检测常见呼吸道病毒的引物组合及方法

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测常见15种 呼吸道病毒的引物组合及方法。

背景技术

呼吸道病毒，是指主要侵入呼吸道，在呼吸道粘膜上皮细胞增殖，引起呼 吸道局部感染或呼吸道以外组织器官病变的病毒，包括常见的流感病毒，人偏 肺病毒，合胞病毒，副流感病毒，冠状病毒等。据统计，临床上约90％～95％的 急性呼吸道感染由这类呼吸道病毒引起。

近年来新的致病性呼吸道病毒还在不断地被发现，如偏肺病毒、冠状病毒、 博卡病毒等，给人类的健康构成很大的威胁。急性呼吸道感染大多具有潜伏期 短、发病急、感染力强、传播快等特点，常可导致较高的发病率和死亡率，尤 其受到环境变化和生态平衡破坏的影响，病毒易发生各种变异，常突然暴发， 病情凶险，死亡率也较高。但是呼吸道病毒引起的感染症状往往比较相似，难 以靠临床症状及常规检测方法进行明确诊断。

目前检测呼吸道病毒通常采用的方法为荧光定量PCR等，这些方法都没办 法获得病毒的序列，如果病毒发生几个碱基的突变，可能会导致荧光信号消失 等漏检的情况。因此，迫切需要一种灵敏度更高、特异性更强、检测范围更广 的方法进行检测，从而可以很好地区分各种呼吸道病毒。

发明内容

基于此，本发明提供了一种检测常见呼吸道病毒的引物组合，所述引物组 合最多可以一次性地检测出常见的15种呼吸道病毒。

实现上述发明目的的具体技术方案如下：

一种检测常见呼吸道病毒的引物组合，所述引物组合包括针对流感A病毒 检测的引物对SEQ ID No.1～2、针对流感B病毒检测的引物对SEQ ID No.3～4、 针对人鼻病毒检测的引物对SEQ ID No.5～6、针对人偏肺病毒检测的引物对SEQ ID No.7～8、针对副流感病毒1型检测的引物对SEQ ID No.9～10、针对副流感病 毒2型检测的引物对SEQ ID No.11～12、针对副流感病毒3型检测的引物对SEQ ID No.13～14、针对副流感病毒4型检测的引物对SEQ ID No.15～16、针对OC43 型冠状病毒和229E型冠状病毒检测的引物对SEQ IDNo.17～18、针对HKU1型 冠状病毒和NL63型冠状病毒检测的引物对SEQ ID No.19～20，针对合胞病毒A 型和B型检测的引物对SEQ ID No.21～22、以及针对2019ncov新型冠状病毒检 测的引物对SEQ ID No.23～24中的两对或以上。

在其中一些实施例中，所述引物组合的工作浓度为10nM-10uM。

在其中一些实施例中，所述引物组合的工作浓度为100nM-10uM。

本发明的另一目的是提供一种常见呼吸道病毒的检测方法，该检测方法具 有灵敏度高、特异性强、通量高的特点。

实现上述发明目的的具体技术方案如下：

一种常见呼吸道病毒的检测方法，包括以下步骤：

(1)、将检测常见呼吸道病毒的12对引物中的两对或以上混合，制成混合引 物；所述混合引物的工作浓度为10nM-10uM；

所述12对引物分别为：针对流感A病毒检测的引物对SEQ ID No.1～2、针 对流感B病毒检测的引物对SEQ ID No.3～4、针对人鼻病毒检测的引物对SEQ ID No.5～6、针对人偏肺病毒检测的引物对SEQ ID No.7～8、针对副流感病毒1型检 测的引物对SEQ ID No.9～10、针对副流感病毒2型检测的引物对SEQ ID No.11～12、针对副流感病毒3型检测的引物对SEQ ID No.13～14、针对副流感病 毒4型检测的引物对SEQ ID No.15～16、针对OC43型冠状病毒和229E型冠状 病毒检测的引物对SEQ ID No.17～18、针对HKU1型冠状病毒和NL63型冠状病 毒检测的引物对SEQ ID No.19～20，针对合胞病毒A型和B型检测的引物对SEQ ID No.21～22、以及针对2019ncov新型冠状病毒检测的引物对SEQ ID No.23～24；

(2)、提取待检测样本中的RNA，逆转录为cDNA；

(3)、以步骤(2)的cDNA为模板，步骤(1)的混合引物为引物，进行第一次PCR 扩增反应；

(4)、回收第一次PCR扩增产物，纯化；

(5)、将步骤(4)纯化后的第一次PCR扩增产物，按不同的待检测样本接上不 同的Barcode序列，同时连上测序接头，再以此为模板，进行第二次PCR扩增 反应，纯化扩增产物；

(6)、将步骤(5)所有第二次PCR扩增反应产物混合，测序；鉴定待检测样本 中呼吸道病毒的种类。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述第一次PCR扩增反应的反应体系为： 30ul反应体系中，待检测样本cDNA 10～14ul、混合引物6～10ul、PCR酶8～12ul。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述第一次PCR扩增反应的反应条件为： 95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃延伸4min，25个循环；72℃延伸4min； 10℃保温。

在其中一些实施例中，步骤(4)中所述纯化，包括以下步骤：

a)向PCR扩增产物中加入0.4～0.6倍原始PCR反应体积的DNA纯化磁珠， 用移液器上下吹打10-15次，室温静置1～2分钟；

b)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止，取上清液；

c)向上清液中加入0.5～0.8倍原始PCR反应体积的DNA纯化磁珠，用移液 器上下吹打10-15次，室温静置1～2分钟；

d)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止，弃上清液。

在其中一些实施例中，步骤(5)中所述第二次PCR扩增反应的反应体系为： 30ul反应体系中，纯化后的第一次PCR扩增产物16～20ul，PCR酶8～10ul，2×PCR primerF 0.5～1.5ul、2×PCRBarcodeXX R 0.5～1.5ul，BarcodeXX是指不同的待检 测样本使用不同的barcode引物。

在其中一些实施例中，步骤(5)中所述第二次PCR扩增反应的反应条件为： 95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，6～8个循环； 72℃延伸5min，10℃保温。

在其中一些实施例中，步骤(5)中所述纯化，包括以下步骤：

a)向PCR扩增产物中加入0.8～1.2倍体积的DNA纯化磁珠，用移液器上下吹打 均匀后，室温静置1～2分钟；

b)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止，弃上清液；

c)向磁珠中加入35～45ul BW08，涡旋均匀，室温静置1～2min；

d)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止，弃上清液；

e)加入80～120ul 80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠，弃上 清液。

在其中一些实施例中，步骤(6)中所述鉴定采用的是生物信息学分析方法， 所述方法为：将原始fastq文件，采用bwa软件，与序列号如SEQ ID No.25～36 所示的各呼吸道病毒的扩增区域序列进行比对；再过滤比对正确率在90％以上 的reads数，计算比对上的相应病毒的reads数目。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的发明人通过比对、筛选15种常见呼吸道病毒种内的保守区域以及 种间特异的区域进行引物设计，筛选得到可以同时检测常见15种呼吸道病毒的 引物组合；采用该引物组合，基于多重PCR捕获方法，可以特异地捕获15种常 见呼吸道病毒特定区域核酸的特征序列；

本发明的检测方法是对捕获得到的待检测样本的序列进行高通量测序，并 结合生物信息学分析方法，与15种常见呼吸道病毒特定区域核酸的特征序列进 行比对，可以非常准确地判断待检测样本的序列是否与常见的15种病毒相匹配， 因此，本发明的检测方法具有准确性高，通量高等优势。

附图说明

图1是本发明检测常见呼吸道病毒的方法的流程图；

图2是部分引物之间相互作用的预测图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以 许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实 施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的 各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技 术

领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只 是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和 /或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。

在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除 非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代 相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方 案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易 地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。

此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语 “和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于 未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、 “一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中” 和“在......上”。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1常见呼吸道病毒的检测方法

请参考图1，是本实施例检测常见呼吸道病毒的方法的流程图，包括以下步 骤：

本实施例一共挑选了253个已知临床结果的咽试子样本进行测试，其中233 个为已知感染类型的样本，另外20为阴性对照样本(表1)。

表1测试的样本类型和个数

取各样本300ul痰液到新的1.5ml离心管中，加入300ul痰液消化液WT， 涡旋混匀后37℃孵育30min，消化期间每隔5-10min涡旋振荡，最终使痰液样 本匀质化。

采用普通商用RNA提取试剂盒(天根或凯杰)提取各样本的核酸。

(1)、取匀质化后的样本200ul到新的1.5ml离心管中，加入20μl蛋白酶K 溶液，混匀；

(2)、加入220μl缓冲液PB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清 亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；再加入220μl无水乙醇，充分颠倒混匀；

(3)、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)， 12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB放回收集管中；

(4)、向吸附柱CB中加入500μl缓冲液PD，12,000rpm离心30sec，倒掉 废液，将吸附柱CB放回收集管中；

(5)、向吸附柱CB中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉 废液，将吸附柱CB放回收集管中；

(6)、将吸附柱CB放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液；

(7)、将吸附柱CB置于室温敞口放置3分钟，以彻底晾干吸附材料中残余 的漂洗液；

(8)、将吸附柱CB转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴 加60μl洗脱液TE，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离 心管中；

(9)、将离心得到的溶液重新转移到吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm 离心2min回收核酸产物。

采用逆转录酶对提取的RNA进行逆转录成cDNA，为接下来的PCR反应做 准备。

通过生物信息学的方法预测引物之间的相互作用，来调整引物序列，从而 避免在引物之间形成二聚体，发夹结构等，保证引物扩增效率正常。图2是部 分引物之前相互作用的预测图；显示dimer_low表示这两对引物之间形成的二聚 体的能力比较弱，可以保证引物的扩增效率正常。

采用HPLC合成方法分别对表2所述12对引物进行纯化，合成2OD后各 加200ul TE进行溶解，将12对引物混合至一管中，成为混合引物Panel Mix。

表2常见呼吸道病毒的检测引物对

取步骤3的待检测样本核酸cDNA 12ul，步骤4的混合引物Panel Mix 8ul， PCR酶10ul，混合成30ul扩增体系，进行第一轮PCR扩增反应。

PCR扩增反应程序：95℃预变性3min；聚合酶链式反应扩增阶段：95℃变 性20s，60℃延伸4min，并进行25个循环；72℃延伸4min，10℃保温，完成扩 增。

第一轮PCR反应可以有效地富集目标区域片段，减少二聚体或者非特异扩 增的扩增产物。经过富集以后，核酸产物里面主要是目标病毒的序列，可以避 免大量的人源的核酸片段污染。再对获得的目标区域片段，采用Ampure XP磁 珠纯化试剂盒进行纯化，去掉小片段的二聚体，以及不在目标区域的非特异扩 增，提高有效的扩增片段比例。具体纯化步骤如下：

a)向PCR扩增产物中加入0.5倍原始PCR反应体积的DNA纯化磁珠；用 移液器50ul量程上下吹打10-15次，以使扩增产物与磁珠充分混匀，室温静置2 分钟；

b)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止；用移液器转移上清至新的EP管 中，避免吸到磁珠，弃磁珠；

c)向上清液中加入0.6倍原始PCR反应体积的DNA纯化磁珠；用移液器50ul 量程上下吹打10-15次，以使扩增产物与磁珠充分混匀，室温静置2分钟；

d)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止；用移液器小心去除上清，避免吸 到磁珠。

对目标区域回收产物进行第二轮PCR，不同的样本接上不同的序列标签(序 列便签之间只要有两个碱基的差异即可)，同时连上特定的测序接头，使得扩增 产物能够连接在测序芯片上。

反应体系如下：第一轮PCR回收产物18ul，PCR酶10ul，2×PCRprimer F 和2×PCRBarcodeXX R(不同的样品使用不同的barcode引物)各1ul。

PCR扩增反应程序：95℃预变性3min；聚合酶链式反应扩增阶段：95℃变 性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，并进行6～8个循环；72℃延伸5min， 10℃保温，完成扩增。

第二轮PCR反应获得的产物用Ampure XP磁珠纯化试剂盒进行纯化。纯化 后产物为构建好的文库，定量检测文库浓度，文库浓度大于1ng/ul后上机测序。 具体纯化方法如下：

a)向PCR扩增产物中加入0.9倍体积的DNA纯化磁珠，用移液器50ul量程上下 吹打，以使回收产物与磁珠充分混匀；室温静置2分钟。

b)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止；

c)用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠；

d)向磁珠中加入40ul BW08，涡旋均匀，室温静置2min；

e)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止，用移液器去除上清；

f)加入100ul 80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬 浮洗涤磁珠，用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。

不同的样本带有不同的标签序列，可以将不同的样本进行混合测序，这样 可以提高检测通量。一次上机可以48个样本或者96个样本同时进行检测。再 通过生物信息学分析，鉴定待检测样本里面病毒的种类。

测序数据先通过常规处理：现将原始的测序荧光信号bcl文件，转化成fastq 文件，同时将不同的样本按照barcode标签序列进行拆分；紧接着对fastq文件 进行数据质量过滤，去掉Q30比例小于90％的reads；然后将测序中的小于50bp 的reads以及测序错误，非特异扩增的reads去除；接着采用bwa软件，将过滤 后的reads与表3中的15种呼吸道病毒的模板序列进行比对，过滤掉比对质量 值小于15，比对正确率小于90％的read；然后统计每种病毒比对上的reads数目。

表3不同呼吸道病毒的扩增区域

表4为部分样本的质控结果，total pairreads是经过barcode拆分后，各个样 本拿到的总reads数目。high qualitypairreads(Q30)是过滤掉Q值小于Q30之后 剩下的reads；Adapter filter和dimmerreads表示过滤掉二聚体或者短reads的比 例。Nonspecific amplification是指过滤掉引物间非特异扩增的reads比例；Cleanpairreads表示经过低质量，二聚体，非特异以及一些其它不合格的过滤后剩下 的reads数目；

表4部分样本的质控结果

在经过层层过滤后，把剩下的reads往构建好的参考序列模板(表3)上比对， 过滤掉比对错配大于10％的reads，统计比对到参考模板的reads数目；表5是 部分样本各个病毒中比对到的reads数目。

表5部分样本各个病毒中比对到的reads数目

从表5可以看出202001190001样本为冠状病毒229E/NL63病毒感染，202001200001样本为阴性样本，202001200003样本为呼吸道合胞病毒A/B感染 样本，202001200004样本为流感病毒A感染样本，202002200004为新型冠状病 毒感染样本。这5个样本的检测结果与实际临床观察结果一致。

表6是本实施例中所有253个样本检测的吻合情况。

表6 253个样本检测吻合情况

综上，本实施例测试的已知阳性结果的233个样本中，有229个样本与检 测结果符合，灵敏性为98％。20个阴性对照样本，均为检测阴性，特异性为： 100％。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对 上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技 术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。

序列表

<110> 广东科蓝生物技术有限公司

<120> 检测常见呼吸道病毒的引物组合及方法

<130> 1

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caagaccaat tttgtcacct ctga 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacaaatcgt ctacgctgca gt 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcaccagga ggaccctaca 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaacagccca agccattgt 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtcctccgg cccctgaat 19

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacacggac acccaaagta gt 22

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgacagtca aaatgattat gagtaatt 28

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgctgcttca ttacccatga a 21

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttaaatgacg atagcttcaa catatctta 29

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttttgctagc aatgtttctg ctaa 24

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caagggaggt attgaaggcc t 21

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tctaggaact cttgttgtaa ctgcaa 26

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aatagagagt tgatggaaag cga 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gggtcggtgc tgagtatgaa tt 22

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aagttggtgg gttaaattat ctatca 26

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggtggtcgtc tcatgatatt tgt 23

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gttctgaata tgattatgtt atatattcac a 31

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cttcaaacaa ctgcatatta ctcataac 28

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgcaatggca ataagattga aga 23

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cactcaaaat catcatacta aaatgct 27

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

caacaacatt cattggtctt atttacata 29

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aacagtactt gcactttctt acatgctt 28

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cctgatggct accctcttga gt 22

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

agaacgttcc gtgtaccaag 20

<210> 25

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggctaaagac aagaccaatt ttgtcacctc tgactaaagg gattttagga tttgtgttca 60

cgctcaccgt gcccagtgag cggggactgc agcgtagacg atttgtccaa aatgccc 117

<210> 26

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgcagaaaaa gcaccaggag gaccctacag acttggaacc tcaggatctt gccctaacgc 60

taccagtaaa agcggatttt tcgcaacaat ggcttgggct gttccaaaag acaa 114

<210> 27

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ctcactttga gtcctccggc ccctgaatgt ggctaacctt aaccctgcag ctagtgcata 60

caaaccagta tgttgctagt cgtaacgagc aattgcggga tgggaccaac tactttgggt 120

gtccgtgttt cactttttac 140

<210> 28

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atgtgagtga cgacagtcaa aatgattatg agtaattaaa aaagtgggac aagtcaaaat 60

gtcattccct gaaggaaagg atattctttt catgggtaat gaagcagcaa aattggcag 119

<210> 29

<211> 151

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ggagaatggt taaatgacga tagcttcaac atatcttaca gtctcaaaga aaaagaaatt 60

aaacaagagg ggcgactctt tgccaagatg acatacaaga tgagagcagt ccaggtgtta 120

gcagaaacat tgctagcaaa aggagtaggt g 151

<210> 30

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tctcccaagg gaggtattga aggcctatgt cagaaaatgt ggacaatgat ctctatttct 60

gtgatcatcc tctcttcagc cgaatccaaa acaagagtaa tgagcatggt tcaaggagat 120

aatcaggcga ttgcagttac aacaagagtt cctagatcat tacct 165

<210> 31

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aactcaatca atagagagtt gatggaaagc gatgctaaaa actatcaaat catggattct 60

tgggaagagg aatcaagaga taaatcaact aatatctcct cggccctcaa catcattgaa 120

ttcatactca gcaccgaccc ccaagaagac 150

<210> 32

<211> 171

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

atcccgtctc aagttggtgg gttaaattat ctatcatcta gtcgattatt caatagaaac 60

ataggtgacc cactagtgtc tgcatttgca gatattaaaa gattaataat ggctaaatgt 120

attgagcctt gggtattgac aaatatcatg agacgaccac ctggagatgg a 171

<210> 33

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ctgctcaagg ttctgaatat gattatgtta tatattcaca gactgcagaa acagcgcatt 60

ctgtaaatgt taatcgcttc aatgttgcta ttactcgagc caagaaaggt attctttgtg 120

ttatgagtaa tatgcagttg tttgaagcat tacagttt 158

<210> 34

<211> 171

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ttaatgtcat gcaatggcaa taagattgaa gatcttagta tacgtgctct tcagaagcgc 60

ttatactcac atgtgtatag aagtgataag gttgattcaa cctttgtcac agaatattat 120

gaatttttaa ataagcattt tagtatgatg attttgagtg atgatggggt t 171

<210> 35

<211> 166

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

cagatgcaac caacaacatt cattggtctt atttacatat aaagtttgct gaacctatca 60

gtctttttgt ctgtgatgcc gaattgtctg taacagtcaa ctggagtaaa attataatag 120

aatggagcaa gcatgtaaga aagtgcaagt actgttcctc agttaa 166

<210> 36

<211> 179

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ttctgtggcc ctgatggcta ccctcttgag tgcattaaag accttctagc acgtgctggt 60

aaagcttcat gcactttgtc cgaacaactg gactttattg acactaagag gggtgtatac 120

tgctgccgtg aacatgagca tgaaattgct tggtacacgg aacgttctga aaagagcta 179