15(S)-羟基二十碳四烯酸在评估变应原特异性免疫治疗效果中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于评估变应原特异性免疫治疗效果的血清学标志物。

背景技术

代谢组学(metabonomics)是对代谢产物进行定性、定量分析的一门重要学科。生物体内的生物信息由基因经转录传递给蛋白质，最终体现为小分子代谢物，小分子代谢物不仅是机体生命活动、生化代谢的物质基础，还体现了某些外来因素对体内代谢环境的改变，因而某些独特代谢物的浓度在不同个体间的差异事实上反映了疾病内在的表现和外在病因。

近年来，代谢组学为复杂慢性疾病的筛检和早期诊断提供崭新的技术方法，也被广泛用于寻找复杂慢性疾病的生物标志物和研究疾病的致病途径等方面。代谢组学通过对样品中所有分子量低于1000Da的小分子代谢物，例如脂肪酸、氨基酸、核苷及甾体等，进行定性定量检测，从而监测机体中的代谢响应，根据小分子代谢物的含量判断其是否受到疾病或危险因素累积等干扰。不同于基因组学和蛋白组学反映的生物体内在差异，代谢组学的研究领域扩展到了机体与环境之间的相互影响和作用。

代谢组学分析中，主要是对代谢物进行定性定量分析，其检测手段则以化学分析领域当下的主流技术为主，包括核磁共振(NMR)、质谱(MS)、高效液相色谱(HPLC)和超高效液相色谱(UHPLC)等。质谱检测技术则具有较高的检测灵敏度，与色谱技术联用后更可以将复杂样本中的代谢物先进行色谱分离再进行质谱检测，减少了基质的干扰，有利于痕量代谢物的检测。

过敏性哮喘(Allergic asthma)是一种以气道炎症为特征的常见变态反应性疾病(Allergic diseases)。过敏性哮喘经常反复发作，需要长期服用类固醇和抗组胺药物来控制症状；然而，这些药物易产生多种副作用，如皮肤萎缩、骨质疏松、脂肪肝疾病和II型糖尿病综合征以及儿童生长抑制，因此药物的使用范围受到了限制。

变应原特异性免疫治疗(Allergen specific immunotherapy，AIT)是一种能够改变变态反应性疾病病程的治疗方法。尽管目前欧洲变态反应与临床免疫学学会(EAACI)提出多种免疫学指标(如：过敏原特异性IgG4浓度、特异的IgE与总IgE浓度比等)来评估AIT的疗效。但是，目前仍然缺乏客观、高度敏感和特定的生物标志物用于评估或监测临床病人接受AIT后的效果。

因此，选择一种合适的生物标志物来评估变应原特异性免疫治疗效果，对于扩大变应原特异性免疫治疗的应用范围具有重要的意义。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供15(S)-羟基二十碳四烯酸在评估变应原特异性免疫治疗效果中的应用。通过对过敏性哮喘患者、健康人体和接受AIT的过敏性哮喘患者的血清进行代谢组学分析，确认15(S)-羟基二十碳四烯酸能够客观、特异且高度敏感的反映AIT的治疗效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供15(S)-羟基二十碳四烯酸(15(S)-Hydroxyeicosatetraenoic acid，15(S)-HETE)作为血清学标志物在制备评估变应原特异性免疫治疗效果的试剂盒或构建评估变应原特异性免疫治疗效果的方法中的应用。

所述15(S)-羟基二十碳四烯酸的结构式如式(I)所示：

本发明中，血清学标志物15(S)-HETE在过敏性哮喘患者和健康人体中的含量具有显著区别，FC(哮喘/正常)＝2.39且AUC＝0.89(P＝0.0028)、

且经过监测接受三年变应原特异性免疫治疗治疗的患者血清中15(S)-HETE的含量发现，该代谢物在变应原特异性免疫治疗治疗的第一年增加，然后从第一年到第三年下降，在治疗三年后显著低于基线水平，因此，利用15(S)-HETE能够用于评估变应原特异性免疫治疗的治疗效果。

作为本发明优选的技术方案，所述评估变应原特异性免疫治疗效果的试剂盒包括：检测15(S)-羟基二十碳四烯酸含量的试剂。

优选地，所述评估变应原特异性免疫治疗效果的试剂盒还包括其他检测血清学标志物含量的试剂，例如用于检测5(S)-羟基二十碳四烯酸(5(S)-HETE)、8(S)-羟基二十碳四烯酸(8(S)-HETE)、11(S)-羟基二十碳四烯酸(11(S)-HETE)、12(S)-羟基二十碳四烯酸(12(S)-HETE)、5(S)-羟过氧化二十碳四烯酸(5(S)-Hydroperoxyeicosatetraenoic acid，5(S)-HPETE)、12(S)-羟过氧化二十碳四烯酸(12(S)-HPETE)、15(S)-羟过氧化二十碳四烯酸(15(S)-HPETE)或花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)中的任意一种或至少两种血清学标志物含量的试剂。

本发明中，通过对血清样本的类二十烷酸代谢物进行分析，发现了包括15(S)-HETE在内的多种差异代谢物，且这些代谢物能够反映患者的健康水平和治疗方式的治疗效果。若将15(S)-HETE与其他代谢物进行组合，同时检测组合中各物质的含量，能够更加精确地对样本中的健康状况作出评估和判断。

作为本发明优选的技术方案，所述评估变应原特异性免疫治疗效果的试剂盒包括：检测15(S)-羟基二十碳四烯酸、15(S)-羟过氧化二十碳四烯酸和12(S)-羟基二十碳四烯酸含量的试剂。

本发明中，所述15(S)-HETE为15(S)-HPETE在谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase，GPx)作用下得到的产物。因此，15(S)-HPETE、15(S)-HETE和12(S)-HETE同时作为检测靶标，能够进一步提高评估结果的准确性。

本发明中，所述15(S)-HETE能够作为评估变应原特异性免疫治疗效果的血清学标志物是通过如下方法筛选得到的，具体步骤如图1所示，包括：

S1、采集健康儿童和哮喘儿童的血清样本并进行预处理

(1)收集血清样本并在所述血清样本中加入乙酸乙酯，所述血清样本与乙酸乙酯的体积比为1:(2～5)，离心后，收集上清后于氮气流下干燥；

(2)而后，将预处理后的血清样本、HOBt(1-羟基苯并三氮唑)、HATU(2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和(2-氨基乙基)三甲基氯化铵盐酸盐混合，反应后得到衍生化样品。

其中，衍生化可以使用式(II)进行表示：

式中，R表示任意烃基，TEA表示反应缓冲液，该反应可在室温下进行。

本发明中所述衍生化的方法和色谱质谱联用的方法参见Bian X,Sun B,Zheng P,et al.Derivatization enhanced separation and sensitivity of long chain-freefatty acids:Application to asthma using targeted and non-targeted liquidchromatography-mass spectrometry approach[J].Analytica Chimica Acta,2017:59.中记载的分析方法。

S2、衍生化UHPLC-Q-TOF/MS分析：所得正常血清样本和变态反应性疾病的血清样本采用衍生化-UHPLC-Q-TOF/MS(Ultra-high performance liquid chromatography-quadruple-time of flight/MS)进行分析；

S3、非靶向代谢组学分析：衍生化-UHPLC-Q-TOF/MS的分析结果结合非靶标代谢组学分析和靶标代谢组学分析；

S4、潜在生物标志物：筛选出候选的潜在生物标志物；

S5、采集接受特异性免疫治疗儿童的血清样本并预处理：采用同样的方法采集接受特异性免疫治疗儿童的血清样本，包括在治疗第0年、0.5年、1年、2年和3年时的血清样本；

S6、衍生化UHPLC-QQQ-MS分析：所述接受变应原特异性免疫治疗的血清样本采用衍生化-UHPLC-QQQ-MS分析；

S7、类二十烷酸-靶标代谢组分析：对所得分析结果进行类二十烷酸-靶标代谢组学分析；

S8、代谢物差异：结合候选的潜在生物标志物，得到用于预测变应原特异性免疫治疗效果的血清学标志物；

S9、GPx-HETEs：对类二十烷化合物的代谢通路进行分析。

作为本发明优选的技术方案，所述评估变应原特异性免疫治疗效果的方法包括：检测血清样本中15(S)-羟基二十碳四烯酸的含量，并根据所述含量评估变应原特异性免疫治疗的效果。

优选地，所述评估变应原特异性免疫治疗效果的方法还包括：

检测血清样本中5(S)-羟基二十碳四烯酸、8(S)-羟基二十碳四烯酸、11(S)-羟基二十碳四烯酸、12(S)-羟基二十碳四烯酸、5(S)-羟过氧化二十碳四烯酸、12(S)-羟过氧化二十碳四烯酸、15(S)-羟过氧化二十碳四烯酸或花生四烯酸中的任意一种或至少两种血清学标志物的含量，并根据各个所述血清学标志物的含量评估变应原特异性免疫治疗的效果。

所述评估变应原特异性免疫治疗效果的方法中，检测所述血清学标志物含量的方法包括：衍生化的UHPLC-Q-TOF/MS分析。

优选地，所述评估变应原特异性免疫治疗效果的方法中所述血清样本经过预处理，所述预处理的方法包括：在所述血清样本中加入乙酸乙酯，所述血清样本与乙酸乙酯的体积比为1:(2～5)，离心后，收集上清后于氮气流下干燥。

优选地，所述衍生化的方法为：将所述预处理后得到的血清样本、HOBt、HATU和(2-氨基乙基)三甲基氯化铵盐酸盐混合，反应。

第三方面，本发明还提供15(S)-羟基二十碳四烯酸、15(S)-羟过氧化二十碳四烯酸和12(S)-羟基二十碳四烯酸作为血清学标志物组合在制备评估变应原特异性免疫治疗效果的试剂盒或构建评估变应原特异性免疫治疗效果的方法中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明经过衍生化-UHPLC-Q-TOF/MS分析和代谢组学分析，对健康儿童与屋尘螨过敏性哮喘儿童的血清代谢物进行差异分析，筛选出潜在的9种生物标志物，同时，关注三年皮下免疫治疗(SCIT)期间，过敏性哮喘儿童类二十烷代谢物的变化，并采用衍生化-UHPLC-QQQ-MS进行分析，选用(2-氨基乙基)三甲基氯化铵盐酸盐作为衍生试剂，提高UHPLC-Q-TOF/MS分析羧酸的灵敏度和分离效率，得到哮喘组儿童体内的15(S)-羟基二十碳四烯酸显著高于健康组儿童，FC(哮喘/正常)＝2.39，且其具有良好的AUC值，AUC＝0.89(P＝0.0028)；此外，该代谢物在SCIT治疗的第一年增加，然后从第一年到第三年下降，在治疗三年后显著低于基线水平，因此，15(S)-羟基二十碳四烯酸能够作为评估变应原特异性免疫治疗效果的血清学标志物。

附图说明

图1为本发明中血清学标志物的筛选方法的流程示意图。

图2A为实施例1中过敏性哮喘患者与健康对照组的PCA分析结果图。

图2B为实施例1中过敏性哮喘患者与健康对照组的OPLS-DA评分图。

图2C为实施例1中过敏性哮喘患者与健康对照组的负荷S点状图。

图3A为实施例2中过敏性哮喘患者体内哮喘代谢产物水平分布图。

图3B为实施例2中不同二十烷类化合物的热图。

图3C为实施例2中健康个体与过敏性哮喘患者之间二十烷类化合物水平的变化对比图，其中a图～i图分别表示AA、5(S)-HPETE、12(S)-HPETE、15(S)-HPETE、5(S)-HETE、8(S)-HETE、11(S)-HETE、12(S)-HETE和15(S)-HETE的含量。

图3D为实施例2中候选生物标志物的通路富集结果图。

图3E为实施例2中8个代谢物的预测变量重要性(VIP)得分。

图4A为实施例3中SCIT期间血清内12(S)-HPETEs和12(S)-HETEs的动态变化图；其中(I)图为12(S)-HPETEs，(II)图为12(S)-HETEs。

图4B为实施例3中SCIT期间血清内15(S)-HPETEs和15(S)-HETEs的动态变化图；其中(I)图为15(S)-HPETEs，(II)图为15(S)-HETEs。

图4C为实施例3中SCIT期间血清内5(S)-HPETEs和5(S)-HETEs的动态变化图；其中(I)图为5(S)-HPETEs，(II)图为5(S)-HETEs。

图4D为实施例3中SCIT期间血清内8(S)-HETEs和11(S)-HETEs的动态变化图；其中(I)图为8(S)-HETEs，(II)图为11(S)-HETEs。

图5A为实施例3中过敏性哮喘患者SCIT期间血清样本中12(S)-HETEs的绝对浓度变化曲线图。

图5B为实施例3中类二十烷化合物的代谢通路示意图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

本发明中所有实验均由广州医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

实施例1

本实施例用于筛选过敏性哮喘的血清学标志物，具体包括如下步骤：

研究对象：收集在样本采集时获取研究参与者的基线人口学数据和相关信息，包括性别、年龄、BMI、临床症状、皮肤点刺试验、初始诊断、熟悉的疾病、家庭特征、治疗方法等。

本实施例中以50名儿童为受试者，35例过敏性哮喘患儿通过纳入和排除标准，包括20例接受屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus，Derp)SCIT(Alutard ALK-Abello，

(1)样品采集与预处理：收集受试者的血清样本，3000rpm离心10分钟，收集上清，-80℃保存备用。

选用(2-氨基乙基)三甲基氯化铵盐酸盐(胆胺)作为衍生试剂，以提高UHPLC-Q-TOF/MS分析羧酸的灵敏度和分离效率；

(2)代谢组学分析：血清样本采用多平台分析方法进行测定，UHPLC-Q-TOF/MS用于分析羧酸，UHPLC-QQQ-MS用于定量靶向二十烷类化合物；

原始LC-MS数据的获取和处理使用安捷伦MassHunter定性分析B.06.00软件(安捷伦技术，美国)。其中，有标准的代谢物通过与相关标准物比较确认，其他没有标准的代谢物通过LC-MS/MS实验进行确认，使用30eV进行片段化。

(3)过敏性哮喘潜在系统性生物标志物的非靶向代谢组学分析，采用胆胺衍生化UHPLC-Q-TOF/MS对哮喘患者和健康人的血清样本进行分析，并采用SIMCA-P软件进行多因素分析，确定两组间重要的差异代谢物。

PCA(principal component analysis，主成分分析)结果(如图2A所示)证实，健康组与哮喘组分离良好；

在OPLS-DA(Orthogonal PLS-DA，正交偏最小二乘判别分析)评分图(如图2B所示)中，R2Y＝0.893，Q2＝0.602，各组样本紧密聚在一起，表明本实施例中研究结果具有可靠性；

在S-pot图(如图2C所示)中，通过MS和MS/MS结果与标准比较，确定15(S)-HETE在哮喘组显著升高。

本实施例中通过对哮喘患者和非哮喘对照组的血清非靶标代谢组学进行分析，从特征的MS/MS片段化模式中观察和鉴定，并将MS数据与脂质地图和METLIN数据库中的数据进行比较，总共有125种代谢物有一定的表达量差别，其中就包括15(S)-HETE。

实施例2

本实施例中对候选生物标志物进行验证分析，即使用t检验、火山图和ROC曲线来验证实施例1中获得的结果。

(1)代谢差异显著的代谢物分析

图3A给出不同代谢产物在哮喘患者体内的表达变化量，图中显示了42种代谢物差异显著，显示哮喘患者代谢失调，HETEs在哮喘中表达上调

(2)SPSS分析

选择上述显著改变的代谢物，用SPSS进行进一步分析。

根据分析结果可知，如图3B，九种代谢物(AA、5(S)-HPETE、12(S)-HPETE、15(S)-HPETE、5(S)-HETE，8(S)-HETE，11(S)-HETE，12(S)-HETE，15(S)-HETE)有明显的含量差异；

结合图3C，其中健康人体和哮喘患者的AA(a图)、5(S)-HPETE(b图)、12(S)-HPETE(c图)、15(S)-HPETE(d图)、5(S)-HETE(e图)、8(S)-HETE(f图)、11(S)-HETE(g图)、12(S)-HETE(h图)和15(S)-HETE(i图)的含量明显不同；其中，以图3C中的a图为例，左侧表示健康人体中AA的含量，右侧表示哮喘患者中AA的含量，其余b图～i图与a图一致。

如图3D所示，图中由上到下表示13种代谢通路，依次为：arachidonic acidmetabolism(花生四烯酸代谢)、fatty acid biosynthsis(脂肪酸生物合成)、betaoxidation of very long chain fatty acids(超长链脂肪酸的β氧化)、alpha Linolenicacid and Linolenic acid metabolism(α-亚麻酸与亚麻酸代谢)、mitochondrial beta-oxidation of short fatty-acid metabolism(短脂肪酸代谢的线粒体β氧化)、plasmalogen synthesis(血浆激素合成)、glycerolipid metabolism(甘油脂质代谢)、mitochondrial beta-oxidation of medium fatty-acid metabolism(中等脂肪酸代谢的线粒体β氧化)、bile acid biosynthsis(胆汁酸生物合成)、mitochondrial beta-oxidation of long fatty-acid metabolism(长链脂肪酸代谢的线粒体β氧化)、fattyacid elongation in mitochondrial(线粒体脂肪酸的延长)、fatty acid metabolism(脂肪酸代谢)和steroid biosynthsis(类固醇生物合成)，上述九种代谢物均与AA代谢相关，显示出潜在的系统靶点能力，能够区分哮喘患者和健康对照组。

其中，12(S)-HETE具有良好的AUC值(P<0.05，|FC|>1.2)，其中FC表示FoldChanges，并显示出潜在的系统靶点能力，能够区分哮喘患者和健康对照组。

9种代谢物的相关统计数据见表1：

表1

由上表可知，AA、5(S)-HPETE、12(S)-HPETE、15(S)-HPETE、5(S)-HETE，8(S)-HETE，11(S)-HETE，12(S)-HETE和15(S)-HETE这九种代谢物的含量均明显上调，上调倍数为1.29～3.19。

(3)预测变量重要性(Variable Importance for the Projection，VIP分数)

本实施例中通过PLS-DA(Partial least-squares discriminant analysis，偏最小二乘判别分析)模型中预测VIP分数，计算出的最重要的代谢物如图3E所示。

由本实施例可知，15(S)-HETE具有较高的AUC值、FC(哮喘/正常)和较高的VIP，其AUC＝0.89，FC＝2.39。因此，15(S)-HETE能够作为候选的生物标志物监测SCIT相关的过敏性哮喘的治疗反应。

实施例3

本实施例用于SCIT组靶向二十烷类代谢组学的纵向研究。

SCIT能有效改善过敏原引起的症状，对治疗过敏性哮喘有效，免疫刺激抗体IgE的水平在治疗的第一年有轻微上升的趋势，但在1到3年的SCIT后显著下降。虽然有几项研究认为IgE和IgG4是次要结果，但目前并没有在临床试验或临床反应中明确相关的生物标志物，并且这些SCIT病人没有明显的肺功能变化或锗硅水平变化。

1、本实施例中，有针对性地对对接受三年SCIT治疗的患者的代谢组学进行分析，所得结果如图4A～图4D所示。发现：

12(S)-HPETEs和12(S)-HETEs(见图4A中(I)和(II)图)；

15(S)-HPETEs和15(S)-HETEs(见图4B中(I)和(II)图)；

5(S)-HPETEs和5(S)-HETEs(见图4C中(I)和(II)图)；

8(S)-HETEs和11(S)-HETEs(见图4D中(I)和(II)图)的水平在治疗的第一年大幅度增加，然后从1到3年逐步减少。

其中，如图5A所示，治疗3年后，15(S)-HETE水平显著低于基线水平(0Y，P<0.05)。因此，SCIT有助于治疗至少3年的过敏性哮喘。

2、此外，本实施例中还对类二十烷化合物的代谢通路进行了分析；

类二十烷化合物是炎症反应的关键驱动因素，LOX和GPx酶与变应原免疫调节过程和呼吸道上皮反应相关。

所得结果如图5B所示，根据AA氧合的具体位置，脂质加氧酶(Lipoxygenase，LOX)分为5-LOX、8-LOX、11-LOX、12-LOX和15-LOX，将AA代谢为5(S)-HPETEs、8(S)-HPETEs、11(S)-HPETEs、12(S)-HPETEs和15(S)-HPETEs；

谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)被认为参与了类二十烷化合物的合成，通过调节LOX活性，将5(S)-HPETEs、12(S)-HPETEs和15(S)-HPETEs代谢为5(S)-、12(S)-和15(S)-HETEs。

由于15(S)-HETE是由花生四烯酸通过15-LOX和GPx途径代谢得到，是参与过敏性哮喘变应原特异性免疫治疗的生物标志物，由于其表达量的变化，推测15-LOX和GPx的含量也有可能成为过敏性哮喘变应原特异性免疫治疗的生物标志物。

综上所述，在本发明中，发明人发现15(S)-HETEs的水平在哮喘组较高，在接受变应原特异性免疫治疗后，15(S)-HETE明显下降；因此，15(S)-HETE可作为监测变应原特异性免疫治疗疗效的血清中代谢物，其也是过敏性哮喘的检测靶点，并根据其表达水平的上述解释过敏性哮喘的发病机制。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。