用于治疗EBV相关性癌症的抗LMP2 TCR-T细胞疗法

优先权

本申请要求2018年11月27日提交的美国临时申请序列号62/771,653的权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

发明领域

本公开提供了治疗癌症的方法。更具体地说，本公开提供了包含T细胞的组合物，所述T细胞包含特异性针对潜伏性膜蛋白2(LMP2)的工程化T细胞受体(TCR)，和制备和使用所述TCR的方法，以及包含靶向LMP2抗原的TCR的组合物。

相关技术的描述

T细胞受体工程化T细胞疗法是一种类型的过继性T细胞免疫疗法，其通过基因修饰T细胞来治疗癌症。T细胞受体工程化T细胞疗法已显示出治疗实体瘤的希望。一种实体瘤类型，鼻咽癌(NPC)，在华南和东南亚非常普遍，且对晚期疾病的治疗选择很少。尽管当前的标准疗法受到非特异性毒性的限制，但是NPC常常与爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染相关，这使其成为过继性免疫疗法的优秀靶点。

爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)潜伏性膜蛋白2(LMP2)是爱泼斯坦-巴尔病毒的病毒蛋白。LMP2抗原是潜在的TCR T细胞靶点，因此对包含LMP2抗原的细胞的靶向清除可能具有强健的抗肿瘤性质，并且对正常细胞的毒性有限。

发明内容

提供发明内容以介绍一些选择的概念，这些概念将在下文的具体实施方式中进一步描述。本发明内容并非旨在确定所要求保护的主题的关键或必要特征，也并非旨在用于帮助限制所要求保护的主题的范围。

TCR T细胞疗法是一种类型的治疗，在所述治疗中，分离并修饰T细胞，从而，修饰的T细胞将攻击癌细胞。工程化分离的T细胞以表达特异性地识别患者的癌细胞上的LMP2的TCR。在实验室中培养大量的TCR T细胞并将其给予患者(通常通过输注)。发明人已经用抗原特异性重定向的T细胞实施了新一代免疫细胞疗法以缩短产生可用于免疫疗法中的T细胞群体所需的时间。

在一个方面中，本公开提供了一种T细胞的群体，其包含工程化T细胞受体(TCR)，其中所述工程化TCR响应于潜伏性膜蛋白2(LMP2)抗原而激活T细胞。在某些实施方式中，所述工程化TCR包含SEQ ID NO:03的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述工程化TCR包含SEQID NO:09的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述LMP2抗原包含SSCSSCPLSK(SEQ ID NO:01)的序列。

在某些实施方式中，所述T细胞的群体包含治疗有效量的细胞，所述细胞用于在受试者中治疗包含LMP2的癌症。在一些实施方式中，所述受试者表达人白细胞抗原亚型A11(HLA-A11)。

在某些实施方式中，所述T细胞的群体中的至少一部分产生或有潜力产生一种或多种细胞因子。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞因子选自IL-2、IFN-γ、TNF-α、颗粒酶A、颗粒酶B和GM-CSF。

在某些实施方式中，所述癌症选自鼻咽癌(NPC)、淋巴瘤、胃癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和白血病。在一些实施方式中，所述癌症是EBV相关性癌症。在某些实施方式中，所述癌症是鼻咽癌(NPC)。在某些实施方式中，所述癌症是淋巴瘤。在某些实施方式中，所述癌症是胃癌。

在另一个方面中，本公开提供了一种药物组合物，其包含如本文所公开的T细胞群体，和药学上可接受的载体。在某些实施方式中，所述药学上可接受的载体支持用于治疗包含LMP2的癌症的治疗有效量的细胞的维持。在一些实施方式中，所述药物组合物进一步包含至少一种治疗剂。

在又一个方面中，本公开提供了一种治疗患有包含LMP2的癌症的受试者的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所公开的T细胞的群体或如本文所公开的药物组合物，其中所述施用诱导对所述癌症的抗肿瘤应答。在某些实施方式中，所述癌症选自鼻咽癌(NPC)、淋巴瘤、胃癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和白血病。在某些实施方式中，所述癌症是EBV相关性癌症。在某些实施方式中，所述癌症是鼻咽癌(NPC)。在某些实施方式中，所述癌症是淋巴瘤。在某些实施方式中，所述癌症是胃癌。在某些实施方式中，所述抗肿瘤应答导致肿瘤体积减小至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。

在另一个方面中，本公开提供了一种分离的核酸，其包含编码工程化TCR的多核苷酸，所述工程化TCR包含SEQ ID NO:03的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:08的核酸序列。

在另一个方面中，本公开提供了一种分离的核酸，其包含编码工程化TCR的多核苷酸，所述工程化TCR包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:14的核酸序列。

在又一个方面中，本公开提供了载体，其包含如本文所公开的核酸。在某些实施方式中，所述载体选自质粒，粘粒，人工染色体(如酵母人工染色体(YAC)或细菌人工染色体(BAC))和病毒(如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和疱疹病毒)。

在一个方面中，本公开提供了一种制备T细胞的群体的方法，其中所述方法包括：(1)使用如本文所公开的分离的核酸或载体转染或转导分离的T细胞；和(2)在转染或转导之后扩增所述T细胞，其中通过在由人工APC呈递的抗CD3、抗CD3/抗CD28或LMP蛋白的存在下培养来扩增所述T细胞。在某些实施方式中，所述分离的T细胞是从人中分离的。在某些实施方式中，所述人是患有包含LMP2的癌症的受试者。在某些实施方式中，患有所述包含LMP2的癌症的所述受试者表达人白细胞抗原亚型A11(HLA-A11)。

在另一个方面中，本公开提供了一种在有需要的患者中抑制包含潜伏性膜蛋白2(LMP2)抗原的肿瘤的生长的方法，其中所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的T细胞的群体，所述T细胞的群体包含工程化T细胞受体(TCR)，所述工程化TCR具有TCRα链和TCRβ链，所述TCRα链具有SEQ ID NO:4或10的序列，并且所述TCRβ链具有SEQ ID NO:6或12的序列，并且其中包含所述LMP2抗原的所述肿瘤的生长被抑制。在某些实施方式中，所述肿瘤包含人白细胞抗原亚型A11(HLA-A11)。在某些实施方式中，所述肿瘤来自EBV相关性癌症。在某些实施方式中，所述癌症是鼻咽癌、淋巴瘤或胃癌。

在某些实施方式中，所述工程化TCR包含SEQ ID NO:4的所述TCRα链和SEQ ID NO:6的所述TCRβ链。在某些实施方式中，所述TCRα链包含CDR3α，所述CDR3α包含序列AVVNNNDMRFG(SEQ ID NO:5)，并且所述TCRβ链包含CDR3β，所述CDR3β包含序列ASSPGRWYEQF(SEQ ID NO:7)。

在某些实施方式中，所述工程化TCR包含SEQ ID NO:10的所述TCRα链和SEQ IDNO:12的所述TCRβ链。在某些实施方式中，所述TCRα链包含CDR3α，所述CDR3α包含序列AVLNNNDMRFG(SEQ ID NO:11)，并且所述TCRβ链包含CDR3β，所述CDR3β包含序列ASSQGRWYEAF(SEQ ID NO:13)。

在又一个方面中，本公开提供了一种工程化T细胞受体(TCR)，其中所述TCR包含与SEQ ID NO:03中所示的序列共享至少90％序列同一性的氨基酸。在某些实施方式中，所述TCR包含SEQ ID NO:4的TCRα链和SEQ ID NO:6的TCRβ链。在某些实施方式中，所述TCRα链包含CDR3α，所述CDR3α包含序列AVVNNNDMRFG(SEQ ID NO:5)，并且所述TCRβ链包含CDR3β，所述CDR3β包含序列ASSPGRWYEQF(SEQ ID NO:7)。

在又一个方面中，本公开提供了一种工程化T细胞受体(TCR)，其中所述TCR包含与SEQ ID NO:09中所示的序列共享至少90％序列同一性的氨基酸。在某些实施方式中，所述TCR包含SEQ ID NO:10的TCRα链和SEQ ID NO:12的所述TCRβ链。在某些实施方式中，所述TCRα链包含CDR3α，所述CDR3α包含序列AVLNNNDMRFG(SEQ ID NO:11)，并且所述TCRβ链包含CDR3β，所述CDR3β包含序列ASSQGRWYEAF(SEQ ID NO:13)。

在某些实施方式中，如本文所公开的工程化TCR特异性地结合至LMP2抗原。在某些实施方式中，所述LMP2抗原包含SSCSSCPLSK(SEQ ID NO:1)。

在一个方面中，本公开提供了一种药物组合物，其包含表达如本文所公开的工程化TCR的T细胞的群体，和药学上可接受的载体。

在另一个方面中，本公开提供了一种在患有包含LMP2的癌症的受试者中诱导T细胞应答的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如本文所公开的工程化TCR的T细胞的群体或如本文所公开的药物组合物，其中所述施用诱导对所述癌症的抗肿瘤应答。在某些实施方式中，所述癌症选自鼻咽癌(NPC)、淋巴瘤、胃癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和白血病。在某些实施方式中，所述癌症是EBV相关性癌症。在某些实施方式中，所述癌症是鼻咽癌(NPC)。在某些实施方式中，所述癌症是淋巴瘤。在某些实施方式中，所述癌症是胃癌。

本公开的另一个方面提供了本文描述和说明的所有内容。

附图说明

结合附图，在本文的以下描述中解释了本公开的前述方面和其他特征：

图1A-1B是显示候选LMP2-A11 TCR的表达和活性的流式细胞术结果。(A)将候选TCR序列克隆至逆转录病毒载体中，所述逆转录病毒载体被转导至Jurkat细胞中，显示了TCRb阳性细胞的百分比。(B)将图1A中的Jurkat细胞系与Ramos淋巴瘤细胞共培养，所述Ramos淋巴瘤细胞被工程化以表达HLA-A11-LMP2肽接头。通过测量CD69的表达来定量T细胞激活。标识为TCR-NPC-A11-03的TCR被鉴定为是LMP2特异性的。

图2A-2B是显示候选LMP2-A11 TCR的表达和活性的流式细胞术结果。(A)将候选TCR序列克隆至逆转录病毒载体中，所述逆转录病毒载体被转导至Jurkat细胞中，显示了TCRb阳性细胞的百分比。(B)将1A中的Jurkat细胞系与Ramos淋巴瘤细胞共培养，所述Ramos淋巴瘤细胞被工程化以表达HLA-A11-LMP2肽接头。通过测量CD69的表达来定量T细胞激活。标识为TCR-NPC-A11-125的TCR被鉴定为是LMP2特异性的。

图3A-3B是显示LMP2-A11 TCR-T细胞的体外抗肿瘤活性的图。将被工程化以表达TCR-NPC-A11-03(A)或TCR-NPC-A11-125(B)的PBMC与表达连接至HLA-A11或HLA-A24的LMP2肽的Ramos细胞的混合群体共培养。竞争性杀伤百分比是以(1-A11:A24)x 100计算的。

图4A-4C是显示LMP2-A11 TCR-T细胞的体内抗肿瘤活性的图。将Ramos(A11)淋巴瘤细胞(5x10

图5A-5E是首个非人Ad5f35-LMP1-2腺病毒载体转导的DC疫苗试验的图和示意图显示(A)和Kaplan-Meier存活分析(B)。在16名接受治疗的晚期NPC患者中，DC疫苗疗法使2名患者(12.5％)病情稳定>18周并使1名患者获得部分缓解。(C-E)显示扩增EBV的T细胞疗法试验的示意图(C)、患者样品采集程序(D)和Kaplan-Meier存活分析。根据本公开的一个实施方式，这项针对晚期NPC的II期临床试验(其将化学疗法与过继性EBV-特异性T细胞疗法联合)达到了71.4％的缓解率，其中3例完全缓解和22例部分缓解。

图6A-6B是显示用于分析肿瘤抗原特异性TCR的实验性和计算机平台的图和图像。(A)在肿瘤抗原刺激的增殖之后，将来自患者的PBMC等分以用于直接库测序或TCR分析。对这两个数据集进行了基序分析，该分析基于其基序相似性无偏倚地将TCR聚类。以这种方式，即使具有不同TCR序列，也可以将识别来自未刺激库的待测肿瘤抗原的TRC与具有已知肿瘤抗原特异性的TCR连接。(B)对来自具有共同基序的特定聚类的肿瘤抗原特异性TCR的多样性和频率进行定量。通过此程序以及从BMS CheckMate 143试验收集的纵向样本，我们监测可接受抗PD-1或抗PD-1加CTLA4治疗的胶质母细胞瘤患者T细胞克隆扩增的动力学。将EGFR表位用作肿瘤相关抗原的代表，而CMV pp65表位代表外源性抗原。

图7A-7D是显示PEPCMV-HLA-A2-特异性TCR克隆和TCR-T验证的图和流式细胞术分析。进行单一T细胞RNASeq以克隆识别由HLA-A2供体呈递的CMVpp65表位的TCR。(A)克隆的TCRα和β链的V区段使用。(B)由逆转录病毒转导产生的人TCR-T细胞。(C)CMVpp65-TCR-T细胞的抗原特异性激活。左图，未刺激；右图，抗原刺激。将CD107作为抗原诱导的去颗粒作用的标志物，其是T细胞介导的细胞溶解的关键步骤。(D)A2-P8-036 TCR-T的抗原特异性杀伤。将小鼠OT-1转基因T细胞用作阳性对照；将未负载CMVpp65肽抗原的靶细胞用作阴性对照。

具体实施方式

为了促进对本公开的原理的理解的目的，现将参考优选实施方式，并且将使用特定语言来描述它们。然而，将理解的是，由此并非意图限制本公开的范围，如本文所说明的，本公开的这种改变和进一步的修改是本公开所涉及的领域的技术人员通常会想到的。

在本文中使用的冠词“一个/种(a/an)”指该冠词的语法指代物中的一个或多个(即至少一个)。举例来说，“一个要素”是指至少一个要素并且可以包括一个以上的要素。

术语“约”用于为数值范围端点提供灵活性，所述灵活性是通过提出给定值可以“稍微高于”或“稍微低于”所述端点而不会影响所需结果来提供的。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则术语“包含(comprise)”和“包括(include)”以及变体(例如“包含(comprises/comprising)”、“包括(includes/including)”)将被理解为暗示包含所述组分、特征、元件或步骤，或者组分、特征、要素或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。列举为“包括(including)”、“包含(comprising)”或“具有(having)”某些要素的实施方式也被认为是“基本上由某些要素组成”和“由那些要素组成”。

除非在此另外指出，否则本文中数值范围的列举仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，就如同其在本文中被单独叙述一样。例如，如果将浓度范围规定为1％至50％，则旨在指在本说明书中明确列举了诸如2％至40％、10％至30％或％至3％等的值。这些仅是具体意图的示例，并且在所列举的最小值和最大值之间并包括所列举的最小值和最大值的数值的所有可能组合应被认为在本公开中明确地陈述。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语具有与本公开所述领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

定义

如本文所用，“治疗(treat/treatment)”、“疗法(therapy)”和/或“治疗方案(therapy regimen)”是指响应于由患者表现出的或患者可能易感的疾病、病症或生理状况而进行的临床干预。治疗的目的包括减轻或预防症状、减慢或停止疾病、病症或病况的进展或恶化和/或缓解疾病、病症或病况。

术语“有效量”或“治疗有效量”指足以产生有益或期望的生物学和/或临床结果的量。“有效量”或“治疗有效量”可以由卫生专业技术团队来确定，并且可以包括使用成像测试、生物标志物测试和其他测试。关于癌症，施用治疗有效量可预防癌症的转移，导致实体瘤的尺寸或质量减小，或者抑制癌症的增殖或生长，或者导致肿瘤坏死。

如本文所用，术语“疾病”包括但不限于影响生物体的一部分的结构或功能的任何异常状况和/或病况。其可能是由外部因素(如感染性疾病)引起的，或者是由内部功能异常(如癌症、癌症转移等)引起的。

如本领域公知的，癌症通常被认为是不受控制的细胞生长。本发明的组合物和方法可以用于治疗表达LMP2的任何癌症及其任何转移。实例包括但不限于鼻咽癌(NPC)、淋巴瘤、胃癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和白血病。在某些实施方式中，所述癌症是鼻咽癌。在一些实施方式中，所述癌症是淋巴瘤。在一些实施方式中，所述癌症是胃癌。在某些实施方式中，所述癌症是EBV相关性癌症或EBV阳性癌症，例如EBV阳性霍奇金氏淋巴瘤、EBV阳性伯基特氏淋巴瘤、EBV阳性鼻咽癌或EBV阳性胃癌。

鼻咽癌(NPC)是一种与遗传和环境因素相关的多因素恶性肿瘤(例如，已经牵涉到爱泼斯坦-巴尔病毒)。病毒的影响与爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV；也被称为人类疱疹病毒4)的感染相关，并且EBV是最常见的病毒之一(例如，到30-40岁时，在美国大约95％的人已经感染过这种病毒)。因此，东南亚人特别是广东华裔人中NPC的发病率高，表明有很强的遗传因素会诱发疾病的进展。在高发地区，NPC在家族中聚集，这表明地理和遗传因素都可能影响疾病风险。可以通过手术、化学疗法或放射疗法对NPC进行治疗。放射疗法有多种形式，包括3D适形(conformal)放射疗法、强度调控放射疗法、粒子束疗法和近距离疗法，其常用于治疗头颈部癌症。如本文所公开的在未分化鼻咽癌中表达EBV潜在蛋白可能有潜力开发成基于免疫的疗法。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”在本文中可以互换使用，并且指人和非人动物两者。本公开的术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、犬、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。在某些实施方式中，所述受试者是疑似患有癌症、患有癌症或患有癌症的人类患者。在一个实施方式中，所述人是疑似患有包含LMP2的癌症的受试者。在另一个实施方式中，所述人是患有包含LMP2的癌症的受试者。在又一个实施方式中，所述人是患有包含LMP2的癌症的受试者。在某些实施方式中，所述受试者是患有与LMP2相关的癌症的人。在某些实施方式中，所述受试者是患有EBV相关性癌症的人。在某些实施方式中，所述患者是EBV血清阳性的。在某些实施方式中，所述LMP2抗原与具有人白细胞抗原亚型A11(HLA-A11)的MHC I类分子复合。

如本文所用，术语“潜伏性膜蛋白2”和“LMP2”指EBV抗原潜伏性膜蛋白2(LMP2)。LMP2在很多EBV相关性癌症中表达。在某些实施方式中，LMP2抗原与具有人白细胞抗原亚型A11(HLA-A11)的MHC I类分子复合。LMP2可能存在两种亚型，LMP2A或LMP2B。LMP2A是具有三个结构域的EBV编码的蛋白：(a)N末端胞质结构域，其具有与含WW结构域的E3泛素连接酶结合的PY基序和与含SH2结构域的蛋白结合的ITAM，(b)具有12个跨膜区段的跨膜结构域，其将LMP2A定位在细胞膜中，和(c)27个氨基酸的C末端结构域，其介导LMP2蛋白亚型的同二聚化和异二聚化。LMP2B与LMP2A不同，其不含胞质信号传导结构域的N末端1-119个氨基酸。在一些实施方式中，LMP2抗原可以是来自SEQ ID NO:02的氨基酸序列的片段。在一些实施方式中，LMP2抗原可以是SSCSSCPLSK(SEQ ID NO:01)

>sp|P13285|LMP2_EBVB9潜伏性膜蛋白2

术语“T细胞受体”或“TCR”或“工程化TCR”指在T细胞表面上存在的分子，其负责识别在抗原呈递细胞(APC)表面上展示的抗原。每个T细胞都表达独特的TCR，其是通过随机分类基因而产生的，从而确保T细胞可以对几乎任何感染做出反应。TCR还能够从细胞内部识别肿瘤特异性蛋白(抗原)。当肿瘤特异性蛋白(即LMP2)分解成片段时，其会与主要组织相容性复合物(MHC)一起出现在细胞表面。MHC I类分子呈递来源于细胞内部蛋白的肽抗原。可以对TCR进行工程化改造以识别肿瘤特异性蛋白片段/MHC组合。在某些实施方式中，LMP2抗原与具有人白细胞抗原亚型A11(HLA-A11)的MHC I类分子复合。TCR的结构式由包含α(α)链和β(β)链的两种不同蛋白链构成的。在某些实施方式中，与天然存在的序列相比，TCR可以具有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或修饰，只要所述TCR在转染的T细胞中保持其形成TCR的能力和保持识别LMP2抗原的能力，以及参与免疫学相关的细胞因子信号传导即可。工程化TCR优选地还以高亲和力与呈现出相关的肿瘤相关肽的靶细胞结合，以及任选地介导对呈递相关抗原(LMP2)的靶细胞的有效杀伤。异二聚体TCR蛋白通常由高度可变的α链和β链组成，表达为与不变的CD3链分子的复合物的一部分。TCR的α链和β链两者的可变结构域分别具有三个高可变或互补性决定区(CDR)。在一个实施方式中，TCR包含TCR-NPC-A11-003。在另一个实施方式中，TCR包含TCR-NPC-A11-125。

TCR A11-003序列：

TCR A11-003氨基酸(SEQ ID NO:03)

TCR A11-003可变α链氨基酸(SEQ ID NO:04)

TCR A11-003可变CDR3α氨基酸(SEQ ID NO:05)

TCR A11-003可变β链氨基酸(SEQ ID NO:06)

TCR A11-003可变CDR3β氨基酸(SEQ ID NO:07)

TCR A11-003核酸(SEQ ID NO:08)

TCR A11-125序列：

TCR A11-125氨基酸(SEQ ID NO:09)

TCR A11-125可变α链氨基酸(SEQ ID NO:10)

TCR A11-125可变CDR3α氨基酸(SEQ ID NO:11)

TCR A11-125可变β链氨基酸(SEQ ID NO:12)

TCR A11-125可变CDR3β氨基酸(SEQ ID NO:13)

TCR A11-125核酸(SEQ ID NO:14)

如本文所用，术语“TCR T细胞”指已通过分子生物学方法对其进行选择、分离和/或鉴定，以表达响应于目标抗原能够被激活的如本文所公开的工程化T细胞受体的T细胞或T细胞群体。在一些实施方式中，T细胞群体包含外周血单核细胞(PBMC)，其是具有圆形核的任何外周血细胞。PBMC可以包含淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)、单核细胞和粒细胞(中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)。在人类中，淋巴细胞占PBMC群的大部分，其次是单核细胞，而树突状细胞的百分比很小。在一些实施方式中，T细胞群体分离自PBMC。在一些实施方式中，可以在包含TCR的任何细胞上修饰TCR，所述细胞包括，例如，辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。在某些实施方式中，T细胞受体包含能够响应于LMP2抗原而激活的序列。在一个实施方式中，所述TCR包含TCR-NPC-A11-003。在另一个实施方式中，所述TCR包含TCR-NPC-A11-125。工程化和表达T细胞受体的技术包括但不限于生产TCR异二聚体，其包含连接各个亚基的天然二硫桥(Garboczi等，(1996),Nature 384(6605):134-41；Garboczi等，(1996),J Immunol 157(12):5403-10；Chang等，(1994),PNAS USA 91:11408-11412；Davodeau等，(1993),J.Biol.Chem.268(21):15455-15460；Golden等，(1997),J.Imm.Meth.206:163-169；美国专利号6,080,840)。

如本文所用，术语“抗原”或“Ag”定义为引起免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生，或特异性具有免疫功能的细胞的激活，或者这两者。技术人员将理解，任何大分子，包括实际上所有的蛋白或肽，都可以用作抗原。而且，本领域技术人员将理解抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，抗原可以产生或可以来源于生物学样品。此类生物学样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。在某些实施方式中，目标抗原包含LMP2蛋白的片段(SEQ ID NO:2)。在一些实施方式中，目标抗原包含SSCSSCPLSK(SEQ ID NO:1)。

如本文所用，当涉及抗体/抗原、TCR/表位、配体/受体、核酸/互补性核酸或其他结合对(例如细胞因子和细胞因子受体)时，术语“特异性结合”或“选择性结合”表示在蛋白和其他生物制品的异质群中存在蛋白的决定性结合反应。因此，在指定条件下，指定的TCR或其结合结构域与特定抗原结合，且不与样品中存在的其他蛋白大量结合。特别地，本文公开的工程化TCR选择性地识别或结合至优选地仅一个特异性表位(LMP2抗原)，并且优选地与另一表位没有或基本上没有交叉反应性，其中所述表位对于一种蛋白(LMP2)是独特的，使得抗原识别构建体与另一表位和另一蛋白没有或基本没有交叉反应性。特异性结合还可以指，例如，来源于抗体和预期方法的抗原结合位点的结合化合物、核酸配体、抗体或结合组合物与其靶点结合，其结合亲和力与任何其他结合化合物的亲和力相比，通常至少高于25％、更通常至少高于50％、最通常至少高于100％(2倍)、普遍至少高于10倍、更普遍至少高于20倍并且最普遍至少高于100倍。在某些实施方式中，工程化T细胞受体或者其衍生物或片段特异性结合LMP2抗原。TCR的衍生物或片段保留了亲本分子的抗原结合/识别能力，特别是其特异性和/或选择性。可通过CDR3区的存保留这种结合功能。

适用于人类、灵长类、哺乳动物、哺乳动物受试者、动物、兽医受试者、安慰剂受试者、研究受试者、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体的术语“施用”指但不限于将外源性配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物与受试者、细胞、组织、器官或生物流体等接触。“施用”还可以指，例如，治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂和实验方法。细胞的处理包括将试剂与细胞接触，以及将试剂与流体接触，其中流体与细胞接触。“施用”还可以包括例如，通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞对细胞的体外和体内处理。施用途径可以包括但不限于静脉内施用或输注技术。输注技术可以包括通过针头或导管施用激活的T细胞群体。通常地，输注指静脉内或皮下施用激活的T细胞群体。在某些实施方式中，激活的T细胞群体是全身施用的。在某些实施方式中，激活的T细胞群体是静脉内施用的(即通过静脉内(IV)注射)。优选的施用途径是腹腔内或静脉内。

TCR-T细胞

本公开部分地涉及TCR-T细胞来源的效应细胞的制备和在受体中的应用，所述效应细胞能够响应于目标抗原(例如，LMP2)而被激活。本公开的一个方面提供了一种TCR-T细胞来源的效应细胞群体，其包含表达T细胞受体(TCR)的T细胞群体、由其组成或基本上由其组成，所述TCR包含能够响应于LMP2抗原激活的序列。在一个实施方式中，所述TCR包含TCR-NPC-A11-003。在另一个实施方式中，所述TCR包含TCR-NPC-A11-125。

可以通过本领域公知的方法分离本文公开的方法中使用的T细胞，包括商业上可获得的分离方法。T细胞的来源包括但不限于外周血、脐带血、骨髓或其他造血细胞来源。可以采用多种技术来分离细胞以分离或富集所需的T细胞。此外，扩增T细胞的方法是本领域熟知的(参见，例如参见，例如，Cartellieri等，A Novel Ex Vivo Isolation andExpansion Procedure for Chimeric Antigen Receptor Engrafted Human T Cells,2014)。用于分离和扩增调节性T细胞的方法也是商业上可获得的(参见，例如，BDBiosciences,San Jose,Calif.；STEMCELL Technologies Inc.,Vancouver,Canada；eBioscience,San Diego,Calif.；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)。如本文所用，术语“扩增”指数量增加，如T细胞数量增加。在一个实施方式中，可以离体扩增T细胞，以增加相对于最初存在于培养物中的数量的数量。在另一个实施方式中，可以离体扩增T细胞，以增加相对在于培养物中其他细胞类型的数量的数量。如本文所用，术语“离体”指已经从活生物体(例如人)中移出并在所述生物体外繁殖(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)的细胞。在一些实施方式中，可以通过在存在IL-2的条件下培养扩增T细胞。在某些实施方式中，可以通过在存在抗CD3抗体和/或抗CD28抗体的条件下培养扩增T细胞。在一些实施方式中，可以通过在存在IL-2的条件下培养，以及在存在抗CD3抗体和/或抗CD28抗体的条件下培养扩增T细胞。

分离细胞的方法包括但不限于密度梯度离心、与改变细胞密度的颗粒偶联、使用抗体包被的磁珠进行磁分离、亲和力层析法；与单克隆抗体(mAb)结合或一起使用的细胞毒剂，包括但不限于，补体和细胞毒素，以及使用附着于固体基质(例如板或新品)的抗体淘选、淘析、流式细胞术或任何其他方便的技术。

分离的T细胞对于如本文所公开的治疗方法所施用的受试者可以是自体的或非自体的。从受试者中分离出自体细胞，向其施用包含工程化TCR的T细胞群体。在某些实施方式中，从受试者中分离出自体细胞，向其施用包含工程化TCR的分离的和扩增的细胞。在一些实施方式中，可以通过白细胞分离术获得细胞，其中从抽出的血液中选择性除去白细胞，进行重组，然后再回输到供体受试者中。或者，可以使用来自不是受试者的非自体供体的同种异体细胞。在非自体供体的情况下，如本领域众所周知的，对细胞进行分型并与人白细胞抗原(HLA)匹配以确定合适的相容性水平。在一个实施方式中，将T细胞群体与人白细胞抗原A11(HLA-A11)相匹配。对于自体和非自体细胞两者，可任选地将细胞冷冻保存直至准备使用本领域众所周知的方法用于遗传操作和/或施用于受试者。

因为细胞因子释放是T细胞激活和效能的必要结果，所以对于有效的基于TCR T细胞的疗法，优选至少一部分激活的T细胞产生一种或多种细胞因子或能够产生一种或多种细胞因子，如一种或多种选自以下的细胞因子：IL-2、TNF-α(α)、IFN-γ(γ)、颗粒酶A、颗粒酶B、GM-CSF、IL-1、IL-10和IL-1β。此外，T细胞群体的至少一部分群表达一种或多种选自以下的表面标志物：CD2、CD3、CD4、CD8、CD28、CTLA4、CD16/CD56、CD18、CD25、CD40配体(gp39)、CD69、MHC I类、MHC II类、CD54、LFA-1和VLA-4。

治疗组合物

本文所述的细胞组合物T细胞群体可以单独或与药学上可接受的载体组合以足以诱导适当的抗肿瘤应答的剂量施用给受试者。所述应答可以包括但不限于特异性免疫应答、非特异性免疫应答、特异性和非特异性应答、先天应答、初级免疫应答、适应性免疫、次级免疫应答、记忆免疫应答、免疫细胞激活、免疫细胞增殖、免疫细胞分化和细胞因子表达。

本公开提供了通过向受试者施用有效量的TCR T细胞群体在受试者中产生抗肿瘤免疫的方法。如本文所用，“有效量”指提供治疗性或预防性获益的量。TCR T细胞的有效量可以由医师根据年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定。通常可以指出，包含本文所述的包含抗LMP2工程化TCR的T细胞群体的药物组合物可以以10

可以一次施用一定剂量的T细胞群体来给予有效量的包含如本文所述的表达T细胞受体的T细胞群体的细胞组合物，但不限于一剂。因此，施用可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20剂或更多剂如本文所公开的表达工程化TCR的T细胞群体。在某些实施方式中，施用3剂。如果施用不止一剂，则施用这些剂的时间间隔可以是1分钟、2分钟、3、4、5、6、7、8、9、10分钟或更长时间，间隔是约1小时、2小时、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时等。在小时的上下文中，术语“约”指30分钟内正负任意时间间隔。施用这些剂的时间间隔也可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天或更长时间，及其任何组合。本发明不限于在时间上等距的给药间隔，还可以包括不等间隔的给药，如初免方案由在例如1天、4天、7天和25天施用组成。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”指当与包含工程化TCR的T细胞群体组合时允许T细胞群体保持生物学活性的任何物质。实例包括但不限于任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂如油/水乳剂、基于氨基酸的缓冲剂或碳酸氢盐缓冲溶液，以及各种类型的润湿剂。在某些实施方式中，当向受试者施用是，载体不会产生不利的、过敏的或其他不良反应。在一些实施方式中，包含载体的药物组合物不含热源以及其他可能对受试者有害的杂质。药学上可接受的载体可以包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等；其使用在本领域中是众所周知的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂对受体无毒，优选在所使用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐的抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如吐温、普朗尼克或聚乙二醇(PEG)。可以通过众所周知的常规方法配制包含此类载体的组合物(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990；和Remington,The Scienceand Practice of Pharmacy 21st Ed.Mack Publishing,2005)。可以根据给药方式选择载体和所使用的载体的量。

对于特定受试者/患者的“有效量”可以根据多种因素而变化，如所治疗的病况或癌症，患者的总体健康状态，施用途径和剂量以及副作用的严重程度。治疗和诊断方法的指南是可以获得的(参见，例如，Maynard等，(1996)A Handbook of SOPs for Good ClinicalPractice,Interpharm Press,Boca Raton,Fla.；Dent(2001)Good Laboratory and GoodClinical Practice,Urch Publ.,London,UK)。所要施用的细胞数的确定将由本领域技术人员进行，并且将部分地取决于癌症的程度和严重性，以及是否正在施用转染细胞以治疗现有癌症或预防癌症。根据本公开，本领域技术人员将会知晓包含含有工程化TCR的T细胞群体的药物组合物的制备。

本公开的表达工程化TCR的T细胞群体可以以一剂或多剂施用，其中每剂包含至少100个细胞/kg体重；至少1,000个细胞/kg体重；至少10,000个细胞/kg体重；至少100,000个细胞/kg体重；至少1,000,000个细胞/kg体重；至少10,000,000个细胞/kg体重；至少100,000,000个细胞/kg体重；至少1x 10

例如，可以使用1次/周、2次/周、3次/周、4次/周、5次/周、6次/周、7次/周、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次等的给药时间表。给药时间表包含给药的总时间，例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月，以及长达12个月或更长时间。

提供了上述给药时间表的周期。所述周期可以大约，例如，每7天；每14天；每21天；每28天；每35天；42天；每49天；每56天；每63天；每70天等重复一次。在周期之间可以出现非给药间隔，其中所述间隔可以是约，例如，7天；14天；21天；28天；35天；42天；49天；56天；63天；70天等。在本文中，术语“约”时指正负1天、正负2天、正负3天、正负4天、正负5天、正负6天或者正负7天。

根据本公开所述的TCR T细胞还可以与一种或多种另外的治疗剂一起施用。与另外的治疗剂共同施用的方法是本领域众所周知的(例如，Hardman等，(eds.)(2001)Goodmanand Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,10th ed.,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Poole and Peterson(eds.)(2001)Pharmacotherapeutics for AdvancedPractice:A Practical Approach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.；Chabnerand Longo(eds.)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.)。实例包括但不限于化学治疗剂、射线、抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂、NSAIDS、镇痛剂等。另外的治疗也可以包括不同的TCR-T效应物群。可以是受试者治疗方案的一部分的其他药剂是例如其他免疫疗法、检查点抑制剂、免疫-肿瘤药物、靶向剂、化学疗法和/或射线。可以用于与本公开的组合物联用的药剂/治疗方案的实例包括但不限于CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂、和/或PD-L1抑制剂、CSF-1R抑制剂、TLR激动剂、纳武单抗、派姆单抗、伊匹单抗、阿特朱单抗、阿仑单抗、阿维单抗、奥法木单抗、纳武单抗、派姆单抗、利妥昔单抗、德瓦鲁单抗、细胞因子疗法、干扰素、干扰素-α、白介素、白介素-2、树突状细胞疗法(例如，Sipuleucel-T)、CHOP、环磷酰胺、氟达拉滨、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春瑞滨、阿霉素、多西他赛、博来霉素、达卡巴嗪、芥子碱、普卡巴嗪、泼尼松龙、依托泊苷、顺铂、表柔比星、亚叶酸和奥沙利铂。本公开的T细胞群体组合物可以在一种或多种另外的治疗剂之前施用，与一种或多种另外的治疗剂同时施用，或者在一种或多种另外的治疗剂之后施用。

共同施用不必指在个体中同时施用，而是可以包括以数小时或者甚至数天、数周或更长时间的间隔施用，只要多种治疗剂的施用是单一治疗计划即可。共同施用可以包括在一种或多种另外的治疗剂之前、之后或同时施用本公开的TCR-T细胞群体。共同施用可以包括在另一种TCR T细胞群体之前、之后或同时施用本公开的TCR T细胞群体。在一个示例性的治疗时间表中，本公开的TCR T细胞群体(例如A11-003)可以作为多日方案中的初始剂量给予，而另一TCR T细胞群体(例如A11-125)在随后的施用天数给予；或者TCR T细胞(例如A11-125)作为多日方案中的初始剂量给予，而TCR T细胞群体(例如A11-003)在随后的施用天数给予。另一方面，A11-003 TCR T细胞和A-125TCR T细胞可以在多日方案中隔天施用。这并不意味着可能的施用方案的限制列表。

治疗剂的有效量是通常将癌症的症状减少或减轻至少10％、更通常至少20％、最通常至少30％，通常至少40％、更通常至少50％、最通常至少60％、通常至少70％、通常至少80％和最通常至少90％、常规至少95％、更常规至少99％和最常规至少99.9％。例如，与对照或使用其他癌症质粒质粒的患者，或者治疗前的同一患者相比，施用如本文所公开的包含工程化TCR的T细胞群体减少肿瘤生长约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％，持续约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周、约4周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约1年、约2年、约5年或约10年或更长时间。

为了进行保存，可以制备治疗剂的制剂，其通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，并形成例如，冻干粉剂、浆剂、水溶液或混悬液的剂型(参见，例如，Hardman等，(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,N.Y.；Avis等(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.)。

制备的方法

本公开提供了一种制备如本文所公开的表达工程化T细胞受体(TCR)的T细胞群体的方法，其中所述方法包括：(1)使用编码如本文所公开的工程化TCR的核酸转染或转导分离的T细胞；和(2)在转染或转导后扩增所述表达工程化TCR的T细胞，其中通过在存在IL-2和/或CD3和CD38抗体的条件下培养扩增所述T细胞。在某些实施方式中，在存在IL-2的条件下培养扩增T细胞。在某些实施方式中，在存在抗CD3抗体的条件下培养扩增T细胞。在某些实施方式中，在存在抗CD28抗体的条件下培养扩增T细胞。在某些实施方式中，制备包含工程化TCR的T细胞群体的方法耗费约2周、约3周或约4周。在某些实施方式中，制备包含工程化TCR的T细胞群体的方法耗费小于2周、小于3周或小于4周。在某些实施方式中，在存在IL-2、抗CD3抗体和抗CD28抗体的条件下培养扩增T细胞。在某些实施方式中，分离的T细胞是从人中分离的。在一个实施方式中，哺乳动物是人。在某些实施方式中，人是患有表达来自EBV的LMP2的癌症的受试者。在所述方法的一个实施方式中，分离的T细胞包含HLA-A11。

将核酸引入T细胞的方法包括物理、生物和化学方法。用于将多核苷酸(如DNA或RNA)引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、lipofection、粒子轰击、显微注射或电穿孔。可以使用商业上可获得的方法将核酸引入靶细胞，所述方法包括电穿孔，或使用lipofection的阳离子脂质体介导的转染，或使用聚合物包封，使用肽介导的转让，或使用生物弹粒子递送系统，如基因枪。用于将核酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，被广泛用于将核酸插入人细胞。其他病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒。载体的实例是质粒、自主复制序列和转座元件。其他示例性实例可以包括但不限于，质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、细菌噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒。用作载体的动物病毒的实例可以包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。在某些实施方式中，包含TCR的载体可以是逆转录病毒载体。

本公开的又一个方面提供了一种制备TCR-T细胞衍生的效应细胞群体的方法，所述细胞群体包含表达T细胞受体(TCR)的激活的T细胞群体，所述TCR包含能够响应于LMP2抗原激活的序列，所述方法包括，由以下组成或基本上由以下组成：在体外接触一种或多种外周血单核细胞(PBMC)，所述PBMC用于治疗一个或多个患有目标癌症(例如，NPC)的患者；使用表达目标抗原(例如，LMP2)的树突状细胞刺激T细胞；分离和表征那些对所述目标抗原产生应答的T细胞；和扩增T细胞群体。在一些实施方式中，所述方法还包括向患有目标癌症的患者施用治疗有效量的分离的T细胞群体或其药物组合物。在某些实施方式中，所述TCR包含TCR-NPC-A11-003(SEQ ID NO:3)。在另一个实施方式中，所述TCR包含TCR-NPC-A11-125(SEQ ID NO:9)。在一些实施方式中，目标癌症的特征为表达LMP2。在一些实施方式中，所述癌症选自以下：鼻咽癌(NPC)、胃癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、白血病和淋巴瘤。在一个实施方式中，所述癌症包括NPC。在另一个实施方式中，所述癌症包括淋巴瘤。在又一个实施方式中，所述癌症包括胃癌。在某些实施方式中，所述癌症是EBV相关性癌症或EBV阳性癌症，例如，EBV阳性霍奇金氏淋巴瘤、EBV阳性伯基特氏淋巴瘤、EBV阳性鼻咽癌或EBV阳性胃癌。

使用的方法

根据本公开的TCR-T效应细胞可以用于治疗患有疾病(如癌症)的受试者。因此，本公开的另一个方面提供了一种在患有特征为LMP2的癌症的受试者中诱导T细胞应答的方法，所述方法包括以下内容或由以下组成或基本上由以下组成：向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的TCR-T细胞衍生的细胞群体，以使得诱导特征为LMP2的癌症的抗肿瘤应答。本公开的又一个方面包括一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括以下内容或由以下组成或基本上由以下组成：向所述受试者施用治疗有效量的如本文提供的TCR-T细胞衍生的群，以使得所述癌症被治疗。

本公开的又一个方面提供了本文公开和说明的所有内容。

通过说明而非限制性的方式提供以下实施例。

实施例

实施例1：响应于LMP2抗原而激活的两个新TCR序列。

获取此前用于治疗NPC患者的外周血单核细胞(PBMC)并使用呈递EBV抗原潜伏性膜蛋白2(LMP2)的树突状细胞对其进行刺激。这导致了对两个新T细胞受体(TCR)序列的发现，所述新T细胞受体(TCR)序列能够响应于LMP2抗原而激活：(1)TCR-NPC-A11-003(AA SEQID NO:03；DNA SEQ ID NO:08)(参见图1A-1B)，和(2)TCR-NPC-A11-125(AA SEQ ID NO:09；DNA SEQ ID NO:14)(参见图2A-2B)。

实施例2：新TCR序列TCR-NPC-A11-003和TCR-NPC-A11-125杀死表达LMP2抗原的细胞。

与实施例1的CD69激活结果一致，TCR-NPC-A11-003和TCR-NPC-A11-125两者均可特异性地杀死工程化以表达连接至HLA-A11而非HLA-A24的LMP2肽的淋巴瘤(参见图3A-3B)。

实施例3：新TCR序列TCR-NPC-A11-003和TCR-NPC-A11-125在小鼠中具有体内抗肿瘤活性。

小鼠移植瘤研究表明这两种TCR具有针对LMP2-A11阳性淋巴瘤的体内抗肿瘤效能。将A11阳性Ramos淋巴瘤细胞(5x10

综上所述，这些发现将LMP2-A11 TCR-T细胞表征为能够选择性地杀伤具有LMP2EBV病毒抗原的细胞。重要的是要注意，这两种TCR(TCR-NPC-A11-003和TCR-NPC-A11-125)均是从具有HLA-A11血清型的患者细胞中鉴定出来的。HLA-A11在东亚尤其常见，因此，这些TCR可用于针对EBV相关性的NPC以及包括霍奇金氏和伯基特氏淋巴瘤在内的淋巴瘤的工程化TCR-T细胞疗法。这种治疗方法还显著缩短了建立EBV-CTL疗法所需要的时间窗，因为现在仅需要3周即可产生患者特异性TCR-T细胞产物。由于之前尚未鉴定出能够识别由HLA-A11呈递的LMP2抗原的其他TCR序列，因此这些结果揭示了两种新型病毒抗原特异性TCR，其有望成为至少用于治疗EBV阳性NPC、胃癌和淋巴瘤的药剂。

实施例4：系统性T细胞受体库的分析和克隆，以改善在晚期EBV特异性鼻咽癌中的治疗结局

鼻咽癌(NPC)在华南和东南亚极其普遍，且对晚期疾病的治疗选择很少。尽管当前的标准疗法受到非特异性毒性的限制，但是NPC通常与爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染相关，这使其成为过继性免疫疗法的理想靶点。对于IV期EBV相关性的NPC，最近的2期临床试验报道了使用体外扩增的EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(EBV-CTL；参见图5A)的令人印象深刻的缓解率。尽管这项研究取得了成功，并且目前正在使用同一方案进行3期试验，但约半数入组患者对CTL治疗方案无应答，这显示可导致免疫逃逸的未知耐药机制的参与。此外，产生用于免疫疗法的EBV-CTL细胞的时间范围为8至22周，这对于很多晚期NPC患者来说是令人望而却步的，而可以使用具有抗原特异性重定向的T细胞的新一代免疫细胞疗法显著缩短该时间。

树突状细胞(DC)疫苗接种是一种类型的癌症免疫疗法，其利用DC的固有能力将抗原呈递给T细胞。尽管通常在生产方面比T细胞疗法更快、更便宜，但DC疫苗的效能也较差，尽管对于接种DC疫苗所引起的临床应答的分子基础尚不清楚。在一项2007年的临床试验中，在16名接受治疗的晚期NPC患者中，首个非人Ad5f35-LMP1-2腺病毒载体诱导的DC疫苗使2名患者(12.5％)病情稳定>18周，使1名患者获得部分缓解(参见图5B)。

进行T细胞受体(TCR)库测序以剖析应答者和无应答者中的TCR多样性，这提供了对耐药机制的更多见解并引导了用于NPC治疗的改进的免疫治疗方法的开发。

I.鉴定对免疫疗法产生应答的分子决定簇

a.通过无偏倚分析发现MPC预后因素

为了发现控制对EBV特异性DC疫苗接种产生应答的分子，使用了系统性细胞因子/趋化因子/生长因子阵列。简言之，通过流式细胞术将从晚期NPC患者中收集的外周血单核细胞(PBMC)分选为离散的免疫细胞群体，所述离散的免疫细胞群体包括单核细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞和T细胞亚群(包括细胞毒性T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞和调节性T细胞)。在分选之后，产生mRNA和cDNA，并使用一个>100种分泌蛋白的板来使其经受全面的qPCR基因表达分析。该程序使得能够鉴定调控对基于DC的免疫疗法的抗性的特异性蛋白，在该治疗背景下，可以合理地靶向或以其他方式利用所述蛋白来改善患者未来的结局。可以使用本文所述的EBV阳性淋巴瘤模型离体和在小鼠中验证在EBV驱动的癌症中未揭示的分子作用。

ii.在DC疫苗治疗的晚期NPC中分析应答者和无应答者的TCR库

发明人已经开发了一种平台/系统，其以高度的重现性在各种人和小鼠组织中对TCR库进行了分析。该系统包括，由或基本上由多重PCR系统组成，其允许在Illumina MiSeq平台上优先读取TCR序列。该系统进一步包括称为“基序分析”的新生物信息学策略，其鉴定出最小的结构决定簇，所述结构决定簇使得能够进行抗原识别，从而可靠地从免疫疗法中的总库变化中分离出抗原特异性T细胞应答。当其靶向的表位具有较弱亲和力或较低丰度时，这对于优化TCR克隆的机率至关重要。

发明人利用这种新型系统来评估来自对EBV特异性DC疫苗接种具有应答(n＝3)或不具有应答(n＝13)的晚期NPC患者的PBMC样品中的TCR库。对于此分析，将比较以下内容：

i)全局TCR多样性；

ii)EBV特异性T细胞应答；和

iii)针对每个单独患者的纵向肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞应答

另外，比较了患者间库的相似性以鉴定显性抗原(例如抗PV克隆型)应答。此外，所述方法包括以下步骤：i)如此前所公开的，进行全局TCR多样性分析，并且将提供单个患者内T细胞克隆的动态变化的全面视图。ii)对于EBV特异性T细胞应答，将LMP1-2腺病毒载体转导的DC与自体T细胞共培养。对抗原扩增的T细胞进行分选，以进行TCR库测序，以确定抗EBV T细胞库的广度和强度。

iii)为评估TAA特异性T细胞应答，将患者DC(来自PBMC)暴露于代表本研究中研究的TAA的肽/肽库中(例如EGFR、存活素)。使用抗原扩增的CD4+和CD8+TCR序列(来自ii和iii)作为训练数据集，可以鉴定TAA基序和基序的组合。通过Jaccard相似度(距离)＝分析，基于每对TCR所计算出来的Jaccard距离，构建网络并将TCR聚集成聚类(参见图6)。通过这种方式，发现了原始未刺激样品(来自i)中TCR的新克隆型(宽度)和频率(深度)。通过量化TAA特异性TCR的集体频率，可以监测治疗引起的抗肿瘤T细胞应答。II.分子生物学平台开发–具有成本效益的TCR克隆为NPC带来了TCR-T策略

a:EBV特异性TCR克隆

作为使用单一T细胞RNA-Seq技术的原理验证(proof-of-principle)研究，发明人已成功进行了巨细胞病毒(CMV)特异性TCR的高通量克隆。通过逆转录病毒转导在PBMC中表达这些TCR，并且在体外验证了其特异性和细胞毒性(参见图7)。使用相同技术，发明人建立了表达TCR的病毒的小库(最多20个)，并采用本文所述的TCR生产程序来产生EBV特异性TCR-T细胞。因为尚未建立EBV阳性NPC细胞系，所以使用EBV阳性淋巴瘤细胞来评估TCR-T细胞的杀伤能力。在体外对每种TCR-T细胞系进行了其杀死EBV阳性Raji淋巴瘤细胞而不杀死EBV阴性Ramos细胞的特异性的检测。任何未通过此功能测试的TCR都被具有RNA-Seq所鉴定的相似特征的新TCR替代。

b：在携带EBV阳性淋巴瘤的小鼠中确定TCR-T细胞疗法的安全性

用由针对EBV表位的5个CD4+和5个CD8+TCR组成的混合TCR-T群体来处理MHC人源化小鼠。在该设计中，使用CD8+T细胞可实现迅速的EBV特异性T细胞扩增和细胞溶解活性；以及CD4+T细胞可用于增强CD8+记忆T细胞的有效分化，以实现长期保护。正式考察了该策略的临床价值以了解其毒性和效能。为了排除潜在毒性，进行了动物毒性测定。根据FDA指导原则，以3种剂量水平进行急性和慢性毒性研究以评估单一啮齿动物物种的组织病理学毒性、致癌性、皮肤毒性和神经毒性。急性研究包括静脉内(IV)输注，随后进行2周的观察期。长期研究包括IV输注，随后是6个月的观察期。剂量水平转化成与人体试验中的灌注(perfusion)程序相似的剂量，使其在未来人体研究中可直接转用。每周监测全血细胞计数、血生化、酶和自身免疫血清学，并且每天通过体重和神经系统检查对小鼠进行评估。当小鼠死亡或当其显示出确定的毒性或神经系统缺陷迹象时，对小鼠进行尸体检查。EBVTCR-T细胞的安全性在以下概述的所有实验中均使用相同的临床、化学、免疫学、组织病理学和统计学评价进行监测。

c：在携带EBV阳性淋巴瘤的小鼠中确定TCR-T细胞疗法的效能

在NOD/SCID小鼠中使用肿瘤异种移植模型评价了产生的EBV TCR-T策略的效能。皮下移植1x 10

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