公开/公告号CN113186269A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-07-30
原文格式PDF
申请/专利权人 宁夏医科大学;
申请/专利号CN202110373870.3
申请日2021-04-07
分类号C12Q1/6883(20180101);G01N33/68(20060101);G01N33/52(20060101);
代理机构11616 北京盛凡智荣知识产权代理有限公司;
代理人李丽君
地址 750001 宁夏回族自治区银川市兴庆区胜利街1160号
入库时间 2023-06-19 12:04:09
技术领域
本发明涉及生物医学实验技术领域，尤其涉及铁死亡参与小鼠动脉粥硬化及泡沫细胞形成过程的研究方法。
背景技术
动脉粥样硬化(AS)是一种脂质驱动的动脉内膜炎症性疾病，是多种心血管疾病的病理基础。铁死亡是一种铁依赖的氧化性细胞死亡，其特征是细胞内铁的增加和抗氧化能力的降低导致过氧化脂质的致死性积累，铁死亡已被证明对多种疾病具有重要意义。脂质过氧化、斑块内出血和铁沉积是晚期人类AS斑块的特征，这是AS中铁死亡发生的间接证据。虽然已有研究证实抑制铁死亡可以减轻小鼠主动脉内皮细胞的脂质过氧化和动脉粥样硬化。动脉内膜中巨噬细胞源性泡沫细胞的形成是早期动脉粥样硬化病变的主要标志，且在AS发生发展的各个阶段都起着重要作用。但是目前就动脉粥样硬化的形成过程中，是否有铁死亡现象发生的研究还未见报道，而探究铁死亡与AS的关系，对于AS的机制研究与防治具有重要意义。
发明内容
因此，本发明提供了铁死亡参与小鼠动脉粥硬化及泡沫细胞形成过程的研究方法，其通过对小鼠动脉粥样硬化过程中及泡沫细胞形成过程铁死亡情况进行实验研究，为AS的机制研究与防治提供科学的参考依据。
本发明的技术方案为：
铁死亡参与小鼠动脉粥硬化及泡沫细胞形成过程的研究方法，其包括如下步骤：
1)选用6-8周龄的雄性ApoE
2)将RAW264.7巨噬细胞使用培养基进行培养，将处于对数生长期的RAW264.7巨噬细胞随机分为Control组和Ox-LDL组，Control组采用正常培养基正常培养，Ox-LDL组采用加入有ox-LDL的培养基诱导培养，两组均诱导培养24h；
3)16周后，采集步骤1)小鼠的血清样，对血清中的TG、TC、LDL-C和HDL-C的含量进行检测；然后将小鼠进行处死；
4)对步骤3)小鼠主动脉根部斑块及脂质沉积采用H&E和油红O染色并进行观察；
5)采用qRT-PCR对步骤2)诱导培养RAW264.7巨噬细胞和步骤3)的小鼠主动脉组织中p53、GPX4和SLC7A11mRNA表达水平进行检测；
6)采用WesternBlot法对步骤2)诱导培养RAW264.7巨噬细胞和步骤3)的小鼠主动脉组织的p53、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平进行检测；
7)采用DCFH-DA荧光探针对步骤2)诱导培养的RAW264.7巨噬细胞内的过氧化标志物ROS水平进行检测，采用比色法对细胞内的GSH、MDA和Fe
9)采用SPSS23.0软件分析数据对检测数据进行分析。
进一步地，步骤1)中模型组采用含有1.25wt％胆固醇的高脂饲料进行饲养。
进一步地，步骤2)中Control组采用的正常培养基为包含有10wt％胎牛血清、1wt％双抗的DMEM高糖培养基；Ox-LDL组的培养基为包含有10wt％胎牛血清、1wt％双抗、50mg/L的ox-LDL的DMEM高糖培养基；Control组和Ox-LDL组的RAW264.7巨噬细胞采用37℃、5％CO
进一步地，步骤4)的操作方法为：
H&E染色：多聚甲醛固定步骤3)小鼠主动脉组织切片，流水清洗后苏木素染色，1％盐酸乙醇分化后流水冲洗返蓝，随后伊红染色，梯度脱水透明后封片，光镜下观察；
油红O染色：多聚甲醛固定步骤3)小鼠主动脉组织切片，60％异丙醇浸洗，油红O染色，苏木素复染，流水冲洗返蓝，1％盐酸乙醇分化，封片后在光镜下观察。
进一步地，步骤5)的操作方法为：
取步骤3)小鼠主动脉组织或步骤2)诱导培养的RAW264.7巨噬细胞，提取总RNA，测定浓度后进行反转录，加入扩增反应体系运用qRT-PCR法扩增，然后采用2
进一步地，步骤6)的操作方法为：
取步骤3)小鼠主动脉组织或步骤2)诱导培养的RAW264.7巨噬细胞，使用提取蛋白，制备蛋白样品；制备蛋白样品后进行SDS-PAGE电泳，采用湿转法转印至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭2h，洗膜后一抗4℃孵育过夜；二抗室温孵育2h，加入ECL发光底物显色后，使用凝胶成像仪成像；以目的蛋白与β-actin蛋白光密度的比值反映目的蛋白的相对表达水平。
采用上述技术方案，具有的有益效果如下：
本发明通过科学的，全面的实验过程，对小鼠动脉粥样硬化形成过程及泡沫细胞形成过程是否存有铁死亡现象进行研究，可对动脉粥样硬化的形成与铁死亡现象的关系进行研究，以此可为AS的机制研究与防治提供科学的实验依据与新的思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的实施例小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的含量对比图。
图2为本发明的实施例小鼠主动脉根部横切面H&E和油红O染色(20×)；其中A为对照组和模型组小鼠主动脉根部HE染色，B为两组油红O染色，C为两组油红O阳性面积/主动脉根部总面积分析结果。
图3为本发明小鼠主动脉组织中死亡相关基因的mRNA表达；其中A为对照组与模型组的铁死亡相关基因p53的mRNA表达水平，B为GPX4的mRNA表达水平，C为SLC7A11的mRNA表达水平。
图4为本发明实施例对照组和模型组中铁死亡相关基因的蛋白表达；其中A为对照组与模型组的铁死亡相关基因(p53、GPX4和SLC7A11)的蛋白表达，B为蛋白条带的统计图。
图5为本发明实施例中RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型(20×)；其中A为RAW264.7巨噬细胞，B为ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞的油红O染色；
图6为本发明实施例中Control组和Ox-LDL组中铁死亡相关基因的mRNA表达；其中A为Control组与Ox-LDL组的铁死亡相关基因p53的mRNA表达水平，B为GPX4的mRNA表达水平，C为SLC7A11的mRNA表达水平。
图7为本发明实施例中Control组和Ox-LDL组中铁死亡相关基因的蛋白表达；其中A为Control组与Ox-LDL组的铁死亡相关基因(p53、GPX4和SLC7A11)的蛋白表达，B为蛋白条带的统计图。
图8为本发明实施例中ox-LDL诱导的泡沫细胞中ROS、MDA、GSH和Fe2+表达水平的影响；其中A为Control组与Ox-LDL组细胞内ROS的平均荧光强度，B为细胞内丙二醛(MDA)水平，C为细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)水平，D为细胞内游离铁(Fe2+)水平。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所用未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例：本实例提供了铁死亡参与小鼠动脉粥硬化及泡沫细胞形成过程的研究方法，
(1)具体步骤如下：
1)选用12只6-8周龄的雄性ApoE
2)将RAW264.7巨噬细胞使用培养基在37℃、5％CO
3)16周后，采集步骤1)小鼠的血清样，采用全自动生化分析仪对血清中的TG、TC、LDL-C和HDL-C的含量进行检测；
然后将小鼠进行处死；
4)对步骤3)小鼠主动脉根部斑块及脂质沉积采用H&E和油红O染色并进行观察；
具体的操作方法为：
H&E染色：多聚甲醛固定步骤3)小鼠主动脉组织切片，流水清洗后苏木素染色，1％盐酸乙醇分化后流水冲洗返蓝，随后伊红染色，梯度脱水透明后封片，光镜下观察；
油红O染色：多聚甲醛固定步骤3)小鼠主动脉组织切片，60％异丙醇浸洗，油红O染色，苏木素复染，流水冲洗返蓝，1％盐酸乙醇分化，封片后在光镜下观察。
5)采用qRT-PCR对步骤2)诱导培养RAW264.7巨噬细胞和步骤3)的小鼠主动脉组织中p53、GPX4和SLC7A11mRNA表达水平进行检测；
具体的操作方法为：
取步骤3)小鼠主动脉组织或步骤2)诱导培养的RAW264.7巨噬细胞，提取总RNA，测定浓度后进行反转录，加入扩增反应体系运用qRT-PCR法扩增，扩增引物序列见表1，然后采用2
表1：引物序列表
6)采用WesternBlot法对步骤2)诱导培养RAW264.7巨噬细胞和步骤3)的小鼠主动脉组织的p53、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平进行检测；
具体的操作方法为：
取步骤3)小鼠主动脉组织或步骤2)诱导培养的RAW264.7巨噬细胞，使用提取蛋白，制备蛋白样品；制备蛋白样品后进行SDS-PAGE电泳，采用湿转法转印至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭2h，洗膜后一抗4℃孵育过夜；二抗室温孵育2h，加入ECL发光底物显色后，使用凝胶成像仪成像；以目的蛋白与β-actin蛋白光密度的比值反映目的蛋白的相对表达水平。
7)采用DCFH-DA荧光探针对步骤2)诱导培养的RAW264.7巨噬细胞内的过氧化标志物ROS水平进行检测，采用比色法对细胞内的GSH、MDA和Fe
9)采用SPSS23.0软件分析数据对检测数据进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。
上述实验过程中ApoE
RAW264.7巨噬细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；
H&E染色试剂盒(碧云天，中国)；油红O检测试剂盒(索莱宝，北京)；RNA提取试剂盒(天根，中国)；反转录和荧光定量PCR试剂盒(赛默飞，美国)；荧光定量PCR仪(枫岭国际，上海)；谷胱甘肽检测试剂盒(南京建成，中国)；丙二醛(MDA)检测试剂盒(贝博，中国)；铁离子比色法检测试剂盒(普利莱，北京)；蛋白提取试剂盒(凯基，南京)；p53、GPX4和SLC7A11抗体(abcam，美国)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(博奥森，北京)；DMEM培养基和胎牛血清(Gibco，美国)；电泳仪及凝胶成像系统(Rio-Rad，美国)。
(2)实验结果
1)高脂饮食诱导ApoE
血脂胆固醇水平检测结果显示，与对照组相比，模型组小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平显著升高(P＜0.01)，HDL-C无明显差异(P＞0.05)，具体结果见图1，图1中的模型组与对照组相比，**P＜0.01；H&E和油红O染色结果显示，与对照组相比，模型组小鼠主动脉根部可见内膜增厚，管腔明显狭窄，有明显粥样斑块形成，可见大量脂滴沉积，油红O阳性面积占比较大(P＜0.01)，见图2，图2中的模型组与对照组相比，**P＜0.01。这些数据表明ApoE
2)ApoE
采用qRT-PCR及WesternBlot分别检测主动脉组织中铁死亡相关基因表达情况，结果显示，与对照组相比较，模型组p53的mRNA表达明显上升(P＜0.01)，GPX4和SLC7A11的mRNA表达呈降低趋势(P＜0.01，P＜0.05)，见图3。蛋白表达与上述mRNA表达改变相一致(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)，见图4。由此综合可以看出高脂饮食诱导的ApoE
3)RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立
选择大小均一，生长状态良好的RAW264.7巨噬细胞，用含50mg/L的ox-LDL刺激后通过油红O观察，胞浆中有红色脂滴，由此泡沫细胞模型建立成功，见图5。
4)ox-LDL诱导的泡沫细胞中铁死亡现象
为了进一步明确铁死亡在泡沫细胞中的作用，采用qRT-PCR及WesternBlot分别检测两组细胞中铁死亡相关基的表达情况。与Control组相比，Ox-LDL组GPX4和SLC7A11mRNA表达水平显著降低(P＜0.01，P＜0.001)，而p53mRNA表达水平明显升高(P＜0.01)，见图6。随后检测了p53、GPX4和SLC7A11蛋白表达，与Control组相比，Ox-LDL组p53蛋白表达升高(P＜0.001)，GPX4和SLC7A11表达水平降低(P＜0.01，P＜0.01)，结果说明ox-LDL诱导的泡沫细胞有铁死亡发生，见图7。
5)ox-LDL诱导的泡沫细胞中脂质过氧化物和铁含量增加
观察两组细胞内脂质过氧化物、GSH和铁离子水平变化，结果显示，与Control组相比，Ox-LDL组细胞ROS、MDA表达水平明显增高(P<0.01，P<0.001)，而GSH含量显著降低(P<0.01)，Fe2+含量升高(P<0.05)，见图8，Ox-LDL组与Control组相比,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。
随着AS的发生发展，泡沫细胞逐渐在动脉内膜中堆积形成脂质斑块，当动脉壁中的脂质斑块发生破裂，继发血栓形成，导致各种急慢性心血管疾病事件及其他并发症发生。随着AS的发生发展，泡沫细胞逐渐在动脉内膜中堆积形成脂质斑块，当动脉壁中的脂质斑块发生破裂，继发血栓形成，导致各种急慢性心血管疾病事件及其他并发症发生。巨噬细胞/泡沫细胞死亡是晚期斑块的突出特征，也是导致坏死核心形成和斑块不稳定的主要因素。脂质过氧化是导致AS的关键危险因素。铁累积和脂质过氧化是铁死亡发生的重要机制，也是AS发病的重要危险因素。因此探究铁死亡与AS的关系，对于AS的机制研究与防治具有重要意义。
本发明的实施例中，与对照组相比较，采用高脂饮食诱导建立的ApoE
而本实施例中使用ox-LDL处理后的巨噬细胞源性泡沫细胞模型中，Westernblot及qRT-PCR检测到泡沫细胞中p53表达水平增加，SLC7A11和GPX4的表达水平降低，并且细胞损伤和脂质过氧化作用加重，表现为ROS、MDA的生成增加，抗氧化剂GSH的减少，细胞内的铁离子水平也有所升高。结果提示ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞来源泡沫细胞中有铁死亡发生。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，上述实施例中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
机译： 通过从动脉粥样硬化斑块中去除衰老的泡沫细胞巨噬细胞来治疗动脉粥样硬化
机译： 通过去除动脉粥样硬化斑块中的泡沫细胞巨噬细胞来治疗动脉粥样硬化
机译： 用于预防或治疗血管疾病的药物组合物，其含有桑树茎提取物，具有防止动脉粥样硬化军团形成和泡沫细胞形成的活性
