中枢神经系统感染病原体检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于医学生物检测技术领域，涉及可同时检测出18种中枢神经系统感染病原体的检测试剂盒，以及其在中枢神经系统感染病原体检测中的应用。

背景技术

中枢神经系统感染是指各种生物性病原体(包括病毒、细菌、立克次体、螺旋体、寄生虫等)侵犯中枢神经系统实质、被膜及血管引起的急性或慢性炎症性疾病，如引发脑炎、脊髓炎、脑脊髓炎、脑膜炎、脑脊膜炎等。临床上，中枢神经系统感染病人常常发生昏迷、抽搐、瘫痪、感觉异常、吞咽困难和大小便障碍等症状。昏迷、瘫痪病人不会咳嗽、翻身，又容易并发肺炎和压疮；突发抽搐可导致窒息，小便障碍易并发泌尿道感染，并发症的发生延长病程和加重病情，导致患者的护理和治疗工作繁重。

精准检测感染病原体对于对症治疗中枢神经感染疾病意义重大。传统的切片镜检病原微生物检测方法不适用中枢神经系统感染病原体检测，阳性率极其低，不超过10％。当前多采用分子检测手段进行，常用的分子检测手段有普通PCR、巢式PCR和荧光定量PCR。单重PCR是最早建立的PCR方法，只针对单个DNA模板进行扩增，实际应用中检测量巨大；多重PCR目前仅能同时检测少数几种中枢神经感染病原体，现有记载资料中一次性最多检测12种病原体，如专利号为CN108085408A的中国发明专利公开了一种能够快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的引物和探针，实现一次性检测12种中枢神经细菌病原体，包括结核分枝杆菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、化脓杆菌、脑膜奈瑟氏菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌。

然而，上述检测方法不涉及任何病毒病原体的检测，而由于免疫抑制剂的应用、化学治疗、放射治疗以及器官移植的开展，病毒性中枢神经系统感染率一直处于上升状态。上述专利检测方法的应用范围局限性很大。

新型检测方法如二代测序技术(next generation sequencing,NGS)，也被用于中枢神经系统感染病原体的检测种，如脑脊液NGS检测给神经感染的病原学检查带来了很大变革，但目前NGS的检测和解读仍存在很多问题，最大的问题在于灵敏度不够高。常见病原体的致病力较强，少量病原体即可致病，而对于少量病原体的检测，NGS并不如传统的培养和PCR方法。

综上，同时尽可能多的对中枢神经系统感染病原体进行检测仍是中枢神经系统感染病原体检测的发展目标。

发明内容

本发明是为解决上述技术问题进行的，提供了一种可以同时检测18种中枢神经系统感染病原体的检测试剂盒，采用的技术为多重荧光PCR技术，采用的原理为荧光能量共振转移，通过熔解温度范围判定检测结果，灵敏度高，结果明确易判读。

本发明的第一方面，提供了一种中枢神经系统感染病原体检测试剂盒，包括反应液、逆转录引物、缓冲液1、缓冲液2、反应酶、内部质控、阳性质控以及稀释液。

其中，所述逆转录引物系统包括依次对应人类肠道病毒、流感嗜血杆菌、EB病毒、肺炎链球菌、巨细胞病毒、无乳链球菌、单纯疱疹病毒1型、单核细胞增多性李斯特菌、单纯疱疹病毒2型、脑膜炎奈瑟菌、水痘带状疱疹病毒、双埃可病毒、格特隐球菌、腮腺炎病毒、新生隐球菌、人疱疹病毒6型、大肠杆菌K1以及金黄色葡萄球菌的第一至第十八逆转录引物组，每个引物组均包括正向引物和反向引物，序列如SEQ ID NO.1～36所示。

缓冲液1和缓冲液2中分别包括用于荧光检测的扩增引物组以及探针。缓冲液1中包括依次对应人类肠道病毒、流感嗜血杆菌、EB病毒、肺炎链球菌、巨细胞病毒、无乳链球菌、单纯疱疹病毒1型、单核细胞增多性李斯特菌、单纯疱疹病毒2型、脑膜炎奈瑟菌、水痘带状疱疹病毒、双埃可病毒的第一至第十二扩增引物组以及第一至第十二探针；缓冲液2中包括依次对应格特隐球菌、腮腺炎病毒、新生隐球菌、人疱疹病毒6型、大肠杆菌K1以及金黄色葡萄球菌的第十三至第十八扩增引物组以及第一探针、第三探针、第四探针、第六探针、第八探针和第九探针。

第一至第十八扩增引物组均分别包括正向引物和反向引物，序列如SEQ ID NO.37～72所示，第一至第十二探针序列如SEQ ID NO.73～84所示。

优选的，在本发明提供的中枢神经系统感染病原体检测试剂盒中，反应液的规格为375μL，逆转录引物系统的规格为490μL，缓冲液1的规格为1050μL，缓冲液2的规格为1050μL，反应酶的规格为120μL，内部质控的规格为1000μL，阳性质控的规格为110μL，所述稀释液的规格为1700μL。为了方便区分，每种试剂管的管盖颜色不同。

优选的，反应液包括储存液和反应酶，储存液与反应酶的体积比为3:1，反应酶的浓度为5.00U/μL；逆转录引物系统包括435.4μL的0.1*TE稀释液以及54.6μL的逆转录引物组；反应酶包括Taq酶以及DNA聚合酶；内部质控包括浓度为10

其中，在内部质控中，MS2噬菌体的正、反向逆转录引物序列分别如SEQ ID NO.85和86所示，正、反向扩增引物序列分别如SEQ ID NO.87和88所示，探针序列如SEQ ID NO.89所示。

上述所述引物和探针的具体序列在具体实施方式中进行详细描述。

优选的，缓冲液1的组成如下：

缓冲液2的组成如下：

所述扩增质控1，扩增质控2均为人工合成片段，两个扩增质控的探针序列如SEQIDNO.90所示。

优选的，缓冲液1、所述缓冲液2以及反应酶被配置成两个反应体系，反应体系1包括缓冲液1和反应酶，反应体系2包括缓冲液2和反应酶。缓冲液1和缓冲液2与反应酶的体积比均为19:1。

优选的，采用该试剂盒进行检测时，通过逆转录扩增反应以及荧光检测扩增反应完成，第一步扩增反应体系包括6.25μL反应液、8.75μL逆转录引物系统、10μL提取的核酸样本，反应温度设置程序如下：

第二步扩增反应体系包括20μL反应体系1、20μL反应体系2以及分别加入至所述反应体系1和反应体系2中的5μL第一步扩增反应产物，反应温度设置程序如下：

优选的，探针的3’端修饰有荧光报告基团，5’端修饰有荧光猝灭基团，所述荧光报告基团包括FAM、ROX和Cy5，所述荧光猝灭基团包括BHQ1和BHQ2，

FAM的激发波长为465nm，检测波长为510nm；ROX的激发波长为465nm，检测波长为610nm；Cy5的激发波长为465nm，检测波长为660nm。

本发明的第二方面，提供了上述中枢神经系统感染病原体核酸检测试剂盒在检测中枢神经系统感染病原体中的应用。

本发明的有益保障及效果如下：

本发明采用多重荧光PCR技术，通过特异性设计引物和探针序列，并合理设计试剂盒中不同检测管中的组分及含量，成功实现了一次性对18种中枢神经系统感染病原体进行检测。

本发明利用多条荧光染料探针，在扩增过程中实时监测荧光信号，并通过制定标准曲线准确定量样本目的基因的初始拷贝数。本发明同一个反应管最多可以同时检测6种不同的病原体，一次操作可以同时检测46个样本。灵敏度和特异性显著优于传统实验室检查方法及NGS技术，是一种有效精准的检测方法，可以作为临床诊断参考依据，辅助临床医生对中枢神经系统感染患者进行快速诊断及精准治疗，能够作为一种监测病原体流行情况的检测手段，帮助我们了解病原体的人群分布、季节分布及地域分布。

附图说明

图1为试剂盒组装流程图；

图2为FAM通道检测出的阴性样本结果；

图3为阳性质控熔解曲线图；

图4为人血液干扰结果；

图5为人类DNA干扰结果；

图6为甘露醇注射液干扰结果。

具体实施方式

下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：试剂盒

一、试剂盒组成

试剂盒中各检测管名称、组分及规格参见表1：

表1试剂盒组成

反应液组成参见表2：

表2反应液检测管组成

逆转录引物组成参见表3：

表3逆转录引物检测管组分

逆转录引物包括对应十八种病原体的第一至第十八逆转录引物组，每个引物组均包括正向引物和反向引物，序列如SEQ ID NO.1～36所示；还包括内部质控中MS2噬菌体的正、反向逆转录引物序列，分别如SEQ ID NO.85和86所示。

缓冲液1组成参见表4：

表4缓冲液1检测管组分

FRJNPM4包括依次对应人类肠道病毒、流感嗜血杆菌、EB病毒、肺炎链球菌、巨细胞病毒、无乳链球菌、单纯疱疹病毒1型、单核细胞增多性李斯特菌、单纯疱疹病毒2型、脑膜炎奈瑟菌、水痘带状疱疹病毒、双埃可病毒的第一至第十二扩增引物组，每个引物组均包括正向引物和反向引物，序列如SEQ ID NO.37～60所示；还包括作为内部质控的MS2噬菌体的正、反向引物序列，SEQ ID NO.87和88所示。

FRJNPB-MF包括依次对应上述12种病原体的第一至第十二探针，该第一至第十二探针序列如SEQ ID NO.73～84所示；还包括MS2噬菌体的探针序列，如SEQ ID NO.89所示。

缓冲液2组成参见表5：

表5缓冲液1检测管组分

FRJNPM5包括依次对应格特隐球菌、腮腺炎病毒、新生隐球菌、人疱疹病毒6型、大肠杆菌K1以及金黄色葡萄球菌的第十三至第十八扩增引物组，每个引物组均包括正向引物和反向引物，序列如SEQ ID NO.61～72所示；同样包括作为内部质控中MS2噬菌体的正、反向引物序列。

FRJNPB-MF包括分别对应上述6种病原体的第一探针、第三探针、第四探针、第六探针、第八探针和第九探针，还包括作为内部质控的MS2噬菌体的探针序列。

内部质控组成参见表6：

表6内部质控检测管组分

阳性质控组成参见表7：

表7阳性质控检测管组分

FRGDPC-MF为质控人工合成片段，该人工合成片段为十八个病原体保守区域片段。

试剂盒中各反应管的分装和包装流程按照图1所示流程进行，加★的操作工序为关键工序，所有物料都先经检验合格后才能投料。

二、引物及探针序列

1、引物

各病原体的引物设计规则如下：

选择人类肠道病毒5’untranslated region(5’-UTR)的保守区域作为扩增和检测人类肠道病毒的靶标，该引物适用于各种人类肠道病毒的扩增；选择流感嗜血杆菌的DNAgyrase B(gyrB)中的保守区域作为扩增和检测流感嗜血杆菌的靶标；选择单纯疱疹病毒1型的encoding glycoprotein G(gG)中的保守区域分别作为扩增和检测单纯疱疹病毒1型的靶标；选择单纯疱疹病毒2型的encoding glycoprotein D(gD)中的保守区域分别作为扩增和检测单纯疱疹病毒2型的靶标；选择肺炎链球菌的Autolysin(lytA)中的保守区域作为扩增和检测肺炎链球菌的靶标；选择巨细胞病毒UL89基因的保守区域作为扩增和检测巨细胞病毒的靶标；选择无乳链球菌CAMP factor(cfb)中的保守区域作为扩增和检测无乳链球菌的靶标；选择单核细胞增多性李斯特菌编码Listeriolysin O precursor(Hly)的保守区域作为扩增和检测单核细胞增多性李斯特菌的靶标；选择水痘带状疱疹病毒Immediateearly 62protein(IE62)的保守区域作为扩增和检测水痘带状疱疹病毒的靶标；选择双埃可病毒5’untranslated region(5’-UTR)的保守区域作为扩增和检测双埃柯病毒的靶标；选择脑膜炎奈瑟菌Capsule polysaccharide export outer membrane protein(ctrA)的保守区域分别作为扩增脑膜炎奈瑟菌的靶标；选择大肠杆菌K1的K1 capsularantigenUDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase(NeuC)保守区域作为扩增大肠杆菌K1的靶标；选择新生隐球菌的Capsular-associated protein59(CAP59)的保守区域作为扩增新生隐球菌的靶标；选择人疱疹病毒6型DNA polymerase(pol)的保守区域作为扩增人疱疹病毒6型的靶标；选择格特隐球菌的Intergenic spacer(IGS)的保守区域作为扩增格特隐球菌的靶标；选择EB病毒的Epstein-Barr nuclear antigen 1(EBNA1)的保守区域作为扩增EB病毒的靶标；选择腮腺炎病毒的Fusion glycoprotein(FP)的保守区域作为扩增腮腺炎病毒的靶标；选择金黄色葡萄球菌的Factor essential for methicillin resistance(femA)的保守区域作为扩增金黄色葡萄球菌的靶标；选择噬菌体MS2外壳蛋白和裂解蛋白的相邻基因中的保守区域作为扩增噬菌体MS2的靶标，作为内部质控，汇总如表8所示：

表8十八种病原体和噬菌体靶基因位点表

所有引物均由Intergrated DNA Technologies.Inc提供，纯度为HPLC级，引物序列如表9和表10。表9为第一步逆转录和扩增引物序列，表10为第二步扩增引物序列。

表9十八种病原体和噬菌体的第一步扩增引物序列表

表10十八种病原体和噬菌体的第二步扩增引物序列表

其中，序列中的I表示此处为简并碱基，其为次黄嘌呤。

2、探针

所有探针均由Intergrated DNA Technologies.Inc提供，纯度为HPLC级，探针序列如表中所示。

表11十八种病原体和噬菌体的探针序列表

实施例2：检测流程

1、提取核酸：

本试剂盒推荐使用的核酸提取试剂盒为QIAampcador Pathogen Mini Kit(德国QIAGEN公司，货号：54104或54106)。

样本处理：取200μL样本，按QIAampcador Pathogen Mini Kit说明书进行核酸提取。按下表12所示用量，将内部质控与Carrier RNA一起添加至QIAampcador PathogenMini Kit的Buffer VXL中。

表12样本数量与内部质控以及Carrier RNA混合量汇总

样本在进行核酸提取前，必须加入内部质控，同时必须设置阴性对照，每次实验均需设置阴性对照，并同时与样本一起进行提取操作。

2、逆转录反应

2.1反应溶液配制

从试剂盒中取出反应液和逆转录引物，在冰上融化并振荡混匀后，离心10秒，冰盒上配制反应体系，测试反应体系配制如表13。计算反应数n[n＝样本数+阴性对照+阳性对照]。

表13第一步反应混合物

PCR反应管/板需置于冰上，配制完成后，充分混匀，按15μL/份分装到PCR反应管/板中，每份含6.25μL反应液以及8.75μL引物。

2.2加样

从试剂盒中取出阳性质控，在冰上融化并振荡混匀后，离心10秒。每个PCR反应孔中加10μL提取后的核酸样本(包括阴性对照和阳性质控)，加样后，盖上管盖或封上膜，立即振荡混匀，短暂离心后置于冰上。按照表14程序进行PCR反应。

表14第一步反应温度设置程序

3、荧光检测

3.1反应溶液配制

从试剂盒中取出缓冲液1和缓冲液2，在冰上融化并振荡混匀后，离心10秒；从试剂盒中取出反应酶，置于冰上。计算需准备反应数n[n＝样本数+阴性对照+阳性对照]。在冰盒上配制第二步反应体系，每测试反应体系配制如表15：

表15第二步反应体系

3.2加样

每份样本(包括阴性对照和阳性质控)按照以下操作：(1)取20μL反应体系1分装到PCR反应管1中；取20μL反应体系2分装到PCR反应管2中；⑴从PCR仪中取出第一步反应产物；⑶先放冰盒上冷却，短暂离心第一步反应产物，小心打开PCR管盖或封膜；⑷取5μL第一步反应产物，加入PCR反应管1，另取5μL第一步反应产物，加入PCR反应管2；(5)盖上管盖或封上膜，振荡混匀，短暂离心后放入

3.3软件设置

准备第二步反应体系前，按照表16设置荧光通道，按照表17设置PCR反应程序。

表16

表17第二步反应温度设置程序

3.4熔解曲线分析设置

程序运行结束后，软件中点击“Analysis”，选择“Tm calling”，点击“√”进行确定；而后，点击“Color Copm(off)”右侧的下拉按钮，点击“in Database”，选择颜色补偿时形成的“2SMART CC”文件，点击“√”，显示“Color Copm(on)”。

3.4.1质量控制

质量控制分析：点击“Filter Comb 465-510”，选择荧光通道(FAM(465-510)、ROX(465-610)或Cy5(465-660))，点击“Calculate”，根据下述要求分别分析FAM、ROX或Cy5通道。选择不同荧光通道后，均需点击“Calculate”。

⑴阴性对照NC：阴性对照的反应体系1与反应体系2的ROX和Cy5通道均不能出现病原体特异性峰，并且在FAM通道同时出现IC和AC负峰(如图2)，Tm值范围见表19，则本次实验有效。否则，需重复实验。

a.内部质控(IC):用于监控核酸的提取效率以及反应过程中是否存在PCR抑制剂。

b.扩增质控(AC):扩增质控AC1和AC2分别包含于MF缓冲液1和2中，用于监控第二步反应。同时，AC1和AC2的Tm值不同，可用于监控反应体系1或2的顺序是否出现错误。

表18 IC和AC的Tm值

⑵阳性质控PC:阳性质控PC按照下述A～D依次分析。在反应体系1和2的ROX和Cy5均能检测出对应的病原体，表明阳性对照成立；否则，阳性对照不成立，需重复实验。其判读指标如图3和表19:

表19阳性质控Tm值

⑶样本结果分析

在仪器正常，阴性对照和阳性对照均正常的情况下，针对每个样本，以阴性对照为背景，根据5.1-5.4逐步分析反应体系1和反应体系2的ROX和Cy5通道。

A.点击“Filter Comb 465-510”选择ROX(465-610)，点击“Calculate”，分析样本反应体系1的ROX通道。与阴性对照相比，如果存在特异性峰，根据其Tm值，参考表21判读病原体种类；如果无特异性峰，提示未检出表9中反应体系1的ROX通道对应的病原体。

B.点击“Filter Comb 465-510”，选择Cy5(465-660)，点击“Calculate”，分析样本反应体系1的Cy5通道。与阴性对照相比，如果存在特异性峰，根据其Tm值，参考表21判读病原体种类；如果无特异性峰，提示未检出表21中反应体系1的Cy5通道对应的病原体。

C.点击“Filter Comb 465-510”选择ROX(465-610)，点击“Calculate”分析样本反应体系2的ROX通道。与阴性对照相比，如果存在特异性峰，根据其Tm值，参考表9判读病原体种类；如果无特异性峰，提示未检出表21中反应体系2的ROX通道对应的病原体。

D.点击“Filter Comb 465-510”，选择Cy5(465-660)，点击“Calculate”，分析样本反应体系2的Cy5通道。与阴性对照相比，如果存在特异性峰，根据其Tm值，参考表9判读病原体种类；如果无特异性峰，提示未检出表20中反应体系2的Cy5通道对应的病原体。

表20 Tm值对应的病原体

实施例3

本实施例中对每种病原体的最低检出限进行确定、分组混合研究、阳性符合率、阴性符合率、精密度符合率和干扰物质等进行研究。

1、国家参考品验证

根据试剂盒说明书操作，按照34种细菌和真菌感染多重核酸检测试剂国家参考品说明书进行检验，检测结果符合国家参考品标准且与已知的病原体种类相符。同时，按照肠道病毒EV71型核酸检测试剂国家参考品的说明书进行检验，检测结果符合国家参考品标准且与已知的病原体种类相符。

2、最低检出限的确定

该产品共涉及18种中枢神经系统感染病原体，通过病原体的滴度或是浓度，先确定5-6个10倍稀释浓度，进行每种病原体的四重试验(每个浓度做四个重复测试)，筛选出满足100％阳性(4/4阳性)的最低浓度。以该最低浓度做20个重复测试，满足≥95％的阳性率，确定该检测浓度为对应病原体的最低检出限浓度。通过绝对定量，用伯乐公司的数字滴度PCR系统测定每种病原体的最低检出限的拷贝数。每种病原体的最低检出限见表21：

表21 18种病原体的单个病原体最低检出限浓度

3.分组混合研宄

经过不断地试验摸索，先将18种病原体对应的gBlocks分为五组进行混合。根据试剂盒说明书操作，对所有样本进行检测，检测结果与已知的病原体种类相符。而后在该研究的基础上，经过进一步试验摸索，最终确定将18种病原体培养物/核酸分为5组进行混合，分组信息如表中所示。

表22 18种病原体培养物/核酸分组

4.阳性符合率

以病原体培养物混合样本(阳性参考品PC1-PC5)研宄阳性符合率。分组和浓度如表中所示:

表23阳性参考品浓度

根据试剂盒说明书操作，对PC1-PC5进行检测，检测结果与已知的病原体种类相符。

5.阴性符合率

样本保存液中添加六种临床症状相似，取样部位相同的病原体培养物，名称为OC43病毒(病毒)、麻疹病毒(病毒)、博卡病毒(病毒)、肺炎支原体(细菌)、百日咳鲍特菌(细菌)、白色念珠菌(细菌)。上述三种病毒等体积混合后为阴性参考品NC1，三种细菌等体积混合后为阴性参考品NC2。稀释浓度参考病毒和细菌感染的医学相关水平，即细菌感染的水平为10

表24阴性参考品稀释度

根据试剂盒说明书操作，对NC1-NC2进行检测，检测结果均为阴性。

6.精密度

以病原体培养物混合样本(精密度参考品CV1-CV5)研宄精密度。分组和浓度如表所示

表25精密度参考品浓度

根据试剂盒说明书操作，对CV1-CV5进行检测，检测结果与已知的病原体种类相符，且其CV值≤5％。

7.干扰物质

三种干扰物质：内源物质为人类血液(1％，v/v)、人类基因组DNA(300ng)；外源物质为甘露醇注射液(25％v/v)。按每种干扰物所示的体积(因样本提取体积为200μL，则人类血液为2μL、人类基因组DNA为300ng、甘露醇注射液为50μL)添加到企业参考品进行提取，同时设置未添加上述干扰物质的企业参考品为对照，同时操作。

结果参见图4～图6:图4为人血液干扰结果，为左侧两图，左上图A为ROX通道，左下图B为CY5通道；对照为右侧两图，右上图C为ROX通道，右下图D为CY5通道。图5为人类DNA(300ng)干扰结果，为左侧两图，左上图A为ROX通道，左下图B为CY5通道；对照为右侧两图，右上图C为ROX通道，右下图D为CY5通道。图6为甘露醇注射液干扰结果，为左侧两图，左上图A为ROX通道，左下图B为CY5通道；对照为右侧两图，右上图C为ROX通道，右下图D为CY5通道。

上述结果表明，人血液(1％v/v)、人类DNA(300ng)和甘露醇注射液(25％v/v)对本试剂盒的检测结果无影响。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 上海捷诺生物科技有限公司

<120> 中枢神经系统感染病原体检测试剂盒及其应用

<130> BH2110273

<141> 2021-06-03

<150> 202010498327.1

<151> 2020-06-04

<160> 90

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcctgcgtgg ctgcc 15

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctgcgtggc ggcc 14

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtttgtatg atgttgatcc agact 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtccatgtc ttcaaaatga tg 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcagtggaaa tagaacatac gg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agagggcaaa gcctacaaaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agtaccagtt gccgtctgtg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaatggggca ttagccgtga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctccacggcg atacgcagtt 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cctacgatta tttcggcaag a 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccatttgct gggcttgatt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agaaagcgct tgacgacctt 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaagaccccg aggattcg 18

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccagtacaca attccgcaaa 20

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aagcgcttgc aactgctc 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cctaagacgc caatcgaa 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

catggggcgt ttgacctc 18

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tacacagtga tcgggatgct 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgtttggtgg tggcctttct 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgaatcaccg acacattcgc 20

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atgcattagc tcttgtcgag gaggcttctg 30

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgcatggaa tggctatgag ccgtcgatac 30

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caaacactag ttgtaaggc 19

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

taaaaaacgt ctagtgggcc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtaggctctg aattactaga 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

accgtgaaat caatagtatg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ctcagcaggc atgcaaaatc 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gcataggcag caatttcatt g 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aagccttggt ccaactctgg 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ctgccaaatc aactcgagca 20

<210> 31

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cccatttacg atttcctgca ccacctctct gc 32

<210> 32

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ttcagggacc gttatgtcat tgagcatgtc g 31

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

taacgtatta ctcgccccgc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cgtcgatgaa catcgttgcc 20

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

atcaagtgaa aaattcac 18

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

aactgaatat catcgatt 18

<210> 37

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gtggcagggc gctacaagtc agaggccttc agcaccagaa agattggaca gggtgcga 58

<210> 38

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (72)..(73)

<223> 含有简并碱基i

<400> 38

ggacgcgcca gcaagatcca atctagatag accagaagtg aacgcatctg cacctacaca 60

taataaaatt atggtgtgtc cggaggactc aaagtgagc 99

<210> 39

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gtggcagggc gctacgtaca agccgaacgc ttcatccagt cggtctaaca ctaccgcatt 60

atcaca 66

<210> 40

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ggacgcgcca gcaagatcca atctagaact agtagtcagg cacgcgtaag cccactcacg 60

caaggacgca aagaccgttc tatca 85

<210> 41

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cccagagacc ttgaccacaa ctttggaagt ttcctgattt tcctcattgg 50

<210> 42

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gcaggtgttg tggccaatgg tgttaaagct aaaggctatc gaacggtgac ataacaaggc 60

<210> 43

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (24)..(25)

<223> 第24和25之间含有简并碱基i

<220>

<221> misc_

<222> (33)..(34)

<223> 第33和34之间含有2个简并碱基ii

<220>

<221> misc_

<222> (34)..(35)

<223> 第34和35之间含有简并碱基i

<220>

<221> misc_

<222> (37)..(38)

<223> 第37和38之间含有简并碱基i

<400> 43

gtggcagggc gctacgtaca agcccgtgtg ctcttgatcc tccggaagat aagtttgaga 60

aaatcaacgg t 71

<210> 44

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (52)..(53)

<223> 含有3个简并碱基iii

<400> 44

ggacgcgcca gcaagatcca atctagatgt ccttgggtcc ctcttgggct ccgttaggat 60

tagccgcatt caggggttcc agcggtctga aagcat 96

<210> 45

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gtggcagggc gctacgtaca agggttagga agggaagaca ctataaagat acttggcgat 60

ggctacctca gaac 74

<210> 46

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ggacgcgcca gcaagatcca atctagaact aggagagtgg tcaggattgg cccattagct 60

ttaacatgat atccagcatc tttgcctacc gacaccagtt tctc 104

<210> 47

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (28)..(29)

<223> 含有简并碱基i

<400> 47

gtggcagggc gctacgtaca agggccccat cgccctcatc tatctggaac tctagtggct 60

g 61

<210> 48

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (83)..(84)

<223> 含有简并碱基i

<400> 48

ggacgcgcca gcaagatcca atctagacat tgcgtcaagt tgcttatcaa tgttgagcgt 60

aagatggacc agggcgaagt acgttcaaac ggcacttgtg gagttgtcac ttgat 115

<210> 49

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gtggcagggc gctacgtaca agctcttagc aaagtcaagt tgaatgatac actcgcatat 60

cccgtcgatc cagg 74

<210> 50

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

ggacgcgcca gcaagatcca atctagacat gcctaatggt ccgctggatg acagaagttg 60

atctttgttg cgatcaggcc catgttgtt 89

<210> 51

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (27)..(28)

<223> 含有简并碱基i

<400> 51

gtggcagggc gctacgtaca agtcattaca gaagatggag aaggcaaacc cgatgttctt 60

cctgtc 66

<210> 52

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

ggacgcgcca gcaagatcca atctagatag ctcgccatca cacgtctcgc tgttgaccat 60

ctcgacagtg taatttttct gctagttctg cttgcgttgt taacgttcga tttag 115

<210> 53

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (31)..(32)

<223> 含有简并碱基i

<400> 53

gtggcagggc gctacgtaca agtgcacagc ccaccgcgtg ggactccgcg tcgtcta 57

<210> 54

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (51)..(52)

<223> 含有简并碱基i

<220>

<221> misc_

<222> (55)..(56)

<223> 含有2个简并碱基ii

<400> 54

ggacgcgcca gcaagatcca atctagacca atcgcaatcg tggcgcaggt aacggtcgat 60

gacgccagcg aggggtctgc taaggc 86

<210> 55

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

caggatgtgt tagactacct tcattatcaa ttggtctgtg ccgtttgttg gcgata 56

<210> 56

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

gatgcaatat atgcgtattc atcaaactta atcactcaag gatgtgcctg accaggcgtt 60

ttaccga 67

<210> 57

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (29)..(30)

<223> 含有简并碱基i

<220>

<221> misc_

<222> (35)..(36)

<223> 含有简并碱基i

<220>

<221> misc_

<222> (37)..(38)

<223> 含有简并碱基i

<400> 57

gtggcagggc gctacgtaca aggagtgcac agccccacgc agttcgtaaa cgatcatccg 60

<210> 58

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (55)..(56)

<223> 含有简并碱基i

<220>

<221> misc_

<222> (57)..(58)

<223> 含有简并碱基i

<220>

<221> misc_

<222> (58)..(59)

<223> 含有2个简并碱基ii

<220>

<221> misc_

<222> (65)..(66)

<223> 含有简并碱基i

<400> 58

ggacgcgcca gcaagatcca atctagccca atcgcaatcg tggcgtgcgc aggtaacgtc 60

gatgagccca cagactcccg accctcag 88

<210> 59

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (39)..(40)

<223> 含有简并碱基i

<400> 59

gtggcagggc gctacgtaca agcttgaggc tctgatggat ggctgaaggt acccgtaggt 60

aacga 65

<210> 60

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (78)..(79)

<223> 含有简并碱基i

<400> 60

ggacgcgcca gcaagatcca atctagacac ggcaggtccg gtatcagttg cttcggtatc 60

agttgcttcg aggtgacaga ttggtcttgt ctttaccagg tcaccaagat agagg 115

<210> 61

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (29)..(30)

<223> 含有简并碱基i

<400> 61

acctaaacga atcttgtaat aggcacctac caattcgaca cttgccaggt tatcgc 56

<210> 62

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (64)..(65)

<223> 含有简并碱基i

<400> 62

cgcaatcatc caatctagat agaccagaag tgaacgcatc tgcacctaca cataataaaa 60

ttatggtgtg tgtcctgcct gcctgccaac t 91

<210> 63

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

ctattgcacc aggagtccca gctactgaaa gaacgctgtg agattgacg 49

<210> 64

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

gctaaggggt acttggtgtt aaagctaaag gctatctgca ttcggaatta gcctata 57

<210> 65

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

ccatctgttg gaccagggat atactacaaa tggcggtaag agtgattccc 50

<210> 66

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

ggcaaaataa tatttctcgg gtatggaggt cttgaacagt taggattagc cgcattcagg 60

ggctgtccat cctgtcgttt cc 82

<210> 67

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

ccatttacga tttcctgcac cacctctctg cttataacat aacctaccta atactacaac 60

cgtaa 65

<210> 68

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

ttcagggacc gttatgtcat tgagcatgtc gtctacatat atgtcaattg agcgtaagat 60

ggaccagggc gaagtacgcg tctaagatga aatggaggtg taaa 104

<210> 69

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

caggactatg aaaaccattt acctaagtga tggtatccac ccaacacggc tac 53

<210> 70

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

aatcaatcgc aaaagctgtc gctgttgacc atctcgacag tgtaattttt ctgctagttc 60

tgcttggtaa taaacatcgg cttgc 85

<210> 71

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

cgaaccttca actttaacag tcctatattc gacttacgaa cgaaggtgaa gctttcagag 60

<210> 72

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

tcaagcttac aattagcatc caatctagac caatcgcaat cgtcattcat gcgattaata 60

agacgtcgat attacgata 79

<210> 73

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

gtgtaggtgc agatg 15

<210> 74

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

ctgactacta gttcta 16

<210> 75

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

gatagccttt agcttta 17

<210> 76

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

cctgaatgcg gctaatc 17

<210> 77

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

atagccttta gctttaacac c 21

<210> 78

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

cgtacttcgc cctggtccat cttacgctca 30

<210> 79

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

aacttctgtc atcca 15

<210> 80

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

tgtcgagatg gtcaaca 17

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

tgcgattggt ctagattgga 20

<210> 82

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

atccttgagt gattaagttt gat 23

<210> 83

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

cgccacgatt gcgattgggc tagattgg 28

<210> 84

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

cctcgaagca actgataccg aagcaactga tac 33

<210> 85

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

gcaatgcaag gtctcct 17

<210> 86

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

ggaagatcaa tacataaag 19

<210> 87

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

gtggcagggc gctacgtaca agtttgaatg gccggcgtct attagctcct aaaagatgga 60

aacccg 66

<210> 88

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

ggacgcgcca gcaagatcca atctagaagc agcttctggg agaagaccac gcagcaaact 60

ccggcatcta gaatttgctg cgattgctga 90

<210> 89

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

tagatgccgg agtttgctgc gtggtc 26

<210> 90

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

gtggtcttcg cccagaagct gct 23