vg的转基因空AAVrh8载体，并且两只动物在整个研究过程中均表现出正常的行为(>注射后90天)。表3总结了研究中所有动物的行为观察。

尸检前，在较低剂量分组中对一些NHP进行了脑部MRI，并在丘脑中发现双侧信号改变，推测由于水肿引起(图24，顶行)，但观察到注射转基因空AAVrh8载体的NHP没有变化(图24，下排)。

除了沿着注射轨道的丘脑中神经元损失外，在邻近区域还观察到加载有胞内嗜酸性粒细胞的神经元的大视野(图25E，25G)，这在脑的其他区域中并不明显(图25F)。用对己糖胺酶α或β亚基特异的抗体进行的免疫荧光染色揭示这些颗粒可能含有这两种蛋白质(图25A，25C)。仅在丘脑中观察到这些加载有HexA亚基阳性颗粒的细胞(图25B，25D)，这与H&E染色切片中的发现相关。这些观察结果使人联想到在GUSB转基因小鼠模型中的发现，在该模型中蛋白质溶酶体贮积在几个组织中是明显的(Vogler et al.，2003)。

在正常的青少年NHP中存在有来自此安全性研究的两个主要观察结果：首先，尽管沿着注射轨道的大量神经元损失和炎症(图22)，但含有大量HexA阳性神经元的丘脑区域似乎完好无损，没有明显的炎症浸润物证据(图25E和25G)，其次，没有最高剂量下与转基因空AAVrh8载体相关的毒性的证据。因此，认为AAVrh8-HexA介导的基因转移后NHP脑中的神经毒性是由HexA在AAVrh8转导的丘脑神经元中的大量过表达引起的，该过表达触发细胞死亡超过未知阈值并导致继发性神经炎症响应(血管扎套等)。

表3：在研究动物中观察到的神经系统症状的概述

实施例8

在瞬时转染293T细胞后，针对己糖胺酶(Hex)酶表达水平测试新的AAV载体质粒(图26)。在图27和28中显示了两个例子。

原始的AAV载体质粒对(pAAV-CBA-CI-Wdelta6ATGs)产生最高水平的Hex活性，并且没有启动子(pAAV-NoP)或转基因(空转基因)的AAV载体质粒没有产生相对于幼稚未转染的293T细胞的Hex活性的任何可检测增加(图29)。其他AAV载体质粒对产生了Hex活性的梯度。选择六个实验AAV载体对与两个AAV载体对照(无启动子和无转基因)一起在裸鼠中进行进一步测试。总共生产了15种载体原液用于体内测试(表4)。

将AAV载体以1.32x10

使用人工底物MUG(图36)和MUGS(图37)在4个冠状脑区，小脑，脑干和脊髓中测量Hex活性。表4显示了包含注射部位的冠状脑区的Hex活性以总结发现。原始的AAV载体对(第1组)产生的Hex活性比正常值高400-1,700倍。与细胞培养中的结果相似，其他AAV载体对在脑中产生的Hex活性比原始AAV载体制剂(第1组)低3倍(第2组)，20-30倍(第4组)和50-100倍(第6组)，提供脑中的AAV介导的Hex表达的1-2个对数活性的预期范围。其他AAV载体对(第3组和第5组)未产生高于无胸腺裸鼠脑中正常水平的Hex活性。对照组(第7、8和9组)未显示显著的Hex活性变化。

对脑的神经病理学检查揭示了在第1组动物中，大量含有嗜酸性颗粒的丘脑神经元(图31K)。此发现与在第1组中注射这些AAV载体的猴中的观察结果相同，但是这些异常神经元的数量在小鼠中似乎比在猴中低得多。在第2组动物中也进行了该观察，但是异常神经元的数量比第1组中低得多(图31L)。在第2组动物的海马中观察到相同的神经元(图31B)。在其他任何一组动物中没有此类神经元的证据。使用针对HexAα亚基的抗体进行的免疫荧光染色揭示了在第1组(图31A，31K)，第2组(图31B，31L)，第4组(图31D，31N)和第6组(图31F，31P)中，动物的海马和丘脑中的大量表达酶的细胞。没有对照组中Hex-alpha亚基表达的证据，这可能是因为该研究中使用的抗体的物种特异性，该抗体检测人和猕猴的猕猴酶，但不能检测小鼠蛋白。

与对照(图33I,33J,33S,33T)相比，在注射了原始AAV载体制剂的动物(组1)(图33A，33K)中，在海马和丘脑中观察到了Iba-1染色的显著增加(小胶质细胞活化)。小胶质细胞活化的此证据定位到如下部位，其中通过免疫荧光染色检测到HexA阳性细胞(图32A，32K)，脑中其他部位的小胶质细胞没有明显变化。在第2组和第3组中，海马和丘脑中Iba-1染色的增加轻得相当多(图33B-33C，33L-33M)，并且与第4-7组中的对照基本上不能区别(图33D-33G；33N-33Q)。

还使用GFAP免疫染色法分析了脑的反应性星形胶质化的证据(图34)。在海马中，仅在注射了原始AAV载体制剂的动物(第1组)中发现了反应性星形胶质化的证据(图34A)。所有其他组与对照不能区别。在丘脑中，在第1-3组中似乎存在一定程度的星形胶质化(图34K-34M)，并且在4-7组中的对照组有轻度或不能区分的水平(图34N-Q)。在任何组中没有脑的其他区域中星形胶质化的证据。

两个新的AAV载体(图35)AAV-CB6-I-cmHex(由SEQ ID NO:4表示的启动子)和AVP2-I-cmHex(由SEQ ID NO:5表示的启动子，由SEQ ID NO:6表示的构建体)符合在实验开始前定义的所有当前可测试标准(缺乏总体行为改变，与对照组相当的rotarod表现，注射后0至30天之间体重恒定或增加，缺乏神经病理学，以及高于丘脑区和未注射喙区中正常值的酶表达)。与对照组相比，这些新的AAV载体制剂(第4和第6组)在脑中产生增加的Hex表达，与对照相比几乎没有或没有神经病理学改变的证据(缺乏嗜酸性神经元，小胶质细胞增生或星形胶质化)。

还测试了新的AAV-CBA-I-cmHex载体(图35)，其中从原始AAV载体中除去wpre元件，但表达元件(启动子和人工内含子)保持不变。与原始AAV载体相比，此AAV载体(第2组)显示低约3倍的Hex活性水平，和与原始AAV载体相比降低的小胶质细胞增生。考虑到表达元件与在Sandhoff小鼠和猫的长期实验中使用的AAV载体中的表达元件相同，因此认为AAV载体也可以介导长期表达。考虑到Hex表达水平的降低和小胶质细胞的较轻度活化，此种新的AAV载体不太可能在实施例9中的剂量(3E11 vg)和持续时间下显著影响NHP的行为。

表4.实验组和注射区中的Hex活性(MUG和MUGS)

注意：相对酶活性指高出无胸腺裸鼠的脑中正常值的Hex活性的倍数升高。

实施例9

与原始AAV载体制剂相比，在无胸腺裸鼠中选择了三种AAV载体设计(图19和35)以增加脑中β-己糖胺酶的表达，并减少炎症应答(星形胶质化和小胶质细胞活化)。将AAVrh8载体注射到NHP(表5)中，以筛选针对AAVrh8壳体的中和抗体的缺乏或极低的滴度。

将总剂量为3.2x10

在整个90天的研究中，所有六个注射AAVrh8的NHP的行为均保持正常。按照计划，每月进行脑部MRI(图39)。从第30天开始，在第2和第3分组的两只猴中记录了注射部位的信号变化，但是没有随时间的明显变化(图40B，40C)。第1分组中的一只猴中在注射后第30天和第60天脑MRI中没有信号变化，但是在第90天时左丘脑中检测到较大的信号变化(图40A)。尽管在第90天出现此异常信号，但在整个研究过程中，这只猴的总体行为保持未改变。

将脑切成4mm的冠状块，并用于绘制己糖胺酶(Hex)活性并评估神经病理学。使用生检穿孔(直径3mm)对脑进行采样以生成酶分布图(图41)。在所有分组中仅在丘脑的穿孔中检测到高于正常值的总Hex活性(HexA，HexB和HexS)(表6)。与无胸腺裸鼠中的研究一致，在第1分组中，丘脑穿孔中的总Hex活性最高(高于正常值的多达87倍)，在第2和3分组中相似(高于正常值多达9倍)。大多数其他采样的脑区域中的总Hex活性与未注射的对照猴相似。

对脑的神经病理学评估揭示，在第1分组的猴中神经元内嗜酸性粒细胞物质大量积累(图42，黑色箭头)。在第1分组动物中观察到中度至严重的神经元变性。在第1分组中的一只猴(ID 295851)的左丘脑中存在严重的局灶性棘细胞层水肿和血管周套扎(图43A，43B)。该病变对应于在注射后90天在第1分组中的一只猴的左丘脑中变得明显的异常MRI信号(图40A)。

在第2分组中，没有嗜酸性物质的积累，罕见的神经元变性和卫星现象。在一只猴(ID 295847)中发现了白质的局灶性炎症伴有神经元变性，最可能与注射部位/轨道损伤有关。

在第3分组中，没有神经元内嗜酸性物质的积累，罕见的神经元变性和卫星现象(图44A)。在一只猴(ID 295709)中，存在可能与套管插入术相关的血管周格子细胞的病灶(图44B)。制备在第1和3分组中猴的整个左和右丘脑之间相隔150μm的连续切片，用于定量组织学发现，即神经元内嗜酸性物质的积累(图45)，神经元变性和坏死(图46)以及炎症(图47)。这些发现表明，制剂1和3在脑中具有相当的影响，除了第1分组中一只动物的左注射部位外，在该处存在相当大的神经元变性，坏死，棘细胞层水肿和相应的炎症。这些发现与90天脑部MRI非常吻合(图40A)。

进行了一项引导研究，以确定新载体AAVrh8-CBA-cmHex(图19)和AAVrh8-CB-I-cmHex(图19)在颅内递送后减少Sandhoff病(SD)CNS中GM2含量的有效性。原始的AAVrh8-CBA-cmHex-W

表5：注射新AAV载体的NHP分组

表6：注射AAVrh8的NHP的丘脑中总己糖胺酶(HexA+HexB+HexS)活性增加

实施例10

产生了AAV载体，其携带人突触蛋白-1(也称为“Syn1”)和GfaABC

检查双重启动子载体的转导概况。将AAV9-Syn1-GFP-2xmiR

测量SOD1 mRNA的表达。数据表明在注射双重启动子AAV9-Syn1-GFP-2xmiRSOD1/GFAP-2xmiRSOD1-mCherry载体后，成年SOD1

数据表明，与目前使用泛在启动子(例如CBA，U6)的方法相比，这种双重启动子构建体导致CNS中特定细胞类型(例如神经元和星形胶质细胞)的更广泛的转导，对非CNS组织的毒性降低。

实施例11

通过两种方法将1:1的编码己糖胺酶A和B亚基(分别为SEQ ID NO:20和21)的rAAVrh8颅内注射到4周龄SD小鼠中，所述两种方法是双侧丘脑(TH)和小脑深核(DCN)注射的组合(TH/DCN)，或双侧丘脑注射联合单次脑室内注射(TH/ICV)。从60日龄(注射后一个月)开始，随时间评估AAVrh8处理的SD小鼠(4.68x10

为了确定增加AAVrh8的剂量是否进一步延长SD小鼠的存活，进行了剂量递增研究。在颅内TH/ICV输注AAVrh-mHexA/B前两天，将SD小鼠静脉内输注AAV8-TRG-mHexB(3x10

当通过倒置筛网表现(图54B)，rotarod表现(图54C)或线悬挂测试(图54D)进行测量时，在120天时与未处理的SD小鼠相比，在4.68x10

为了评估在不存在潜在的神经变性性过程的情况下颅内AAVrh8载体输注的潜在影响，龄期匹配的杂合子(HZ)同窝仔(HexB+/-)小鼠通过TH/ICV或TH/DCN接受颅内注射4.68x10

在TH/ICV AAVrh8处理的(1.17x10

实施例12

所有SD猫实验均使用AAVrh8-CBA-mHexA/B-WPRE，其与要用于人应用的载体构建体(AAVrh8-CB-CI-hHexA/B)略有不同。在自然发生的SD猫模型中进行治疗功效研究，在该模型中疾病迅速进展，平均存活至4.3±0.2个月龄。在这些研究中，使用分别编码野生型猫己糖胺酶α和β亚基的两个AAVrh8载体的1:1制剂。

此处报告了长期治疗功效数据。SD猫通过双侧丘脑注射组合单侧ICV注射(ICV；n＝5；)以总剂量4.6E11 vg(两种载体的比率为1:1，表7)进行处理。基因疗法显著增加SD猫的存活(p＜0.0001；图57A)，最老的猫存活至29.9个月。未处理的SD猫经历严重的小脑疾病，明显全身静止，意向性震颤，变得虚弱，失去移动能力，随后在约4个月龄时实施安乐死。在AAV基因疗法后，神经体征明显改善(图57B)。在所有处理的猫中，震颤都得到完全缓解，并且大多数猫在整个研究过程中都保持行走的能力，并且由于肌肉骨骼或胃肠道疾病而实施安乐死，这不是SD猫的传统神经系统疾病表型的部分(表7))。

表7：SD猫模型的分组、剂量和施用途径信息的概述

两种AAV载体的丘脑结合ICV注射(Th+ICV)导致己糖胺酶广泛分布于整个皮层，小脑和脊髓中(图57B和57C)，脑中唯一具有较低分布的区域是颞叶(图57D，图57D和图57E的侧视图。HexA水平在整个脑，小脑和脊髓中接近或高于正常值，并且在丘脑注射部位处达到正常值的接近50倍(图57E)。尽管注射部位处的Hex的超生理水平，但在AAV处理的猫中未发现任何组织病理学异常。

SD猫的人道终点时的MRI(T2W)显示整个脑中灰质变暗(GM2的贮积)和白质变亮(脱髓鞘)(图58A)。在AAV基因疗法之后，除了颞叶外，整个脑的灰质和白质强度均正常化，所述颞叶似乎具有减少的Hex分布(图58D)。尽管灰质和白质强度正常化，但在AAV处理的SD猫中皮质萎缩仍然持续，如侧脑室和脑周围沟中CSF升高显示。使用MR光谱法，在未处理的SD猫的丘脑中检测到有毒代谢物N-乙酰己糖胺(NA-Hex)的显著增加，这先前已在患有SD的小鼠和人类中报道过。在AAV基因疗法后，NA-Hex在所有猫中完全降低至正常水平(图58B)。在正常或高于正常水平的AAV处理的猫中，HexA水平升高，并且在猫的整个生命中，HexA升高持续存在(图58D)。天冬氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶(细胞毒性的标志物)在SD猫的CSF中升高，并且在AAV基因疗法后，这些酶的水平恢复正常(图58D和58E)。在处理后1-2个月，存在针对壳体的血清抗体滴度，但是随着时间逐渐减少(图58G和58H)。唯一在1年前达到人道终点的猫(11-907)在处理后约2个月具有最大血清抗体滴度1:6，而终点滴度仅为1:16(图58G)。相反，活到26个月龄的猫(7-760)在手术后3.6个月时的最大效价为1:16(图58H)。由于载体原液的量有限，因此不能分析所有时间点；然而，在处理后约20个月，血清滴度降低至1:1(图58H)。

尽管进行CNS指导的AAV传递，但SD+AAV TH/ICV猫中的外周器官的HexA酶促活性增加。坐骨神经相对于正常值实现了203％增加，而正常的肝脏和肌肉增加到正常的53和20％(表8)。

表8：外周组织中的己糖胺酶活性

HexA＝MUGS活性；HexT＝总Hex活性；MUG；β-gal–β-半乳糖苷酶酶促活性；Mann-甘露糖苷酶的酶活性。

在这项研究中，测试了两个单顺反子载体的AAVrh8递送，所述载体编码猫HEXA或HEXB，侧翼有鸡β肌动蛋白(CBA)启动子和土拨鼠调控后元件(WPRE)。通过小脑延髓池注射处理猫(6.4E

Hex在SD+AAV CM猫中的生物分布在整个脊髓和小脑中广泛分布，但在前脑区域中减少(图59C，59D，59E)。在SD+AAV CM短期(数据未显示)和长期处理的SD猫中，己糖胺苷酶A(HexA)活性在小脑和脊髓中达到或超过正常水平，但在含有前丘脑，纹状体和额皮层的区(分别是脑区D-A)中与未处理者相当。载体生物分布的趋势相似，其中脑区D(分析的最前区)的vg拷贝数最低(图59F)；但是，qPCR不能反映脊髓和脑之间Hex表达差异的幅度。

SD猫中的贮积以高碘酸-希夫(PAS；灰度)染色为代表，该染色对糖脂(例如GM2)进行染色。染色较深的区域(例如PAS阳性)表示神经节苷脂贮积增加。在SD猫中，灰质中的PAS染色增加，而白质的染色减少，这与神经节苷脂在细胞体内的贮积和脱髓鞘是一致的。在SD+AAV CM猫(长期)中，贮积清除反向反映Hex的生物分布，在脊髓和小脑中但不在皮质中具有有效的贮积清除。PAS阳性物质持续存在于脑皮层和深层脑结构中。以PAS阳性物质的丧失代表的脱髓鞘也清楚地表现在治疗猫的脑皮层的白质中。

在SD猫小脑中，存在广泛的神经变性，这在H&E染色中是明显的(图61)。浦肯野细胞，小脑深层神经元和脑干神经元显示出严重变性，细胞损失以及大量泡沫状，空泡化的细胞内贮积的体征。基因疗法后16周，经AAV-CM处理的SD猫的浦肯野细胞，小脑深核和脑干细胞形态正常化(图61)。在追踪到人道终点的动物中，DCN和脑干中注意到形态学正常化，但蒲肯野细胞的变性和损失持续存在。令人感兴趣的是，长期AAV处理的猫在小脑顶核的背体方面表现出葡萄状嗜酸性包涵体(插图)(图61)。这些包涵体先前显示在实质性注射AAV后对Hex呈免疫阳性。超高场MRI(7Tesla)T2加权MRI显示AAV处理的动物中MRI结构的正常化，这反映了Hex的分布(图62A)。在未处理的SD猫中，灰质和白质强度发生反转，这是由于白质中水增加(脱髓鞘)和灰质中脂质增加(GM2贮积)所致。小脑延髓池注射后16周，MRI强度出现部分正常化，胼胝体(图62A；黑色箭头)，放射冠(图62A；白色箭头)和小脑白质(图62A；黑色箭头)的白质强度变暗。在SD+AAV CM猫的人道终点时，脑皮质中灰质和白质的病理强度反转持续存在，但皮质萎缩减弱，并且小脑白质强度得以部分恢复(黑色箭头)。SD猫的丘脑(图62C)，顶叶皮层(图62D)和小脑(图62D)的MR光谱术具有毒性代谢物N-乙酰基己糖胺(NA-Hex，图62B)升高。在16周的SD+AAV CM猫中，NA-Hex在丘脑(图62C)和小脑(图62E)中减少，但在人道终点(图62E)评估的一个SD+AAV CM长期猫的顶皮质中继续增加(图62D)。其他代谢物变化支持AAV处理后小脑的髓鞘化(胆碱+磷酸胆碱)和代谢活性(肌酸+磷酸肌酸Cr+PCr)的部分校正(图62E)。

在所有SD+AAV猫中，HexA的CSF水平均高于正常(图62F)，其中一只猫(11-1042)的CSF HexA活性从5个月到人为终点急剧下降。一只长期SD+AAV CM猫(11-1042)中的细胞毒性CSF标志物，天冬氨酸转氨酶(AST；图62G)和乳酸脱氢酶(LDH；图62H)降低至接近正常水平，而在另一只猫(11-1148)中适度增加。

实施例13

小鼠

为了CNS GM2神经节苷脂含量中的影响进行短期生物化学分析，以两种剂量4.68x10

为了改善对脊髓和小脑中GM2神经节苷脂贮积的影响，在保持丘脑剂量(1.17x10

实施例14

对单个患有泰-萨二氏病的受试者设计有同情心的使用研究。基于上述临床前数据和缺乏可用于泰-萨二氏病患者的治疗，施用rAAVrh8-HexA/B。

在治疗前的三周中，对患有晚期婴儿泰-萨二氏病(约30个月龄)的受试者进行了几次临床安全性测试，并在治疗前约7天施用免疫抑制方案。受试者具有两个突变体HexA等位基因：1)HexA，4-BP插入(c.1274-1278)，最常见的Ashkenazi突变；2)HexA，c.82C->T(p.Gln28)。另外，受试者先前表现出以下疾病进展：

8个月–夸张的惊吓反射

12个月–大头畸形，MRI上髓鞘形成异常，MRS生物标志物异常

14个月–首次不发烧的颠痫发作→诊断

17个月–G管插入

20个月–由于反复发作而进行急诊

受试者的癫痫发作根据需要通过基线药物和直肠咪达唑仑合理控制。对受试者用G管饲喂生酮饮食，Miglustat，Keppra，Prevacid和氯硝西泮。

将包含rAAVrh8-HexA/B rAAV生物产物的组合物以由受试者的CSF压所决定的速率输注入受试者中。施用的rAAVrh8-HexA/B制剂的目标剂量为1.0x10

根据19-40个月龄的女婴的1040±130g脑重，计算出施用于患者的总剂量。通过荧光镜检引导的腰部鞘内导管施用总剂量，其中约75％递送至小脑延髓池，约25％递送至椎管(图74A)。通过被动流取出14mL的CSF，然后在小脑延髓池水平下以约1mL/min施用9ml的AAVrh8载体(图74B)。以L2水平输注3ml的AAVrh8载体(图74C)。由于受试者患有晚期疾病，因此未对受试者施用共递送的丘脑内rAAVrh8-HexA/B注射。

研究中使用的生物产物是两个非复制的单链腺相关病毒载体，分别称为AAVrh8-CB-ci-HEXA和AAVrh8-CB-ci-HEXB(rAAVrh8-HexA/B)，它们分别产生。载体的分子特征在表9和10中描述。AAVrh8载体在鸡β-肌动蛋白启动子下编码人HEXA和HEXB。所用的AAV载体质粒在图65-67中描述。将载体配制在不含Mg2+和Ca2+的磷酸盐缓冲液中。

rAAVrh8-HexA/B通常耐受性良好，没有截至三个月的临床更新报告的施用相关的严重不良事件。在三个月时，治疗后未观察到临床相关的实验室异常，并且在处理后未观察到显著的免疫应答。从基线到第3个月，受试者的临床状况稳定，神经科检查上未观察到恶化。此外，与基线时的脑部的治疗后MRI相比时，在3个月时的脑部磁共振成像(MRI)上没有明显的从基线下降的证据。这些数据在图69中显示。

3个月时的数据收集还表明，一剂利妥昔单抗完全抑制受试者的CD19和CD20计数(<1％的外周T细胞)，并且通过IVIg输注将IgG维持在安全范围内。这些数据在图70中显示。

受试者在3个月后具有接近基线的针对AAVrh8壳体的中和抗体水平，并且在3个月后未见到针对转基因产物的中和抗体。另外，在3个月后，未看到对转基因产物的T细胞应答或对壳体的细胞毒性T细胞应答。T

在最初的21天内看到酶AST(低于基线的2倍)和ALT(低于正常上限的2倍)的非常轻微的增加，并且自发地消退。没有看到基于hs-CRP或总补体活性的全身性炎症适应症。肝脏超声和小儿GI咨询未显示具体病理。

使用4MUGS测定法测定β-己糖胺酶A活性。基线时，受试者的CSF中β-己糖胺酶A活性为正常值的0.46％。三个月后，受试者的脑脊液中β-己糖胺酶A活性明显增加至正常酶活性的1.44％，从基线增加超过三倍。在图68中显示了在rAAVrh8-HexA/B施用之前和之后直至三个月，血清和CSF中的HexA酶活性。

如图71中所示，脑脊液(CSF)中的GM2神经节苷脂从基线减少约25％。这表明CSF中β-己糖胺酶A的酶活性从基线增加3倍与GM2神经节苷脂的减少有关，所述GM2神经节苷脂在泰-萨二氏病患者中积累并被认为导致疾病进展。另外，如通过Western印迹测量的β-己糖胺酶A蛋白表达从基线增加到第3个月。这些数据显示在图72中。

表9：质粒pAAV-CB-ci-hHexA(v2)中的分子特征

表10：质粒pAAV-CB-ci-hHexB中的分子特征

实施例15

对第二位患有晚期婴儿泰-萨二氏病的受试者(约3个月龄)施用rAAVrh8-HexA/B。在治疗前的三周中，对受试者执行几次临床安全性测试，并在治疗前施用免疫抑制方案约7天。受试者具有两个突变体HexA等位基因：1)HexA，外显子11-13缺失1.75kb；2)HexA，p.Val381是外显子10中的截短突变。

在施用rAAVrh8-HexA/B之前，受试者在临床上良好，检查正常，生长和发育正常，无癫痫发作或夸张的惊吓反应的证据。与野生型活性相比，该受试者具有约1％的己糖胺酶活性。

实施例16

针对(rAAVrh8-HEXA/B)设计了一项临床研究。该研究设计为分别在婴儿期发作泰-萨二氏病(TSD)或Sandhoff病(SD)中分开双侧实质内丘脑和鞘内施用编码HEXA和HEXB的AAVrh8载体的两阶段，剂量递增以及安全性和效力研究。如下描述概述临床研究。由于GM2神经节苷脂累积病的迅速发展和致命性质，并且缺乏批准的疗法，因此研究将不使用安慰剂或活性对照组。治疗不是盲的。

这项研究中的受试者是基因转移时小于18个月龄的男婴和女婴(针对早产(<37周妊娠)的婴儿进行调整)，根据基因突变分析和症状发作为婴儿期发作的TSD或SD。TSD和SD受试者必须分别具有编码α亚基的HEXA基因突变或编码β亚基的HEXB基因中的突变。受试者将表现出无需支撑即可坐下5秒的能力，被认为是合适的外科手术候选人(根据研究和MRI发现由研究神经外科医师确认)，血清Hex A活性低于正常值的5％，并且不携带G269S或W574C突变。根据实验室测定的阈值，受试者还将对AAVrh8中和抗体呈血清阴性。其他纳入/排除标准也可以适用。

研究是开放标签，非随机化，单次病毒载体rAAVrh8-HEXA/B施用，通过双侧丘脑(BiTh)和鞘内(IT)施用进行。受试者将在两个阶段中在研究中登录(图73)，如下：

阶段1：连续以剂量递增的方式对四名受试者进行治疗，目的是确定最佳剂量。剂量选择将从安全性，生物标志物和其他数据确定；第2阶段：将以第1阶段鉴定的最佳剂量治疗多达约10名受试者，目的是确定安全性和效力。

所有受试者将参加计划长达4年的长期随访(LTFU)，以确定治疗的持续安全性和效力。

将在2天的过程中给予研究治疗，如下以最小化延长麻醉时间的风险：在第1a次访视/第0天时，受试者接受双侧实质内注射rAAVrh8-HEXA/B进入脑每侧的丘脑中；在第1b次访视/第1天时，受试者接受IT输注rAAVrh8-HEXA/B。所有输注由rAAVrh8-HEXA和rh8AAV-HEXB的1:1混合物组成。

为了预防炎症应答的风险并保护AAV转导的细胞免受对AAVrh8壳体的免疫应答，在施用AAVrh8-HexA/B治疗之前，应对受试者进行免疫抑制。免疫抑制方案将按照预定义长期保持。

从研究的第-16天开始，将启动以下操作：

·375mg/m

·10mg/kg的Solu-Medrol

·1mg/m

·2mg/kg/天泼尼松龙

·1-1.5mg/kg/天的兰索拉唑

·每周3次(M，W，F)以10mg/kg/剂量给予的甲氧苄啶/磺胺甲恶唑

第-7天：

·西罗莫司、泼尼松龙和兰索拉唑的继续给药

·继续甲氧苄啶/磺胺甲恶唑

·利妥昔单抗输注，根据需要，用于大于或等于5％的持续CD20计数

第-2天：

·继续西罗莫司，泼尼松龙和兰索拉唑

·继续甲氧苄啶/磺胺甲恶唑

第0天/BiTh输注日

·继续西罗莫司，泼尼松龙和兰索拉唑

·继续甲氧苄啶/磺胺甲恶唑

第一天IT输注日

·继续西罗莫司，泼尼松龙和兰索拉唑

·继续甲氧苄啶/磺胺甲恶唑

第2-7天：

·继续西罗莫司，泼尼松龙和兰索拉唑

·继续甲氧苄啶/磺胺甲恶唑

·静脉内免疫球蛋白(IVIG)施用–免疫球蛋白水平必须低于700mL/dL。将调整剂量以维持700-1000mg/dL的血清谷水平。载体输注后会发生。

第14天：

·继续西罗莫司，泼尼松龙和兰索拉唑

·继续甲氧苄啶/磺胺甲恶唑

第21天：

·继续西罗莫司，泼尼松龙和兰索拉唑

·继续甲氧苄啶/磺胺甲恶唑

第4周/第1个月：

·继续西罗莫司，泼尼松龙和兰索拉唑

·继续甲氧苄啶/磺胺甲恶唑

·IVIG施用

第4周/第2个月：

·继续西罗莫司，泼尼松龙和兰索拉唑

·继续甲氧苄啶/磺胺甲恶唑

·IVIG施用

第12周/第3个月：

·继续西罗莫司

·继续甲氧苄啶/磺胺甲恶唑

·IVIG施用

第24周/第6个月

·在咨询医院药剂师的指导下戒断西罗莫司

提出的用于阶段1的对丘脑(Th)递送的临床剂量和输注体积为2.8e12至1.1e13vg/ml，例如如表11中所示。

表11。

可以根据输注体积(Vi)，靶标脑区域(丘脑)的体积乘以载体从递送点源扩散多远的校正因子来计算用载体填充的丘脑的量或分布体积(Vd)。从其他AAV IPa输注研究，Vd:Vi之比假定为3.0(Yin,Richardson et al.2010)(Yin et al,2010)。如表12所示，相对于人丘脑的体积计算为1.08mL的Vi和4.35ml

表12。

1.08ml的Th输注体积处于或大于临床试验第1阶段中受试者1至3的提出输注体积。丘脑内低，中和高剂量施用的调整的提出临床剂量为7.2e12至1.4e13 vg。

鞘内施用的提出人剂量是范围为2.03e13至8.13e13 vg和直至8mL的输注体积的剂量(参见下表)。提出将后者的值用于所有治疗受试者间的设定IT剂量8.0e13 vg的临床研究中。

表13。

在整个过程中，在插管的情况下将受试者置于全身麻醉下。然后将已经用载体引发并连接到递送注射器和泵的右侧输注套管和连接线立体定位放置到右丘脑中的靶标区域中，以0.1μL/min运行输注以防止套管尖端的任何阻塞。柔性导管通过锚定缝合线和粘合剂敷料固定在头皮上。然后重复相同的步骤以将第二导管放置在左侧。在整个过程中将持续进行ICP监测。

输注速率从0.5μL/min开始，每5分钟增加(1.0μl/min→2.0μl/min→5μl/min)。通过含有作为1:1HexA和HexB载体混合物的研究药物的微量输注泵和注射器将研究药物输注到每个导管中。

IT施用：IT药物输注将以CSF压力决定的速率输注。向高颈水平/小脑延髓池递送总共6.0ml，在胸腰水平递送2.0ml。Tuohy脊柱针在荧光检查引导下插入蛛网膜下腔中。进入蛛网膜下腔将通过自发的CSF流进行验证。通过重力将总共排出6-7mL的CSF，然后在直接的荧光检查引导下，将柔性的

·

·替代生物标志物：血清/CSF HexA活性从基线变化至访视7(第3个月)

·临床功能：根据Bayley婴幼儿发育量表第3版(Bayley Scales of Infant andToddler Development,Third Edition，BSID-III)第22项在第9个月/第12个月时评估，实现在没有支撑的情况下坐5秒的能力的受试者的比例

·生命体征变化，包括体重

·身体和神经系统检查的变化

·临床实验室测试的变化，包括通过自动差异，综合代谢组和hs-CRP进行全血细胞计数

·CD20计数

·ECG,EEG，

·对AAVrh8壳体和HEXA和HEXB蛋白的细胞应答和中和抗体滴度以及针对HEXA和HEXB蛋白的抗体水平

·

-CSF HexA活性水平从基线变化至访视9(第12个月)

-血清HexA活性水平从基线变化至访视4、5、6、7、8和9

-CSF GM2神经节苷脂水平从基线(通过LC-MS/MS)变化至访视9(第12个月)

-乳酸脱氢酶(LDH)和天冬氨酸转氨酶(AST)的CSF水平从基线变化至访视7(第3个月)和9次(第12个月)

1.根据BSID-III第22项5、7和8时评估，实现在无支撑的情况下坐5秒的能力的受试者的比例

2.CHOP-INTEND总分从基线变化至访视5、7、8和9

3.在第5、7、8和9次访视时，CHOP INTEND运动功能量表中的得分达到40分或更高，50分或更高和64分的受试者的比例

4.BSID-III综合得分从基线变化至访视5、7、8和9

5.在访视7、8和9时，根据Hammersmith婴儿神经系统检查2(HINE-2)中评估，达到任何新的运动标志的受试者的比例。

新的运动标志定义为无支撑坐下，手和膝盖爬行，有辅助站立，有辅助行走，独自站立和独自行走

6.使用BSID-III-总运动子集#43至少采取独立显示协调和平衡的五个步骤的受试者的比例

·脑干听觉诱发反应(BAER)和视觉诱发反应(VER)从基线到访视7、8和9的从基线的变化

·髓鞘形成和脑水的MRI脑体积和弥散张量成像(DTI)指数从基线变化到访视7和9

·代谢物累积的MRS指标从基线变化到访视7和9次

·眼追踪评估从基线变化到访视4、5、6、7、8和9

从筛选到治疗结束评估以下内容：

·不良事件将根据NCI CTCAE v5.0进行评估和分级

·体格检查

·生命体征

·标准临床实验室测试：血液学，临床化学，凝血和尿液分析

·特别关注的不良事件(AESI)：

-手术相关并发症

-装置相关的并发症

-急性超敏反应

-肝功能测试升高(AST/ALT，GGT)

-血液学参数病症，尤其注意血小板计数

-延迟的不良事件，包括但不限于自身免疫样反应和恶性肿瘤

实施例17

与本公开有关的其他细节在2019年4月29日提交的美国临时申请62/840,359的附录A中提供，其全部内容通过引用并入本文。测试了通过微导管对小脑延髓池进行AAV施用的方法。通过血管内微导管将scAAV9-CB-GFP以1x10

本公开的应用不限于在本说明书中阐述或在附图中示出的构造细节和组分排列。本公开能够具有其他实施方案并且能够以各种方式实施或进行。同样，本文所使用的措词和术语是出于描述的目的，并且不应视为限制。本文中“包括”，“包含”或“具有”，“含有”，“涉及”及其变体的使用意在涵盖其后列出的项目及其等同物以及其他项目。

因此，已经描述了本公开的至少一个实施方案的多个方面，本领域技术人员将容易想到各种改变，修改和改进。此类改变，修改和改进旨在成为本公开的一部分，并且旨在落入本公开的精神和范围内。因此，前面的描述和附图仅作为示例。

序列表

<110> 马萨诸塞大学

<120> 用于治疗GM1和GM2神经节苷脂贮积病的RAAV载体

<130> U0120.70109WO00

<140> 尚未分配

<141> 共同提交

<150> US 62/848,858

<151> 2019-05-16

<150> US 62/840,359

<151> 2019-04-29

<150> US 62/826,863

<151> 2019-03-29

<150> US 62/815,996

<151> 2019-03-08

<150> US 62/814,587

<151> 2019-03-06

<150> US 62/741,848

<151> 2018-10-05

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 260

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 1

ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat 60

ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 120

ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 180

gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 240

aaagcgaagc gcgcggcggg 260

<210> 2

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 2

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cccacgcgtg cacgtcaccg ttaccggagc aacctgacac cggctccagc 110

<210> 3

<211> 5964

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 3

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ccatgaaccc caaccaggac aatatgagtt ttctggggac cgtgatgtgg agcatttcat 420

ccagctggct catgagctgg gactcctggt gatcctgagg cctgggccct acatctgtgc 480

agagtgggac atggggggct tacctgcttg gctactagag aaacaatcta tcgttctccg 540

gtcttctgac ccagactacc ttgtagctgt ggataaatgg ctggcagtcc ttctgcccaa 600

gatgaagccc ctgctctacc agaacggagg accgatcata accgtgcagg ttgagaatga 660

gtacgggtcc tactttgcct gcgattacga ctacctacgc ttcctggtgc accgcttccg 720

ctaccatctg ggtaatgacg tcattctctt caccaccgac ggagcaagtg aaaaaatgct 780

gaagtgtggg accctgcagg acctgtacgc cacagtggat tttggaacag gcaacaatat 840

cacacaagct ttcctggtcc agaggaagtt tgaacctaaa ggacctttga tcaattctga 900

gttctatact ggctggctag accactgggg taaaccccat tccacggtga aaactaaaac 960

actggctacc tccctctata acctgcttgc ccgtggggcc aacgtgaact tgtacatgtt 1020

tataggtggg accaattttg cctattggaa tggtgccaac acgccctatg agccacagcc 1080

caccagctat gactacgacg ccccactgag cgaggctggg gacctcacta agaagtattt 1140

tgctcttcga gaagtcattc agatgtttaa agaagtccca gaaggcccta tccctccgtc 1200

tacacccaaa tttgcatatg gaaaagttgc tctgagaaag ttcaagacag tggctgaagc 1260

tctgggtatc ctgtgtccca atgggccagt gaaaagcctc tatcccctga cattcactca 1320

ggtaaaacag tattttgggt atgtgctgta ccgaacaacg cttcctcaag attgcagtaa 1380

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gaaggctgga gccacgctgg acatcctggt ggagaacatg gggcgtgtga actatggcag 1560

attcatcaat gacttcaagg gtttgatttc caacatgact atcaactcca ctgtcctcac 1620

caactggacg gtcttcccac tgaacactga ggccatggta cgcaaccatc tctggggccg 1680

ggaggccagt gatgagggtc accttgacgg acggtcgacc tccaattctt cggacctcat 1740

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ggacaccttc atccagtttc ctgggtggtc caagggtcaa gtatggatca atggctttaa 1860

cctcggccga tactggccca caatgggccc acaaaagacc ttgttcgtgc caaggaacat 1920

cctgaccact tcagccccaa acaacatcac agtgttggag ctagagtttg caccctgcag 1980

cgaggggacc ccagagctgt gtacagtaga gtttgttgac actccggtca tttcctgacg 2040

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ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg 2160

taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc 2220

aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt agtcgactag agctcgctga tcagcctcga 2280

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cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 2580

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gcagccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgt 2700

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ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag 2940

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gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc 3060

tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat 3120

gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttcc 3180

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tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg 3300

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tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 3600

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cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac 4020

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atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc 4140

gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac 4200

tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag 4260

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gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta 4380

tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg 4440

ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata 4500

tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt 4560

ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc 4620

ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 4680

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ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag 4800

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tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 4920

actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 4980

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cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg 5340

cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga 5400

gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc 5460

attaatgcag ctgggctgca gggggggggg ggggggggtg gggggggggg gggggggttg 5520

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cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc 5640

aactccatca ctaggggttc ctagatctga attctctagt ccacgttctg cttcactctc 5700

cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt 5760

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ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 5880

ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 5940

gggccgcggg ccgatccacc ggta 5964

<210> 4

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 4

ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat 60

ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 120

ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 180

gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 240

aaagcgaagc gcgcggcggg gggccgcggg gagtcgctgc gacgctgcct tcgccccgtg 300

ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc gttactccca 360

caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga 420

cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg ggctccggga gctagagcct 480

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggtta 540

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tcctcgaaga tccgaagggg ttca 594

<210> 5

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 5

ctggagccgg tgtcaggttg ctccggtaac ggtgacgtgc acgcgtgggc ggagccatca 60

cgcaggttgc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagaggagtc gctgcgacgc 120

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cgggagctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 360

gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattcc 408

<210> 6

<211> 5688

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 6

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattcggt accctggagc cggtgtcagg 180

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gcagagctcg tttagtgaac cgtcagagga gtcgctgcga cgctgccttc gccccgtgcc 300

ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca 360

ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg 420

gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg ctccgggagc tagagcctct 480

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cctggctgct cagtcctcga cgaggccttc cagcgctatc gtgacctgct tttcggttcc 840

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tataccctga ccataaatga tgaccagtgt ttactcctct ctgagactgt ctggggagct 1020

ctccgaggtc tggagacttt tagccagctt gtttggaaat ctgctgaggg cacattcttt 1080

atcaacaaga ctgagatcga ggactttccc cgctttcctc accggggctt gctgttggat 1140

acatctcgcc attacctacc actctctagc atcctggaca cactggatgt catggcgtac 1200

aataaattga acgtgttcca ctggcatctg gtagatgatc cttccttccc atatgagagc 1260

ttcacttttc cagagctcat gagaaagggg tcctacaacc ctgtcaccca catttacaca 1320

gcacaggatg tgaaggaggt cattgaatac gcacggctcc ggggtatccg tgtgcttgca 1380

gagtttgaca ctcctggcca cactttgtct tggggaccag gtatccctgg attactgact 1440

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aatacctatg agttcatgag cacattcttc ttggagatca gctctgtctt cccagatttt 1560

tatcttcatc ttggaggaga tgaggttgat ttcacctgct ggaagtccaa cccagatatc 1620

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gtgtttgata ataaagtaaa gattcggcca gacacaatca tacaggtgtg gcgagaagag 1800

attccagtga actatatgaa ggagctggaa ctggtcacca aggccggctt ccgggccctt 1860

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gggaggtgtg ggaggttttt tagtcgacta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt 2460

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gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca 2640

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tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 3060

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tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 3180

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tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 3300

taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc ctgatgcggt 3360

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atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 3780

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tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 4080

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agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 5040

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 5100

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 5160

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ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 5280

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 5340

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acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 5520

gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 5580

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 7

aaacgtctca ctagtccgcg gaattc 26

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 8

aaacgtctca ctgagaattg atcaaa 26

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 9

aaaggtctcc ggccgctagc gtcag 25

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 10

aaaggtctca tcagttctat actggc 26

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<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtc 36

<210> 12

<211> 4260

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 12

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

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gaccatctgc gctgcggcgc cggcgactca gcgctgcctc agtctgcggt gggcagcgga 600

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ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 1080

ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga 1140

agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 1200

tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 1260

accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 1320

tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 1380

agtccggact cagatcctac tgaactagtc ggcgacggtg ctagcgtcga ccagtggatc 1440

ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgat gaacatggaa tccatgcagg ttttggccac 1500

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gaacaaatgg cccagatcct ggaggcttgc tgaaggctgt atgctgatga acatggaatc 1620

catgcaggtt ttggccactg actgacctgc atggtccatg ttcatcagga cacaaggcct 1680

gttactagca ctcacatgga acaaatggcc cagatctggc cgcactcgaa aacgggcccg 1740

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cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt 1920

tcagggggag gtgtgggagg ttttttagtc gacaacatat cctggtgtgg agtaggggac 1980

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ctcttcatgc ccagtgaatg actcaccttg gcacagacac aatgttcggg gtgggcacag 2160

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gctgaaggct gtatgctgat gaacatggaa tccatgcagg ttttggccac tgactgacct 2820

gcatggtcca tgttcatcag gacacaaggc ctgttactag cactcacatg gaacaaatgg 2880

cccagatcct ggaggcttgc tgaaggctgt atgctgatga acatggaatc catgcaggtt 2940

ttggccactg actgacctgc atggtccatg ttcatcagga cacaaggcct gttactagca 3000

ctcacatgga acaaatggcc cagatctggc cgcactcgaa aacgggccca tcgatagaga 3060

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ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 4020

ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 4080

tgggaagaca atagcaggca tgctggggag agatctagga acccctagtg atggagttgg 4140

ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 4200

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 4260

<210> 13

<211> 470

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 13

gagggccctg cgtatgagtg caagtgggtt ttaggaccag gatgaggcgg ggtgggggtg 60

cctacctgac gaccgacccc gacccactgg acaagcaccc aacccccatt ccccaaattg 120

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<210> 14

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 14

aacatatcct ggtgtggagt aggggacgct gctctgacag aggctcgggg gcctgagctg 60

gctctgtgag ctggggagga ggcagacagc caggccttgt ctgcaagcag acctggcagc 120

attgggctgg ccgcccccca gggcctcctc ttcatgccca gtgaatgact caccttggca 180

cagacacaat gttcggggtg ggcacagtgc ctgcttcccg ccgcacccca gcccccctca 240

aatgccttcc gagaagccca ttgagcaggg ggcttgcatt gcaccccagc ctgacagcct 300

ggcatcttgg gataaaagca gcacagcccc ctaggggctg cccttgctgt gtggcgccac 360

cggcggtgga gaacaaggct ctattcagcc tgtgcccagg aaaggggatc aggggatgcc 420

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ccctcaggct atgccagggg gtgttgccag gggcacccgg gcatcgccag tctagcccac 600

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cgcatcacct ccgctgctcg c 681

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 15

caggacacaa ggcctgttac tagcactcac atggaacaaa tggcc 45

<210> 16

<211> 7071

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 16

tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 60

acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 120

aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 180

gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca 240

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agcagattgt actgagagtg caccataaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg 420

cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata gaccgaaatc ggcaaaatcc 480

cttataaatc aaaagaatag cccgagatag agttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga 540

gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg 600

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cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggttcctgc ggccagatct tcaatattgg 1080

ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta ttggccattg 1140

catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc aatatgaccg 1200

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catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 1320

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gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 1500

cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg gcagtacatc 1560

tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc 1620

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gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag 1740

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cgcccgcccc ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct 1980

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gccgggggcg gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg 2280

ggtgtgtgcg tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc 2340

ctgcaccccc ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg 2400

gggcgtggcg cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc 2460

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cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattcgat 2940

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ggattacctg cttggctgct agagaaagag tctattcttc tccgctcctc cgacccagat 3420

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tatcagaatg gagggccagt tataacagtg caggttgaaa atgaatatgg cagctacttt 3540

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gatgtggttc tgtttaccac tgatggagca cataaaacat tcctgaaatg tggggccctg 3660

cagggcctct acaccacggt ggactttgga acaggcagca acatcacaga tgctttccta 3720

agccagagga agtgtgagcc caaaggaccc ttgatcaatt ctgaattcta tactggctgg 3780

ctagatcact ggggccaacc tcactccaca atcaagaccg aagcagtggc ttcctccctc 3840

tatgatatac ttgcccgtgg ggcgagtgtg aacttgtaca tgtttatagg tgggaccaat 3900

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gatgccccac tgagtgaggc tggggacctc actgagaagt attttgctct gcgaaacatc 4020

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gaccttctgg tagagaacat gggacgtgtg aactatggtg catatatcaa cgattttaag 4440

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ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 6360

gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 6420

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ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 6660

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ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 6900

aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 6960

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<220>

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gcagattgta ctgagagtgc accataaaat tgtaaacgtt aatattttgt taaaattcgc 420

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agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc 840

gtactatggt tgctttgacg tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 900

taccgcatca ggcgcccctg caggcagctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg 960

gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 1020

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc 3240

ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt 3300

agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg 3360

ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac 3420

gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta 3480

ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat 3540

ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg cttacaattt cctgatgcgg 3600

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca 3660

atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 3720

ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 3780

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gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt 3900

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aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 4020

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cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 4140

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ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg 5220

tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 5280

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agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 5460

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ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 5580

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cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 5760

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aggctgcagg gggggggggg gggggggggt gggggggggg gggggggg 5928

<210> 20

<211> 529

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 20

Met Thr Ser Ser Arg Leu Trp Phe Ser Leu Leu Leu Ala Ala Ala Phe

1 5 10 15

Ala Gly Arg Ala Thr Ala Leu Trp Pro Trp Pro Gln Asn Phe Gln Thr

20 25 30

Ser Asp Gln Arg Tyr Val Leu Tyr Pro Asn Asn Phe Gln Phe Gln Tyr

35 40 45

Asp Val Ser Ser Ala Ala Gln Pro Gly Cys Ser Val Leu Asp Glu Ala

50 55 60

Phe Gln Arg Tyr Arg Asp Leu Leu Phe Gly Ser Gly Ser Trp Pro Arg

65 70 75 80

Pro Tyr Leu Thr Gly Lys Arg His Thr Leu Glu Lys Asn Val Leu Val

85 90 95

Val Ser Val Val Thr Pro Gly Cys Asn Gln Leu Pro Thr Leu Glu Ser

100 105 110

Val Glu Asn Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Asp Asp Gln Cys Leu Leu Leu

115 120 125

Ser Glu Thr Val Trp Gly Ala Leu Arg Gly Leu Glu Thr Phe Ser Gln

130 135 140

Leu Val Trp Lys Ser Ala Glu Gly Thr Phe Phe Ile Asn Lys Thr Glu

145 150 155 160

Ile Glu Asp Phe Pro Arg Phe Pro His Arg Gly Leu Leu Leu Asp Thr

165 170 175

Ser Arg His Tyr Leu Pro Leu Ser Ser Ile Leu Asp Thr Leu Asp Val

180 185 190

Met Ala Tyr Asn Lys Leu Asn Val Phe His Trp His Leu Val Asp Asp

195 200 205

Pro Ser Phe Pro Tyr Glu Ser Phe Thr Phe Pro Glu Leu Met Arg Lys

210 215 220

Gly Ser Tyr Asn Pro Val Thr His Ile Tyr Thr Ala Gln Asp Val Lys

225 230 235 240

Glu Val Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Ile Arg Val Leu Ala Glu

245 250 255

Phe Asp Thr Pro Gly His Thr Leu Ser Trp Gly Pro Gly Ile Pro Gly

260 265 270

Leu Leu Thr Pro Cys Tyr Ser Gly Ser Glu Pro Ser Gly Thr Phe Gly

275 280 285

Pro Val Asn Pro Ser Leu Asn Asn Thr Tyr Glu Phe Met Ser Thr Phe

290 295 300

Phe Leu Glu Val Ser Ser Val Phe Pro Asp Phe Tyr Leu His Leu Gly

305 310 315 320

Gly Asp Glu Val Asp Phe Thr Cys Trp Lys Ser Asn Pro Glu Ile Gln

325 330 335

Asp Phe Met Arg Lys Lys Gly Phe Gly Glu Asp Phe Lys Gln Leu Glu

340 345 350

Ser Phe Tyr Ile Gln Thr Leu Leu Asp Ile Val Ser Ser Tyr Gly Lys

355 360 365

Gly Tyr Val Val Trp Gln Glu Val Phe Asp Asn Lys Val Lys Ile Gln

370 375 380

Pro Asp Thr Ile Ile Gln Val Trp Arg Glu Asp Ile Pro Val Asn Tyr

385 390 395 400

Met Lys Glu Leu Glu Leu Val Thr Lys Ala Gly Phe Arg Ala Leu Leu

405 410 415

Ser Ala Pro Trp Tyr Leu Asn Arg Ile Ser Tyr Gly Pro Asp Trp Lys

420 425 430

Asp Phe Tyr Ile Val Glu Pro Leu Ala Phe Glu Gly Thr Pro Glu Gln

435 440 445

Lys Ala Leu Val Ile Gly Gly Glu Ala Cys Met Trp Gly Glu Tyr Val

450 455 460

Asp Asn Thr Asn Leu Val Pro Arg Leu Trp Pro Arg Ala Gly Ala Val

465 470 475 480

Ala Glu Arg Leu Trp Ser Asn Lys Leu Thr Ser Asp Leu Thr Phe Ala

485 490 495

Tyr Glu Arg Leu Ser His Phe Arg Cys Glu Leu Leu Arg Arg Gly Val

500 505 510

Gln Ala Gln Pro Leu Asn Val Gly Phe Cys Glu Gln Glu Phe Glu Gln

515 520 525

Thr

<210> 21

<211> 556

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 21

Met Glu Leu Cys Gly Leu Gly Leu Pro Arg Pro Pro Met Leu Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Thr Leu Leu Ala Ala Met Leu Ala Leu Leu Thr Gln

20 25 30

Val Ala Leu Val Val Gln Val Ala Glu Ala Ala Arg Ala Pro Ser Val

35 40 45

Ser Ala Lys Pro Gly Pro Ala Leu Trp Pro Leu Pro Leu Ser Val Lys

50 55 60

Met Thr Pro Asn Leu Leu His Leu Ala Pro Glu Asn Phe Tyr Ile Ser

65 70 75 80

His Ser Pro Asn Ser Thr Ala Gly Pro Ser Cys Thr Leu Leu Glu Glu

85 90 95

Ala Phe Arg Arg Tyr His Gly Tyr Ile Phe Gly Phe Tyr Lys Trp His

100 105 110

His Glu Pro Ala Glu Phe Gln Ala Lys Thr Gln Val Gln Gln Leu Leu

115 120 125

Val Ser Ile Thr Leu Gln Ser Glu Cys Asp Ala Phe Pro Asn Ile Ser

130 135 140

Ser Asp Glu Ser Tyr Thr Leu Leu Val Lys Glu Pro Val Ala Val Leu

145 150 155 160

Lys Ala Asn Arg Val Trp Gly Ala Leu Arg Gly Leu Glu Thr Phe Ser

165 170 175

Gln Leu Val Tyr Gln Asp Ser Tyr Gly Thr Phe Thr Ile Asn Glu Ser

180 185 190

Thr Ile Ile Asp Ser Pro Arg Phe Ser His Arg Gly Ile Leu Ile Asp

195 200 205

Thr Ser Arg His Tyr Leu Pro Val Lys Ile Ile Leu Lys Thr Leu Asp

210 215 220

Ala Met Ala Phe Asn Lys Phe Asn Val Leu His Trp His Ile Val Asp

225 230 235 240

Asp Gln Ser Phe Pro Tyr Gln Ser Ile Thr Phe Pro Glu Leu Ser Asn

245 250 255

Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Ser His Val Tyr Thr Pro Asn Asp Val Arg

260 265 270

Met Val Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Ile Arg Val Leu Pro Glu

275 280 285

Phe Asp Thr Pro Gly His Thr Leu Ser Trp Gly Lys Gly Gln Lys Asp

290 295 300

Leu Leu Thr Pro Cys Tyr Ser Arg Gln Asn Lys Leu Asp Ser Phe Gly

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Pro Ile Asn Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Ser Phe Leu Thr Thr Phe

325 330 335

Phe Lys Glu Ile Ser Glu Val Phe Pro Asp Gln Phe Ile His Leu Gly

340 345 350

Gly Asp Glu Val Glu Phe Lys Cys Trp Glu Ser Asn Pro Lys Ile Gln

355 360 365

Asp Phe Met Arg Gln Lys Gly Phe Gly Thr Asp Phe Lys Lys Leu Glu

370 375 380

Ser Phe Tyr Ile Gln Lys Val Leu Asp Ile Ile Ala Thr Ile Asn Lys

385 390 395 400

Gly Ser Ile Val Trp Gln Glu Val Phe Asp Asp Lys Ala Lys Leu Ala

405 410 415

Pro Gly Thr Ile Val Glu Val Trp Lys Asp Ser Ala Tyr Pro Glu Glu

420 425 430

Leu Ser Arg Val Thr Ala Ser Gly Phe Pro Val Ile Leu Ser Ala Pro

435 440 445

Trp Tyr Leu Asp Leu Ile Ser Tyr Gly Gln Asp Trp Arg Lys Tyr Tyr

450 455 460

Lys Val Glu Pro Leu Asp Phe Gly Gly Thr Gln Lys Gln Lys Gln Leu

465 470 475 480

Phe Ile Gly Gly Glu Ala Cys Leu Trp Gly Glu Tyr Val Asp Ala Thr

485 490 495

Asn Leu Thr Pro Arg Leu Trp Pro Arg Ala Ser Ala Val Gly Glu Arg

500 505 510

Leu Trp Ser Ser Lys Asp Val Arg Asp Met Asp Asp Ala Tyr Asp Arg

515 520 525

Leu Thr Arg His Arg Cys Arg Met Val Glu Arg Gly Ile Ala Ala Gln

530 535 540

Pro Leu Tyr Ala Gly Tyr Cys Asn His Glu Asn Met

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<210> 22

<211> 260

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 22

ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat 60

ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 120

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<210> 23

<211> 7071

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 23

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccaga tcttcaatat tggccattag ccatattatt 180

cattggttat atagcataaa tcaatattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatctata 240

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attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 360

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tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 600

ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 660

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gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg 1020

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ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttgaggg 1140

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cctgcgcttc ctgcagaagc gctttcgcca ccatctgggg gatgatgtgg ttctgtttac 2700

cactgatgga gcacataaaa cattcctgaa atgtggggcc ctgcagggcc tctacaccac 2760

ggtggacttt ggaacaggca gcaacatcac agatgctttc ctaagccaga ggaagtgtga 2820

gcccaaagga cccttgatca attctgaatt ctatactggc tggctagatc actggggcca 2880

acctcactcc acaatcaaga ccgaagcagt ggcttcctcc ctctatgata tacttgcccg 2940

tggggcgagt gtgaacttgt acatgtttat aggtgggacc aattttgcct attggaatgg 3000

ggccaactca ccctatgcag cacagcccac cagctacgac tatgatgccc cactgagtga 3060

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gactctcagt tccaatatcc tcacggactg gacgatcttt ccactggaca ctgaggatgc 3600

agtgcgcagc cacctggggg gctggggaca ccgtgacagt ggccaccatg atgaagcctg 3660

ggcccacaac tcatccaact acacgctccc ggccttttat atggggaact tctccattcc 3720

cagtgggatc ccagacttgc cccaggacac ctttatccag tttcctggat ggaccaaggg 3780

ccaggtctgg attaatggct ttaaccttgg ccgctattgg ccagcccggg gccctcagtt 3840

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aagactcatg cccccacccc cgcaaaaaaa caaagattca tggctggacc atgtatgact 4080

cgagtttttt tttgcggccg cttcgagcag acatgataag atacattgat gagtttggac 4140

aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg 4200

ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt 4260

ttatgtttca ggttcagggg gagatgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca 4320

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gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 5040

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 5100

acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 5160

cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 5220

acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 5280

acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 5340

tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 5400

ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 5460

ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 5520

tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 5580

aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 5640

ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 5700

ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 5760

gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 5820

gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 5880

cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 5940

actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 6000

ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 6060

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ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 6180

agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 6240

aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc 6300

attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg 6360

cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct 6420

tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc 6480

gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 6540

aaaattgtaa acgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca 6600

ttttttaacc aatagaccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagcccgag 6660

atagagttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc 6720

aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc 6780

aaatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc 6840

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acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtact atggttgctt tgacgtatgc 7020

ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc c 7071