人类高风险性人畜共患型的猪链球菌特异性序列及检测引物和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及人类高风险性人畜共患型的猪链球菌特异性序列及检测引物和应用。

背景技术

猪链球菌是一种重要的人畜共患病原菌，感染人类能够引起脑膜炎、败血症和关节炎等，也能够感染猪，给养猪业严重的经济损失。猪链球菌通常引起人类散发性感染，而在中国引起了两次爆发，引起世界关注。耐药菌株的出现将给人类和动物的健康带来更大的威胁。自1968年丹麦报道第一例人感染猪链球菌病例(Perch et al.，1968)以来，全球共有34个国家发现了人猪链球菌感染的病例，包括欧洲、亚洲、北美洲、南美洲、澳大利亚以及新西兰等，其中亚洲最为严重(Goyette-Desjardins et al.，2014)(Ye et al.，2008)(Takeuchi et al.，2012)；Mai等人收集了越南南部的450余例细菌性脑膜炎病例，其中由于猪链球菌导致的病例多达151例，猪链球菌成为了该地区导致成人细菌性脑膜炎的主要病原菌(Mai et al.，2008)；Ma等人系统性的收集和分析了香港公立医院2003年1月-2005年7月的猪链球菌感染的病例，发现48％的病例出现脑膜炎，38％的病例出现败血症，14％的病例出现心内膜炎，5％的病例致死(Ma et al.，2008)。猪链球菌病不仅是危害全世界养猪产业的重要病原，同时也严重威胁了人类的身体健康和生命安全。

研究表明，几乎100％的猪场都检测为猪链球菌阳性(Segura et al.，2017)，其主要分布于猪的上呼吸道部位。猪场中猪链球菌的高阳性率(Segura et al 2017；Goyette-Desjardins et al 2014；Gottschalk et al 2010)势必导致猪肉制品的高携带率以及食品之间的相互污染，从而增加人感染猪链球菌的风险性。因此，研发区分人畜共患猪链球菌和非致病性猪链球菌的检测技术尤为重要。

在80年代-90年代，猪链球菌中共鉴定到了35种血清型(包括1型-34型，1/2型)(Okura et al.，2016)。最近的研究表明，血清型20型，22型，26型，32型，33型以及34型不属于猪链球菌(Tien le et al.，2013；Hill et al.，2005)。尽管血清型2型和14型被认为是感染人的主要的血清型，目前没有研究表明血清型与是否能够感染人类有极高的相关性(Goyette-Desjardins et al.，2014)。例如，有5例人感染的病例是由以下血清型引起，分别是血清型4型(Arends&Zanen，1988)，5型(Kerdsin et al.，2011)，16型(Hampson etal.，1993)，21型(Callejo et al.，2014)和24型(Kerdsin et al.，2011)；并且自2011年以来，柬埔寨，智利，法属圭亚那，波兰和韩国都是首次报告了人类猪链球菌感染病例(Goyette-Desjardins et al.，2014)。

全基因组测序分型技术，可在全基因组碱基序列的基础上进行流行病学分析，全面反应了病原菌的遗传与变异特征。相较于脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)，细菌多位点序列分型(MLST)和多位点可多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)等传统的分子分型方法，全基因组测序分型技术提高了菌株进化和溯源分析的分辨力，有助于快速地确认并追踪病原体。近年来，该技术在猪链球菌的流行病学、致病性以及进化等研究中得到了广泛的应用。Weinert等人对来自越南的191个猪链球菌进行了全基因组测序，并分析了人源菌株和猪源菌株的遗传差异性，结果并没有发现宿主特异性的关键因子(Weine rt，et al.2015)。虽然此研究的后续分析针对侵袭性的致病性猪链球菌设计了分子靶点，并只针对猪源的菌株进行了临床检测，但并不能说明该分子靶点能否应用于检测人类高风险性人畜共患型菌株(Wil eman et al.，2019)。Willemse等人也对荷兰的98株猪链球菌(其中人源分离菌株24株)进行了基因组测序并分析，虽然也找到了一些特异性存在于部分人畜共患组菌株中的相关的基因岛和前噬菌体，但是这些菌株遗传因子显然是不适合作为整个人畜共患病菌株的检测靶点(Willemse，et al.2016)，并且该研究的菌株的来源具有很大的地域局限性，也不适合用来鉴定针对普遍性人畜共患菌株的分子检测靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供了人类高风险性人畜共患型的猪链球菌特异性序列，所述序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了检测SEQ ID NO.1所示基因的试剂在制备人类高风险性人畜共患型的猪链球菌的检测试剂盒中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

人类高风险性人畜共患型的猪链球菌特异性序列的筛选，申请人通过目前已经公开的猪链球菌以及自己采集的猪链球菌全基因组序列进行分析，基于全基因多位点序列分型的方法构建系统发育树，该分型方法将这1634个菌株分成了三型，针对3个Clade中各自特有的基因进行了筛选，结果共筛选到35个组特异性基因，其中CladeA中25个，CladeB1中10个，在CladeB2中并没有发现组特异性基因，经过最终的PCR效果筛选，最终从CladeA中筛选出SEQ ID NO.1所示的特异性序列。

检测SEQ ID NO.1所示基因的试剂在制备人类高风险性人畜共患型的猪链球菌的检测试剂盒中的应用，包括以本领域的常规方式，检测目标猪链球菌DNA中是否含有测SEQID NO.1所示基因，从而可以判定该菌株是否属于人类高风险性人畜共患型的猪链球菌；

以上所述的应用中，优选的，所述的试剂为引物，所述的引物为：TGACAAGGTATTTGGGTGGGATG和AAGAAGGTCGTAGTTCTGGGAGC。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次公开了一种与人畜共患型的猪链球菌相关的靶标序列，利用本领域常规方案，以该序列为靶标，可大概率的鉴定出人畜共患型的猪链球菌，具有极大的应用前景。

附图说明

图1为无根树形式的拓扑结构展示3个不同的猪链球菌种群结构。

图2为使用不同Clade中的代表性菌株进行PCR扩增，验证分子靶点的可靠性。

图3为使用特异性序列引物对待测菌株扩增后的结果示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

人类高风险性人畜共患型的猪链球菌特异性序列的获得：

本实施例的序列比对样本为：

本申请用于基因组分析的菌株包括1634个，其中144个为申请人自采集并测序的猪链球菌菌株，包括猪链球菌人源分离菌株103株和病猪分离菌株41株；另外从NCBI数据库中下载已经公布的猪链球菌基因组数据1490个。所有的菌株以猪链球菌BM407为参考基因组，进行多序列比对，生成多序列比对文件用于系统发育学分析。与传统的分子分型方法相比，基于全基因多位点序列分型的方法构建的系统发育树具有更高的分辨率。该分析构建的进化树具有较为明显的3个分支(图1)，其中一支几乎包括了所有的人源菌株(96％，549/570)，我们定义为人类高风险组Clade A，其余两支分别为Clade B1和Clade B2，其中CladeB1中有69％(181/262)的菌株为病猪分离株，定义为病猪相关组，在所有的386株健康猪分离株中，有279株(72.2％)聚类在了Clade B2中，健康猪的比例达到了79％，定义为健康猪相关组。

申请人对差异性基因进一步进行筛选，定义分组特异性基因的条件为：目标基因存在于该组95％(包含)以上的的菌株中，并且在其他的分组中的比例均低于5％(包含)，针对3个Clade中各自特有的基因进行了筛选，结果共筛选到35个组特异性基因，其中CladeA中25个，CladeB1中10个，在CladeB2中并没有发现组特异性基因，经过最终的PCR效果筛选，最终从CladeA中筛选出25条待选序列，最后选出了2条特异性序列，本发明提供的其中一条为SEQ ID NO.1所示。

实施例2：

特异性序列在鉴定人畜共患型的猪链球菌中的应用：

本实施例通过PCR验证实施例1筛选出的特异性序列的准确性

针对实施例1获得的特异性序列设计的引物如下：

PCR条件：初始PCR采用25μL体系，其中DNA模板2μL，上下游引物各1μL，Mix 12.5μL，dd H

待测样本为：

使用24株来源于3个Clades的菌株进行基因组预测准确性的验证：

这24个代表性菌株分别为：第一组菌株：聚类在Clade A中的6株健康猪分离菌株(1024-1，1358，2283，2355，812，832)；第二组菌株：聚类在Clade A中2株病猪分离菌株和4株人源分离菌株(SC19，P1/7，CH52，CH61，CH53，LSM102)；第三组菌株：聚类在Clade B2中的6株健康猪分离菌株(1247，13，1783，1053，3096，1100)；第四组菌株：聚类在Clade B1中的6株病猪分离菌株(CPD1，CPD22，CPD23，CPD24，CPD26，CPD33)。

结果如图2所示，来源于CladeA的G20 Primer引物能够很好的检测到该组的12个菌株(其中包括6个健康猪菌株)；同时不能检测来自Clade B1和Clade B2的菌株。

实施例3：

特异性序列在鉴定人畜共患型的猪链球菌中的临床应用：

本实施例的检测样本如下，PCR条件和引物同实施例2：

本案例的猪链球菌检测样本共包括43株，其中21株人源猪链球菌为实验室最新分离的临床菌株。另外22株为南京农业大学已经发表的并已经使用动物模型进行了毒力验证的菌株，包括强毒力菌株12株(1株人源分离菌株，9株病猪分离菌株，2株健康猪分离菌株和弱毒力菌株10株(3株病猪分离菌株，7株健康猪分离菌株)(Qian et al.，2018；Yu et al.，2016)。

按照实施例2中的方法对上述菌株进行DNA的提取并利用G20 Primer进行PCR扩增。。

结果表明，该引物全部都能鉴定到21个人源分离菌株(图3中A)；同时也能够检测到12株强毒力菌株(图3中A)，但是不能检测10株低毒力的菌株(图3中B)。因此，该引物对人源分离菌株和强毒力菌株菌具有很好的鉴定效果。所有出现条带的阳性样品均能够在肉眼观察下看到显色反应，可见该方法能够很好应用于临床检测的过程当中。

序列表

<110> 武汉轻工大学

<120> 人类高风险性人畜共患型的猪链球菌特异性序列及检测引物和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1965

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgacaaggta tttgggtggg atgccaatac cgtatttagc tggttatttt tgattcttct 60

ttttattggc tcccttacaa cgatttggta tatagttgaa aataagacga taaaatcatt 120

gacaattggt ggcaaaaatg tttcatcaga gattgatatt ttttctgatc agtcgatgag 180

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tactaatcca caaagattta ttgactatat gaagtctacg aaggtggagt atcaagctcc 1740

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tgaagatttt acatcatttt tcaaaacaaa ccttaaggca atcaatctta aattcactca 1920

ttttagagag cctgatgatg atgctcccag aactacgacc ttctt 1965

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagaaggtcg tagttctggg agc 23